Name: Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 43 s
Description: Découvrez une méthode de microscopie IRM et TIRF pour imager simultanément les microtubules et les protéines fluorescentes. Cette technique permet une visualisation haute résolution des dynamiques cellulaires sans marquage complexe.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions le laboratoire de Thierry Emonet d’avoir partagé les équipements des salles blanches. Nous remercions Yin-Wei Kuo d’avoir préparé l’eGFP-kinésine purifiée utilisée dans cette étude. Y.T. reconnaît le soutien de la Fondation Alexander von Humboldt par le biais de la bourse de recherche Feodor Lynen. Ce travail a été soutenu par NIH Grant R01 GM139337 (à J.H.).

1. Préparation des chambres d’écoulement
REMARQUE: Les chambres d’écoulement microfluidiques seront construites en adhérant des microcanaux de polydiméthylsiloxane (PDMS) à un verre de couverture nettoyé et fonctionnalisé. Les microcanaux seront coulés dans un moule maître.
<ol><li>
Préparation des canaux PDMS
	<ol>
<li>Préparer des verres de couverture nettoyés et/ou fonctionnalisés avec une chimie de surface appropriée au test spécifique imagé. REMARQUE: Pour les tests de motilité de kinésine, des verres de couverture silanisés nettoyés au piranha sont utilisés. Ceux-ci sont préparés comme décrit dans Gell et. al.1 Alternativement, une procédure plus simple consiste à sonicer les verres de couverture en isopropanol suivis de méthanol pendant 3 cycles de 20 minutes.</li>
		<li>Pour préparer un moule maître, coupez des bandes de ruban adhésif fixe simple face à la taille de canal d’écoulement souhaitée. Collez les bandes au fond d’une boîte de Petri de 10 cm, en les disposant d’un côté à l’autre avec un espacement d’au moins 1 cm entre les bandes. REMARQUE: Si des dimensions de canal précises sont requises, le moule peut être fabriqué sur des plaquettes de silicium en utilisant la photolithographie14.</li>
		<li>Pour préparer le polymère PDMS, combinez l’agent de durcissement et l’élastomère de base dans un rapport massique de 1:10. Mélanger pendant 2 min. REMARQUE: Ce rapport de mélange peut être modifié pour ajuster la rigidité du polymère. Un rapport plus élevé de la base à l’agent de durcissement donne un polymère plus doux.</li>
		<li>Dégazez le mélange dans une chambre à vide jusqu’à ce que toutes les bulles disparaissent.</li>
		<li>Versez le mélange sur le moule principal en une couche d’environ 0,5 cm d’épaisseur, en prenant soin d’éviter de créer des bulles.</li>
		<li>Cuire le mélange dans un four préchauffé à 70 °C pendant 40 min. REMARQUE: Un temps de durcissement plus long peut être nécessaire si le bloc PDMS est épais (>1 cm). Continuez à chauffer par incréments de 5 minutes jusqu’à ce qu’il soit complètement durci.</li>
		<li>Découpez les régions structurées du polymère. Percez des trous à chaque extrémité du canal à l’aide d’un perforateur PDMS. REMARQUE: Dans ce protocole, le diamètre du trou est réglé sur 0,75 mm et peut être ajusté en fonction des débits requis. Les canaux PDMS peuvent être stockés dans des environnements secs pendant de longues périodes, mais doivent être nettoyés avant utilisation.</li>
		<li>Nettoyez le côté structuré du bloc PDMS. Utilisez du ruban adhésif fixe pour éliminer les grosses particules. Rincer à l’isopropanol puis au méthanol. Répétez ces rinçages 3x, rincez à l’eau ultrapure et séchez la surface.</li>
		<li>Plasma nettoyer le PDMS en utilisant de l’oxygène ou du plasma d’air. REMARQUE: Dans ce protocole, le plasma d’air de 18 W est utilisé.</li>
		<li>Placez le PDMS nettoyé au plasma sur un verre de couverture correctement nettoyé et chauffez sur une plaque chauffante à 80 °C pendant 15 min. REMARQUE: La résine époxy peut être appliquée sur les côtés du bloc PDMS pour mieux l’adhérer au verre de couverture.</li>
		<li>Insérez des tubes en polyéthylène basse densité (PEBD) de taille appropriée dans les trous. Connectez le tuyau de sortie à une seringue de 0,5 mL. REMARQUE: Dans ce protocole, les tubes d’un diamètre intérieur de 0,023 po sont connectés au PDMS via un adaptateur métallique de 0,025 po de diamètre extérieur.</li>
		<li>Faites circuler les solutions dans les microcanaux en immergeant le tube d’entrée dans la solution et en tirant le volume requis avec la seringue.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Configuration optique
<ol><li>
Modification du microscope (Figure 1)
	<ol>
<li>Modifiez un microscope TIRF pour activer l’imagerie IRM13. Remplacez le séparateur de faisceau 50/50 (réflectance (R)/Transmission (T)) utilisé dans la roue filtrante du microscope par un séparateur de faisceau 10/90 (R/T).</li>
		<li>Insérez un séparateur d’image entre la caméra et le microscope.</li>
		<li>Dans le cube de filtre du séparateur d’image, insérez un séparateur de faisceau 10/90 (R/T). Placez un filtre passe-long de 600 nm devant le faisceau réfléchi et un filtre d’émission de fluorescence approprié devant le faisceau transmis. REMARQUE: Des séparateurs de faisceau avec différents rapports R / T peuvent être utilisés pour régler les fractions de la lumière d’émission IRM et TIRF qui sont collectées.</li>
		<li>Alignez le séparateur d’image conformément aux spécifications du fabricant pour séparer spatialement les signaux TIRF et IRM sur la puce de la caméra. REMARQUE: La séparation spatiale des signaux est nécessaire car le signal TIRF des fluorophores typiques est beaucoup plus faible que le signal IRM d’un microtubule et ne serait pas détectable si les deux signaux étaient superposés.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Imagerie de microtubules dynamiques et de molécules uniques de kinésine
<ol><li>Fonctionnalisation et passivation de surface
	<ol>
