Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées

L’importance de cette méthode est qu’elle permet à des microtubules sans étiquette d’être imagés simultanément avec des protéines marquées par fluorescence à des fréquences d’images élevées. Le principal avantage de cette technique est sa facilité de mise en œuvre et les exigences minimales sur les composants optiques. Il contourne également la nécessité d’un marquage fluoro-4 des microtubules.

Pour commencer, préparez le polymère PDMS en combinant l’agent de durcissement et l’élastomère de base dans un rapport massique de 1:10. Mélangez-les pendant deux minutes, puis dégazez le mélange dans une chambre à vide jusqu’à ce que toutes les bulles disparaissent. Ensuite, versez le mélange sur le moule principal en une couche d’environ 0,5 centimètre d’épaisseur, en prenant soin d’éviter de créer des bulles, et faites cuire le mélange dans un four préchauffé à 70 degrés Celsius pendant 40 minutes.

Ensuite, découpez les régions structurées du polymère et percez les trous à chaque extrémité du canal à l’aide d’un perforateur PDMS. Plus tard, nettoyez le côté structuré du bloc PDMS. Par la suite, rincer trois fois avec de l’isopropanol et du méthanol suivis d’eau ultrapure et sécher la surface.

Ensuite, nettoyez le PDMS au plasma à l’aide d’oxygène ou de plasma d’air et placez le PDMS nettoyé au plasma sur un verre de couverture correctement nettoyé. Chauffez-le sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes. Insérez un tube en polyéthylène basse densité de taille appropriée dans les trous et connectez le tube de sortie à une seringue de 0,5 millilitre.

Ensuite, faites couler les solutions dans les microcanaux en immergeant le tube d’entrée dans la solution et en tirant le volume requis avec la seringue. Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et allumez la source lumineuse d’épi-éclairage pour l’imagerie IRM. Pour focaliser le microscope, recherchez le plan focal correct près de l’interface de la solution PDMS et choisissez un champ de vision près du centre du canal.

Ensuite, préparez une solution 0,1-micromolaire de microbilles fluorescentes dans BRB80 et faites circuler au moins un volume de canal de la solution de microbilles. Surveillez la réaction via IRM ou TIRF. Lorsque la densité souhaitée de microbilles est atteinte, lavez l’excès avec BRB80.

Faire circuler les graines diluées dans la chambre de réaction et surveiller la réaction par IRM. Lorsque la densité de graines souhaitée est atteinte, lavez l’excès avec BRB80. Ensuite, préparez un mélange d’extension de microtubule contenant de la tubuline non marquée de 12 micromolaires, du GTP d’un millimolaire et de la TNT de cinq millimolaires dans un tampon BRB80.

Ensuite, faites circuler au moins un volume de canal du mélange d’extension tout en vous assurant que la température de réaction est de 28 degrés Celsius. Pour commencer, définissez les paramètres d’imagerie sur le logiciel du microscope. Commencez l’imagerie et faites circuler la solution de kinésine dans la chambre.

Ensuite, visualisez les microtubules de kinésine 1 marqués GFP. Une fois la mesure terminée, enregistrez une courte vidéo dans laquelle la scène est lentement traduite en un mouvement circulaire ou latéral. La projection médiane de cette vidéo servira d’image d’arrière-plan et sera soustraite des mesures brutes.

Créez une projection médiane dans ImageJ à partir de l’enregistrement d’arrière-plan en cliquant sur Image. Ensuite, sélectionnez l’option Piles et cliquez sur Z Project. Ensuite, soustrayez la projection d’arrière-plan médiane des données d’image brutes en cliquant sur Processus, puis sélectionnez l’option Calculatrice d’image tout en vous assurant de cocher l’option de résultat flottant 32 bits.

Pour l’enregistrement des images, choisissez une collection de microbilles près du microtubule d’intérêt et utilisez-les pour aligner les images TIRF et IRM. Pour chaque perle de cette collection, utilisez l’outil de sélection multipoint pour marquer l’emplacement approximatif dans le canal TIRF, puis l’emplacement correspondant dans le canal IRM. Ensuite, exécutez la macro ImageJ fournie.

Les microbilles apparaissent sous forme de taches sombres dans le canal IRM à droite et de points lumineux dans le canal TIRF à gauche. La procédure d’alignement superpose correctement les deux canaux en localisant une sélection de perles. Un kymographe de molécules de kinésine marquées par l’EGFP marchant vers les extrémités rétrécissantes des microtubules a également été obtenu à l’aide de ce protocole.

Lors de cette procédure, il est important de choisir des objectifs à ouverture numérique élevée afin d’obtenir une réflexion interne totale et de maximiser l’efficacité de la collection et le contraste de l’image. Cette méthode peut être utilisée pour l’imagerie à haute résolution de molécules fluorescentes uniques simultanément dans la structure macromoléculaire suffisamment massive pour être visualisée par IRM, comme la membrane cellulaire ou le filament d’actine. Ce protocole fournit également une procédure facilement adaptable pour l’imagerie simultanée avec n’importe quelle combinaison d’IRM, de TIRF et d’épifluorescence.