<li>Débit du tampon BRB80 (80 mM Na-PIPES, 1 mM EGTA, 1 mM MgCl2, titré à pH 7,8 avec NaOH) dans la chambre de réaction.</li>
		<li>Appliquer la solution d’antibiotine diluée à 0,025 mg/mL dans le BRB80 et incuber à température ambiante pendant 10 min.</li>
		<li>Lavez le canal avec BRB80.</li>
		<li>S’écouler dans une solution de F-127 (1% de Pluronic F-127 (p/v) dissous dans BRB80 pendant la nuit) et incuber pendant au moins 20 min pour la passivation de surface. REMARQUE: Si des verres de couverture faciles à nettoyer sont utilisés au lieu de verres de couverture silanisés, passivat en utilisant 2 mg / mL de caséine dans BRB80 pendant >20 min à température ambiante.</li>
		<li>Lavez le canal avec BRB80.</li>
	</ol></li>
	<li>Préparation à l’imagerie
	<ol>
<li>Si un contrôle de la température est nécessaire, utilisez un appareil de chauffage objectif et réglez-le à la bonne température. REMARQUE: Dans ce protocole, toutes les expériences sont effectuées à 28 ° C.</li>
		<li>Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et allumez la source lumineuse d’épiillumination (>600 nm) pour l’imagerie IRM. REMARQUE: Dans ce protocole, une source de lumière LED blanche est utilisée avec un filtre passe-long de 600 nm.</li>
		<li>Focalisez le microscope sur la surface de l’échantillon. Recherchez le plan focal correct près de l’interface pdMS-solution. REMARQUE: Dans IRM, l’intérieur aqueux du canal doit apparaître beaucoup plus lumineux que le polymère PDMS.</li>
		<li>Choisissez un champ de vision près du centre du canal.</li>
		<li>Préparer une solution de microbilles fluorescentes de 0,1 μm dans du BRB80 (densité : 109 billes/mL, correspondant à une dilution de 200 fois pour les billes utilisées dans ce protocole).</li>
		<li>S’écouler dans au moins un volume de canal de la solution de microbilles.</li>
		<li>Surveillez la réaction via IRM. Attendez que les microbilles « atterrissent » progressivement à la surface. Lorsque la densité souhaitée de microbilles est atteinte, lavez l’excès avec BRB80.</li>
	</ol></li>
	<li>Culture de graines de microtubules biotinylées stabilisées au guanylyl 5'-α,β-méthylènediphosphonate (GMPCPP)
	<ol>
<li>Dans un tube centrifuge de 0,6 mL, préparer 50 μL d’une solution contenant 1 mM de GMPCPP, 1 mM deMgCl2 et 2 μM de tubuline biotinylée (stœchiométrie de marquage à 5-10 %) dans BRB80. REMARQUE: La stœchiométrie d’étiquetage correcte peut être obtenue en combinant la tubuline biotinylée à haute densité avec la tubuline bovine non marquée dans le bon rapport.</li>
		<li>Incuber la solution sur de la glace pendant 5 min, puis incuber à 37 °C pendant 12,5 min. REMARQUE: La longueur des graines peut être contrôlée en réglant le temps de polymérisation.</li>
		<li>Arrêtez la polymérisation en ajoutant 100 μL de BRB80 à température ambiante.</li>
		<li>Faire tourner la solution dans une ultracentrifugeuse à température ambiante (126 000 x g, 5 min). Jetez le surnageant à l’aide d’une pipette pour éliminer la tubuline non polymérisée. REMARQUE: Dans ce protocole, une ultracentrifugeuse à air est utilisée.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de BRB80 à température ambiante à la pastille. Resuspendez la pastille en pipetant doucement mais soigneusement. Utilisez une pipette de 200 μL avec une pointe de coupe pour réduire le cisaillement des microtubules.</li>
	</ol></li>
	<li>Croissance dynamique de la guanosine diphosphate (GDP)-tubuline « extensions » REMARQUE: Les graines seront immobilisées sur la surface de l’antibiotine du canal d’écoulement. Des « extensions » dynamiques GTP/GDP seront cultivées à partir des extrémités des semences immobilisées.<ol>
<li>Diluer les graines 20x dans BRB80. Faire couler les graines diluées dans la chambre de réaction.</li>
		<li>Surveillez la réaction via IRM. Attendez que les graines « atterrissent » progressivement sur la surface et s’y lient. Lorsque la densité de graines souhaitée est atteinte, lavez l’excès avec BRB80.</li>
		<li>Préparer un mélange d’extension de microtubules : 12 μM de tubuline non marquée, 1 mM de GTP, 5 mM de dithiothréitol (DTT) dans un tampon BRB80.</li>
		<li>S’écouler dans au moins un volume de canal du mélange d’extension. Assurez-vous que la température de réaction est de 28 °C.</li>
		<li>Attendez que les extensions de microtubules poussent à partir des graines au fil du temps. REMARQUE: La longueur à l’état d’équilibre est généralement atteinte en moins de 20 minutes.</li>
		<li>Utilisez les microtubules dynamiques pour l’imagerie. Ajoutez et visualisez des MAP fluorescents sur les microtubules, comme décrit à l’étape 3.5 pour la kinésine-1. REMARQUE: Étant donné que les microtubules sont liés à la surface, ils sont facilement visibles par le TIRF.</li>
	</ol></li>
	<li>Essai de motilité kinésine REMARQUE: Cette étape décrit un protocole pour visualiser la kinésine-1 marquée par la protéine fluorescente verte mobile (GFP) sur des microtubules rétrécissants. Une construction tronquée de kinésine-1 de rat fusionnée à eGFP (rKin430-eGFP) a été exprimée et purifiée, comme décrit précédemment15,16.<ol>
<li>Préparer un tampon de motilité : 1 mM d’ATP et 0,2 mg/mL de caséine dans le BRB80.</li>
		<li>Diluer la kinésine-eGFP dans un tampon de motilité à 10 nM.</li>
		<li>Préparer une solution de piégeage de l’oxygène 2x pour contrer le photoblanchiment oxydatif (80 mM de glucose, 80 mg/mL de glucose oxydase, 32 mg/mL de catalase, 0,2 mg/mL de caséine, 20 mM de TNT) complétée par 2 mM d’ATP.</li>
		<li>Combiner 10 parties de piégeur d’oxygène, 9 parties de BRB80 et 1 partie de kinésine-eGFP de 10 nM pour une concentration finale de kinésine de 0,5 nM. REMARQUE: Le volume total doit être au moins 1,5 fois plus grand que le volume du canal.</li>
		<li>Définissez les paramètres d’imagerie sur le logiciel du microscope. REMARQUE: Dans ce protocole, les vidéos sont enregistrées à 10 ips avec un temps d’exposition de 100 ms. L’intensité du laser est d’environ 0,05 kW/cm2.</li>
		<li>Commencez l’imagerie et faites circuler la solution de kinésine dans la chambre.</li>
		<li>Une fois la mesure terminée, enregistrez une courte vidéo (~5 s) dans laquelle la scène est lentement traduite en un mouvement circulaire ou latéral. Utilisez la projection médiane de cette vidéo comme image d’arrière-plan et soustrayez-la des mesures brutes.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Traitement et analyse d’images
REMARQUE: Le traitement de l’image a été effectué à l’aide de NIH ImageJ2 (imagej.nih.gov/ij/). Une macro a été élaborée pour automatiser le fractionnement et l’alignement des canaux TIRF et IRM. Cette macro nécessite l’installation du plugin GaussFit_OnSpot (disponible sur le référentiel des plugins ImageJ).
<ol><li>À partir de l’enregistrement en arrière-plan, créez une projection médiane dans ImageJ en cliquant sur Image | Piles | Projet Z.</li>
	<li>Soustrayez la projection d’arrière-plan médiane des données d’image brutes en cliquant sur Traiter | Calculatrice d’images. REMARQUE: Assurez-vous de cocher l’option « Résultat 32 bits (float) ».</li>
	<li>Pour l’enregistrement des images, choisissez une collection de microbilles près du microtubule d’intérêt et utilisez-les pour aligner les images TIRF et IRM.</li>
	<li>Pour chaque perle de cette collection, utilisez l’outil de sélection multipoint pour marquer l’emplacement approximatif dans le canal TIRF, puis l’emplacement correspondant dans le canal IRM. REMARQUE : Par exemple, s’il y a deux perles (1 et 2), la sélection multipoint aurait quatre points dans l’ordre suivant : (1) perle 1 en TIRF, (2) perle 1 en IRM, (3) perle 2 en TIRF, (4) perle 2 en IRM.</li>
	<li>Exécutez la macro ImageJ fournie (ImageSplitterRegistration.ijm). REMARQUE: Cela automatise les étapes suivantes: i) estimer l’emplacement central de chaque perle en l’ajustant à un gaussien; ii) pour chaque perle, calculer le vecteur de déplacement séparant le centre dans le canal TIRF du centre dans le canal IRM; iii) faire la moyenne de ce vecteur de déplacement sur toutes les perles; iv) diviser les canaux TIRF et IRM en images distinctes; v) traduire l’image TIRF par le vecteur de déplacement moyen calculé en iii; vi) superposition des images TIRF et IRM dans un fichier .tiff multicanal.</li>
</ol>

<ol><li>Gell, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+dynamics+reconstituted+in+vitro+and+imaged+by+single-molecule+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule dynamics reconstituted in vitro and imaged by single-molecule fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 95, 221-245 (2010).</li>
<li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+7%3A+Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Chapter 7: Total internal reflection fluorescence microscopy.</a> Methods in Cell Biology. 89, 169-221 (2008).</li>
<li>Kuo, Y. -W., Trottier, O., Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spastin+is+a+dual-function+enzyme+that+severs+microtubules+and+promotes+their+regrowth+to+increase+the+number+and+mass+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Spastin is a dual-function enzyme that severs microtubules and promotes their regrowth to increase the number and mass of microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (12), 5533-5541 (2019).</li>
<li>Hinrichs, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tau+protein+diffuses+along+the+microtubule+lattice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tau protein diffuses along the microtubule lattice.</a> The Journal of Biological Chemistry. 287 (46), 38559-38568 (2012).</li>
<li>Al-Hiyasat, A., Tuna, Y., Kuo, Y. -W., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Herding+of+proteins+by+the+ends+of+shrinking+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%3A%22%5BJournal%5D)">Herding of proteins by the ends of shrinking polymers.</a> arXiv:. , (2021).</li>
<li>Guo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+and+dynamics+of+breakage+of+fluorescent+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanism and dynamics of breakage of fluorescent microtubules.</a> Biophysical Journal. 90 (6), 2093-2098 (2006).</li>
<li>Moerner, W. E., Fromm, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+of+single-molecule+fluorescence+spectroscopy+and+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Methods of single-molecule fluorescence spectroscopy and microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 74 (8), 3597-3619 (2003).</li>
<li>Taylor, R. W., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTaylor%2C+RW+%22Interferometric+scattering+%28iSCAT%29+microscopy+and+related+techniques.+in+Label-free+super-resolution+microscopy%22">Interferometric scattering (iSCAT) microscopy and related techniques. in Label-free super-resolution microscopy</a>. Astratov, V. , Springer. Cham. 25-65 (2019).</li>
<li>Young, G., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interferometric+scattering+microscopy%29%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Physical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interferometric scattering microscopy).</a> Annual Review of Physical Chemistry. 70 (1), 301-322 (2019).</li>
<li>Koch, M. D., Rohrbach, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+and+bending+analysis+of+microtubules+by+ROCS+microscopy+and+optical+trapping%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging and bending analysis of microtubules by ROCS microscopy and optical trapping.</a> Biophysical Journal. 114 (1), 168-177 (2018).</li>
<li>Kandel, M. E., Teng, K. W., Selvin, P. R., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+single+microtubule+dynamics+using+spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of single microtubule dynamics using spatial light interference microscopy.</a> ACS Nano. 11 (1), 647-655 (2017).</li>
<li>Mahamdeh, M., Simmert, S., Luchniak, A., Schäffer, E., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+high-speed+wide-field+imaging+of+single+microtubules+using+interference+reflection+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Microscopy%22%5BJournal%5D)">Label-free high-speed wide-field imaging of single microtubules using interference reflection microscopy.</a> Journal of Microscopy. 272 (1), 60-66 (2018).</li>
<li>Mahamdeh, M., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Implementation+of+interference+reflection+microscopy+for+label-free%2C+high-speed+imaging+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Implementation of interference reflection microscopy for label-free, high-speed imaging of microtubules.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (150), e59520(2019).</li>
<li>Voldman, J., Gray, M. L., Schmidt, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfabrication+in+biology+and+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biomedical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Microfabrication in biology and medicine.</a> Annual Review of Biomedical Engineering. 1, 401-425 (1999).</li>
<li>Rogers, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((KIF1D+is+a+fast+non-processive+kinesin+that+demonstrates+novel+K-loop-dependent+mechanochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">KIF1D is a fast non-processive kinesin that demonstrates novel K-loop-dependent mechanochemistry.</a> The EMBO Journal. 20 (18), 5101-5113 (2001).</li>
<li>Leduc, C., Ruhnow, F., Howard, J., Diez, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+fractional+steps+in+cargo+movement+by+the+collective+operation+of+kinesin-1+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Detection of fractional steps in cargo movement by the collective operation of kinesin-1 motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (26), 10847-10852 (2007).</li>
<li>Tuna, Y., Al-Hiyasat, A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+dynamic+microtubules+and+associated+proteins+by+Simultaneous+Interference-Reflection+and+Total-Internal-Reflection-Fluorescence+Microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22arXiv%22%5BJournal%5D)">Imaging dynamic microtubules and associated proteins by Simultaneous Interference-Reflection and Total-Internal-Reflection-Fluorescence Microscopy.</a> arXiv. , (2022).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’étude de la régulation de la dynamique des microtubules par les protéines associées aux microtubules (MAP) nécessite souvent une imagerie simultanée des microtubules et des MAP. Les techniques de microscopie à fluorescence telles que le TIRF sont généralement utilisées à cette fin. Cependant, ils sont limités par les inconvénients de l’imagerie par fluorescence, qui comprennent le photoblanchiment, les photodommages et la nécessité d’un marquage fluorophore. Les méthodes sans étiquette, telles que l’IRM, conviennent à la visualisation de microtubules, mais ne sont pas capables d’imager des fluorophores uniques. Ce protocole combine l’imagerie IRM sans étiquette et la microscopie TIRF pour l’imagerie simultanée de microtubules dynamiques et de MAP.
La configuration IRM utilise une source d’éclairage LED filtrée à >600 nm, tandis que la configuration TIRF utilise un laser 488 nm. Nous avons utilisé un séparateur de faisceau de plaques peu coûteux pour réfléchir la lumière d’éclairage sur l’échantillon et transmettre le signal collecté au détecteur (Figure 1). Un séparateur de faisceau avec une réflectance de 10% et une transmission de 90% a été choisi pour minimiser la perte du signal à molécule unique. La perte de 90% de l’intensité lumineuse de l’éclairage est compensée par l’augmentation de la puissance du laser d’éclairage et de la LED. 
La séparation spectrale des signaux a été réalisée à l’aide d’un séparateur de faisceau 90/10 (R/T) et de deux filtres spectraux (passe-long 600 nm pour IRM et passe-bande 535/50 nm pour TIRF). Les signaux IRM et TIRF séparés spectralement sont projetés sur deux moitiés d’une seule puce de caméra à l’aide d’un ensemble de séparateurs d’images. L’utilisation d’un séparateur de faisceau 90/10 sacrifie 90% du signal IRM, mais cela est compensé par l’augmentation de l’intensité de la source d’éclairage LED. Un miroir dichroïque pourrait également être utilisé ici pour séparer plus efficacement les signaux IRM et TIRF. Les microbilles fluorescentes incluses dans les essais permettent un alignement précis des images TIRF et IRM et servent de référence pour la mise au point de l’objectif.
L’élément optique le plus critique de ce protocole est l’objectif à grande ouverture numérique (NA). Ceci est essentiel non seulement pour obtenir une réflexion interne totale, mais aussi pour maximiser l’efficacité de la collection et le contraste de l’image. La qualité des images obtenues dépend également de la propreté de la surface du verre et de l’acquisition d’une image de fond claire pour corriger l’éclairage non uniforme et supprimer les caractéristiques statiques. Pour l’imagerie IRM, nous recommandons d’utiliser un éclairage de longue longueur d’onde (>600 nm) pour minimiser les photodommages des microtubules et des protéines. Ceci est particulièrement important si une source de lumière LED blanche est utilisée, auquel cas un filtre passe-long doit être inclus pour éliminer toute lumière UV. 
Ce protocole permet une imagerie haute vitesse sans étiquette de microtubules dynamiques et une visualisation simultanée à haute résolution des MAP fluorescents17. Par rapport à la technique de commutation du cube filtrant, qui alterne entre la capture d’images de microtubules et de MAP, cette configuration est capable de fréquences d’images beaucoup plus élevées car elle ne dépend pas de la rotation physique d’un cube filtrant. Par rapport aux techniques d’imagerie TIRF bicolores, cette technique utilise une configuration optique moins exigeante et contourne le besoin de marquage fluorophore des microtubules. Les principales limites de cette configuration sont dues à l’imagerie TIRF des MAP; la fréquence d’images est limitée par le temps d’exposition d’un fluorophore, et le photoblanchiment des fluorophores reste une possibilité. Néanmoins, ce protocole améliore les techniques existantes car il n’utilise le TIRF que lorsque cela est nécessaire (c’est-à-dire pour visualiser les MAP mais pas les microtubules) et atteint la vitesse la plus élevée possible dans les limites du TIRF. D’autres améliorations ne sont possibles que si les microtubules et les MAP sont visualisés via une technique interférométrique, mais cela nécessite de marquer les MAP avec des nanoparticules métalliques, ce qui présente ses limites et ses défis expérimentaux.
Pour démontrer les capacités de cette technique, nous avons visualisé simultanément deux processus dynamiques rapides via IRM et TIRF : le retrait d’un microtubule et la marche d’une molécule de kinésine fluorescente. Cette technique a déjà été utilisée pour visualiser la diffusion rapide de la spastine sur des microtubules rétractables5. Au-delà de cette application aux MAP et aux microtubules, ce protocole peut être utilisé pour visualiser simultanément des molécules fluorescentes uniques avec n’importe quelle structure macromoléculaire suffisamment massive pour être visualisée via IRM, telle qu’une membrane cellulaire ou un filament d’actine.

La microscopie TIRF (Total-internal-reflection-fluorescence) est couramment utilisée pour la visualisation de molécules fluorescentes uniques. Par rapport à l’imagerie par épifluorescence, le TIRF permet une suppression supérieure de l’arrière-plan, permettant une localisation et un suivi à haute résolution des fluorophores uniques. Pour cette raison, le TIRF est la méthode préférée pour visualiser les protéines associées aux microtubules marquées par fluorescence et est fréquemment utilisé pour imager les microtubules 1,2.
Pour étudier la régulation de la dynamique des microtubules par les MAP, il est souvent nécessaire d’imager simultanément les microtubules et les MAP. La plupart des méthodes existantes à cet effet sont coûteuses ou souffrent d’inconvénients techniques. Le TIRF bicolore simultané, par exemple, nécessite deux lasers d’excitation et deux caméras. En plus du coût élevé, le besoin de caméras séparées pose des problèmes de synchronisation des images et d’enregistrement des images. Ce besoin peut être contourné si un cube filtrant rotatif est utilisé pour basculer physiquement entre les lasers d’excitation dans des images consécutives3. Dans une telle configuration, une seule puce de caméra peut être utilisée et les images alternent entre des images de microtubules et de MAP. Cette technique, cependant, est limitée par la vitesse du changement de filtre, qui limite généralement la fréquence d’images à moins de 0,5 image par seconde3 (fps). Une telle fréquence d’images est insuffisante pour résoudre des processus dynamiques rapides, tels que le retrait d’un microtubule se produisant à une vitesse allant jusqu’à 500 nm/s, la marche d’une kinésine à une vitesse de l’ordre de 800 nm/s, ou la diffusion d’une MAP se produisant avec des coefficients de diffusion supérieurs à 0,3 μm2/s4. Ceci est particulièrement problématique lors du suivi des positions relatives de deux cibles en mouvement dans chaque canal, comme la position d’un MAP par rapport à la position d’une pointe de microtubule en mouvement5.
En plus de ces contraintes optiques, la microscopie TIRF bicolore exige que les MAP et les microtubules soient marqués avec différents fluorophores dont les spectres d’émission sont suffisamment séparés. Le marquage fluorescent de la tubuline peut altérer la dynamique des microtubules6, et le photoblanchiment des fluorophores limite la vitesse d’imagerie7. En raison de ces problèmes, des techniques d’imagerie sans étiquette ont été développées pour visualiser les microtubules. Il s’agit notamment de la microscopie à diffusion interférométrique (iSCAT)8,9, de la microscopie rotative-cohérente-diffusion (ROCS)10, de la microscopie spatiale à interférence lumineuse (SLIM)11 et de la microscopie par réflexion d’interférence (IRM)12,13. Ces techniques permettent une imagerie rapide sans étiquette des microtubules sans les inconvénients de l’imagerie par fluorescence, mais elles ne peuvent pas être utilisées pour visualiser des MAP uniques.
Parmi ces techniques sans étiquette, IRM se distingue par son faible coût et ses exigences modestes en matière d’instrumentation. Nous avons récemment présenté un protocole pour combiner l’IRM avec un microscope TIRF commercial, permettant d’imager des microtubules et des MAP fluorescents dans des images alternées 3,13. Ce document présente un protocole permettant de modifier cette configuration pour capturer simultanément des images TIRF et IRM sur une seule puce de caméra. Cela implique l’ajout d’un séparateur de faisceau peu coûteux dans le chemin d’excitation pour éclairer simultanément l’échantillon avec un laser TIRF et une source de lumière IRM LED. Un séparateur d’images commercial modifié est utilisé pour séparer spectralement les signaux TIRF et IRM et les projeter sur des moitiés distinctes de la même puce de caméra. Nous utilisons également un système microfluidique qui permet l’échange rapide de réactifs lors de l’imagerie. Ce protocole décrit comment cette configuration peut être utilisée pour imager des microtubules dynamiques et des MAP. La capacité de l’appareil est démontrée en présentant la première visualisation de protéines de kinésine-1 marchant sur des microtubules rétrécissants, qui est capturé à une fréquence d’images de 10 s-1.

<table><tbody><tr><td>Séparateur de faisceau 10/90 (R/T)</td><td>Thorlabs</td><td>BSN10R</td><td>Séparateur de faisceau plan utilisé dans le trajet du faisceau d’excitation</td></tr><tr><td>Séparateur de faisceau 90/10 (R/T)</td><td>Thorlabs</td><td>BSX10R</td><td>Séparateur de faisceau plan utilisé dans le séparateur d’images</td></tr><tr><td>Anticorps anti-biotine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3640</td><td>Utilisé pour fonctionnaliser la surface pour la liaison des microtubules biotinylés</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>FLAAS</td><td>Utilisé pour la préparation du tampon de motilité</td></tr><tr><td>Filtre passe-bande</td><td>Newport</td><td>HPM535-50</td> Le <td>filtre passe-bande à revêtement dur est utilisé dans le séparateur d’image pour imager le signal GFP</td></tr><tr><td>Tubuline biotinylée</td><td>Cytoskeleton, Inc.</td><td>T333P-A</td><td>Utilisé pour lier les graines de microtubules à la surface du canal d’écoulement</td></tr><tr><td>Caséine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8654</td><td>La caséine est utilisée pour bloquer les interactions non spécifiques</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution de piégeage d’oxygène</td></tr><tr><td>Chambre de dessiccateur</td><td>Southern Labware</td><td>55207</td><td>Le dessiccateur est utilisé pour dégazer la résine</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution d’absorption d’oxygène</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>Utilisé pour la préparation du tampon BRB80</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7528</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution d’élimination de l’oxygène</td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7016</td><td>Utilisé pour la préparation de la solution d’élimination de l’oxygène</td></tr><tr><td>Nucléotides</td> <td>GMPCPPJena Bioscience</td><td>NU-405L</td><td>Utilisé pour la polymérisation de microtubules stabilisés</td></tr><tr><td>Séparateur d’images</td><td>Télédyne-Photometrics Imaging</td><td>OptoSplit II</td><td>Un séparateur d’images est utilisé pour diviser les images dans l’espace. Lors de l’achat, assurez-vous de la compatibilité avec le microscope</td></tr><tr><td>ImajeJ2</td><td>NIH</td><td></td><td>ImageJ2 est utilisé pour l’analyse d’images</td></tr><tr><td>Kinesin</td><td></td><td></td><td>préparé en interne (voir références dans le texte)</td></tr><tr><td>Tube LDPE</td><td>Thomas Scientific</td><td>9565S22</td><td>Un tube en polyéthylène de faible densité non toxique est utilisé pour les transferts de fluides</td></tr><tr><td>Source lumineuse LED</td><td>Lumencor</td><td>Lumencor sola Moteur de lumière</td><td>Utilisé pour l’imagerie IRM</td></tr><tr><td>Filtres passe-long</td><td>Thorlabs</td><td>FELH0600</td><td>Filtres passe-long à revêtement dur. L’un est utilisé comme filtre d’excitation, l’autre est utilisé dans le séparateur d’images pour imager le signal IRM</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de magnésium Sigma-Aldrich</td><td>63068</td><td>Utilisé pour la préparation du tampon BRB80 Chauffage d’objectif</td></tr><tr><td>Micoscope</td><td>okolab</td><td>H401-T-DUAL-BL</td><td>Utilisé pour maintenir la température de l’échantillon constante en chauffant l’objectif</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Nikon</td><td>Ti-Eclipse</td><td>Un microscope inversé utilisé dans les expériences</td></tr><tr><td>Na-PIPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2949</td><td>Utilisé pour la préparation du tampon BRB80</td></tr><tr><td>Nikon CFI Apochromat TIRF 100XC Objectif à huile</td><td>Nikon</td><td>MRD01991</td><td>L’objectif d’imagerie a une ouverture numérique de 1,49</td></tr><tr><td>PDMS et un agent de durcissement</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>Sylgard 184 (24236-10)</td><td>Utilisé pour la construction des canaux d’écoulement</td></tr><tr><td>PDMS puncher</td><td>World Precision Instruments LLC</td><td>504529</td><td>Utilisé pour percer un trou dans le nettoyant plasma PDMS</td></tr><tr><td></td><td>Harrick Plasma</td><td>DPC-32G</td><td>Le plasma d’air est utilisé pour éliminer la contamination organique de la surface du PDMS</td></tr><tr><td>Poloxamer 407 (nom commercial Pluronic F-127)</td><td>Sigma-aldrich</td><td>P2443</td><td>Utilisé pour la passivation de la surface du canal afin de minimiser la liaison non spécifique</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>567530</td><td>Utilisé pour la préparation du Tampon BRB80</td></tr><tr><td>Microtubules stabilisés</td><td></td><td></td><td>préparés en interne (voir références dans le texte)</td></tr><tr><td>Ultracentrifugeuse de table</td><td>Beckman Coulter</td><td>340400</td><td>Utilisé pour faire filer les graines de microtubules</td></tr><tr><td>Perles TetraSpeck</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T7279</td><td>Utilisé comme référence pour l’alignement des images</td></tr><tr><td>Zyla 4.2</td><td>caméra Andor</td><td>Zyla 4.2</td><td>Caméra CMOS scientifique avec spesifications : 2048 x 2048 pixels (6,5 &mu ; m pixel size) avec une efficacité quantique de 72 % et une plage dynamique de 16 bits</td></tr></tbody></table>

microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées

Simultaneous Interference Reflection and Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy for Imaging Dynamic Microtubules and Associated Proteins

Plusieurs techniques ont été utilisées pour la visualisation directe des filaments du cytosquelette et de leurs protéines associées. La microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) a un rapport signal/fond élevé, mais elle souffre de photoblanchiment et de photodommages des protéines fluorescentes. Les techniques sans étiquette telles que la microscopie par réflexion par interférence (IRM) et la microscopie à diffusion interférométrique (iSCAT) contournent le problème du photoblanchiment mais ne peuvent pas facilement visualiser des molécules uniques. Cet article présente un protocole pour combiner l’IRM avec un microscope TIRF commercial pour l’imagerie simultanée de protéines associées aux microtubules (MAP) et de microtubules dynamiques in vitro. Ce protocole permet l’observation à grande vitesse des MAP interagissant avec les microtubules dynamiques. Cela améliore les configurations TIRF bicolores existantes en éliminant à la fois le besoin d’étiquetage de microtubules et le besoin de plusieurs composants optiques supplémentaires, tels qu’un deuxième laser d’excitation. Les deux canaux sont imagés sur la même puce de caméra pour éviter les problèmes d’enregistrement d’image et de synchronisation d’images. Cette configuration est démontrée en visualisant des molécules de kinésine unique marchant sur des microtubules dynamiques.

La configuration optique est schématisée à la figure 1. L’éclairage IRM et la lumière d’excitation TIRF sont dirigés vers l’ouverture arrière de l’objectif (100x, NA: 1,49) via un séparateur de faisceau 10/90 (R / T) (BS1). Le signal émis passe par le même séparateur de faisceau (BS1) et est réfléchi vers le séparateur d’image via un miroir (M1). Les composants du séparateur d’image (entourés de lignes pointillées sur la figure 1) séparent les signaux IRM et TIRF via un séparateur de faisceau 90/10 (R/T) (BS2) avec des filtres spectraux appropriés. Enfin, les images fractionnées sont projetées sur la puce de la caméra pour la visualisation. L’alignement du séparateur d’images est tel que les signaux TIRF et IRM sont projetés sur des moitiés distinctes de la puce.
Dans un microscope bien aligné, l’image de la caméra doit afficher une image divisée à mi-chemin, comme illustré à la figure 2. Les microtubules liés à la surface doivent être facilement visibles dans le canal IRM13 et la kinésine fluorescente doit être visible dans le canal TIRF.
Les microbilles utilisées pour aligner et enregistrer les deux canaux apparaissent comme des points lumineux dans les images TIRF et des taches sombres dans les images IRM. Bien que les perles soient visibles dans les données brutes, la soustraction de fond améliore considérablement le contraste (Figure 2). L’image d’arrière-plan utilisée pour la soustraction est la médiane temporelle d’une vidéo enregistrée avec une scène en mouvement. Comme décrit dans le protocole, l’alignement de l’image a été effectué en sélectionnant une collection de perles près de la région d’intérêt et en exécutant la macro fournie (imageSplitterRegistration.ijm). La macro ajuste les points aux gaussiens et aligne les images en minimisant la distance moyenne entre les points centraux des ajustements dans chaque canal. Ce processus est représenté à la figure 2, qui montre un bon alignement des microbilles fluorescentes (vert dans le canal TIRF, noir dans le canal IRM).
Enfin, les capacités de cette configuration d’imagerie simultanée sont démontrées en observant des molécules de kinésine unique marchant vers les extrémités rétrécissantes des microtubules. La figure 3 montre un kymographe de molécules de kinésine marquées eGFP (vert) marchant sur un microtubule rétrécissant (gris). Une série d’instantanés de l’enregistrement à partir duquel le kymographe a été généré est également présentée.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig01.jpg"> Figure 1 : Représentation schématique de la configuration optique pour l’imagerie IRM et TIRF simultanée de la motilité de la kinésine. L’épiillumination d’une source lumineuse LED passe à travers le diaphragme d’ouverture et atteint le séparateur de faisceau 10/90 (R/T) (BS1). Le séparateur de faisceau réfléchit partiellement la lumière d’éclairage IRM rouge et la lumière d’excitation TIRF de 488 nm jusqu’à l’objectif pour éclairer l’échantillon. Le signal de l’échantillon est collecté par le même objectif et dirigé vers l’ensemble de fractionnement d’image où les images IRM et TIRF sont séparées spatialement par le séparateur de faisceau 90/10 (R/T) (BS2). Les signaux sont ensuite filtrés spectralement avant d’atteindre la puce de la caméra. Abréviations : IRM = microscopie par réflexion d’interférence; TIRF = total-interne-réflexion-fluorescence; LED = diode électroluminescente; ITIRF = Éclairage TIRF; IGFP = fluorescence GFP; Iinc = éclairage IRM; Iref = lumière diffusée à l’interface verre/eau; Iscat = lumière diffusée du microtubule; IIRM = signal IRM (Interférence de Iref et Iscat); R/T = réfléchi/transmis; LP600: filtre passe-long (600 nm); DM = miroir dichroïque; BS1 et BS2 = séparateurs de faisceau 1 et 2; M1, M2, M3, M4 = miroirs; BP535/50 = passe-bande (535/50 nm); GFP = protéine fluorescente verte; GMPCPP = guanylyl 5'-α,β-méthylènediphosphonate; PIB = guanosine diphosphate. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig02.jpg"> Figure 2 : Soustraction de l’arrière-plan et alignement de l’image. Les images TIRF (moitié gauche) et IRM (moitié droite) apparaissent simultanément sur deux moitiés de la même puce de caméra (image de caméra). La soustraction d’arrière-plan médiane temporelle augmente le contraste des perles (image soustraite en arrière-plan), qui apparaissent sombres dans IRM et lumineuses dans les images TIRF. Les images IRM et TIRF sont alignées par traduction (à droite) en fonction de la localisation des perles sélectionnées (rectangles blancs). Barres d’échelle = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63730/63730fig03.jpg"> Figure 3 : Kymographe et instantanés du mouvement des Kinesins pendant le retrait des microtubules. Le kymographe (à gauche) montre eGFP-kinésine-1 (vert) marchant vers l’extrémité supérieure du microtubule (gris foncé). Les instantanés des séries chronologiques correspondantes sont affichés (à droite). Les flèches blanches montrent des molécules uniques de kinésine-1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/63730fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier ImageSplitterRegistration : <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63730/ImageSplitterRegistration.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous présentons un protocole pour la mise en œuvre de la microscopie interférence-réflexion et de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale pour l’imagerie simultanée de microtubules dynamiques et de protéines associées à des microtubules marquées par fluorescence.

Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées

Several techniques have been employed for the direct visualization of cytoskeletal filaments and their associated proteins. ...

L’importance de cette méthode est qu’elle permet à des microtubules sans étiquette d’être imagés simultanément avec des protéines marquées par fluorescence à des fréquences d’images élevées. Le principal avantage de cette technique est sa facilité de mise en œuvre et les exigences minimales sur les composants optiques. Il contourne également la nécessité d’un marquage fluoro-4 des microtubules.Pour commencer, préparez le polymère PDMS en combinant l’agent de durcissement et l’élastomère de base dans un rapport massique de 1:10. Mélangez-les pendant deux minutes, puis dégazez le mélange dans une chambre à vide jusqu’à ce que toutes les bulles disparaissent. Ensuite, versez le mélange sur le moule principal en une couche d’environ 0,5 centimètre d’épaisseur, en prenant soin d’éviter de créer des bulles, et faites cuire le mélange dans un four préchauffé à 70 degrés Celsius pendant 40 minutes.Ensuite, découpez les régions structurées du polymère et percez les trous à chaque extrémité du canal à l’aide d’un perforateur PDMS. Plus tard, nettoyez le côté structuré du bloc PDMS. Par la suite, rincer trois fois avec de l’isopropanol et du méthanol suivis d’eau ultrapure et sécher la surface.Ensuite, nettoyez le PDMS au plasma à l’aide d’oxygène ou de plasma d’air et placez le PDMS nettoyé au plasma sur un verre de couverture correctement nettoyé. Chauffez-le sur une plaque chauffante à 80 degrés Celsius pendant 15 minutes. Insérez un tube en polyéthylène basse densité de taille appropriée dans les trous et connectez le tube de sortie à une seringue de 0,5 millilitre.Ensuite, faites couler les solutions dans les microcanaux en immergeant le tube d’entrée dans la solution et en tirant le volume requis avec la seringue. Placez l’échantillon sur l’étage du microscope et allumez la source lumineuse d’épi-éclairage pour l’imagerie IRM. Pour focaliser le microscope, recherchez le plan focal correct près de l’interface de la solution PDMS et choisissez un champ de vision près du centre du canal.Ensuite, préparez une solution 0,1-micromolaire de microbilles fluorescentes dans BRB80 et faites circuler au moins un volume de canal de la solution de microbilles. Surveillez la réaction via IRM ou TIRF. Lorsque la densité souhaitée de microbilles est atteinte, lavez l’excès avec BRB80.Faire circuler les graines diluées dans la chambre de réaction et surveiller la réaction par IRM. Lorsque la densité de graines souhaitée est atteinte, lavez l’excès avec BRB80. Ensuite, préparez un mélange d’extension de microtubule contenant de la tubuline non marquée de 12 micromolaires, du GTP d’un millimolaire et de la TNT de cinq millimolaires dans un tampon BRB80.Ensuite, faites circuler au moins un volume de canal du mélange d’extension tout en vous assurant que la température de réaction est de 28 degrés Celsius. Pour commencer, définissez les paramètres d’imagerie sur le logiciel du microscope. Commencez l’imagerie et faites circuler la solution de kinésine dans la chambre.Ensuite, visualisez les microtubules de kinésine 1 marqués GFP. Une fois la mesure terminée, enregistrez une courte vidéo dans laquelle la scène est lentement traduite en un mouvement circulaire ou latéral. La projection médiane de cette vidéo servira d’image d’arrière-plan et sera soustraite des mesures brutes.Créez une projection médiane dans ImageJ à partir de l’enregistrement d’arrière-plan en cliquant sur Image. Ensuite, sélectionnez l’option Piles et cliquez sur Z Project. Ensuite, soustrayez la projection d’arrière-plan médiane des données d’image brutes en cliquant sur Processus, puis sélectionnez l’option Calculatrice d’image tout en vous assurant de cocher l’option de résultat flottant 32 bits.Pour l’enregistrement des images, choisissez une collection de microbilles près du microtubule d’intérêt et utilisez-les pour aligner les images TIRF et IRM. Pour chaque perle de cette collection, utilisez l’outil de sélection multipoint pour marquer l’emplacement approximatif dans le canal TIRF, puis l’emplacement correspondant dans le canal IRM. Ensuite, exécutez la macro ImageJ fournie.Les microbilles apparaissent sous forme de taches sombres dans le canal IRM à droite et de points lumineux dans le canal TIRF à gauche. La procédure d’alignement superpose correctement les deux canaux en localisant une sélection de perles. Un kymographe de molécules de kinésine marquées par l’EGFP marchant vers les extrémités rétrécissantes des microtubules a également été obtenu à l’aide de ce protocole.Lors de cette procédure, il est important de choisir des objectifs à ouverture numérique élevée afin d’obtenir une réflexion interne totale et de maximiser l’efficacité de la collection et le contraste de l’image. Cette méthode peut être utilisée pour l’imagerie à haute résolution de molécules fluorescentes uniques simultanément dans la structure macromoléculaire suffisamment massive pour être visualisée par IRM, comme la membrane cellulaire ou le filament d’actine. Ce protocole fournit également une procédure facilement adaptable pour l’imagerie simultanée avec n’importe quelle combinaison d’IRM, de TIRF et d’épifluorescence.

simultaneous-interference-reflection-total-internal-reflection

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Le cloisonnement des protéines soit au sein de la membrane plasmique ou dans des endroits intracellulaires est un mécanisme de régulation qui peuvent grandement influencer les résultats de signalisation, d'où, à comprendre la signalisation, il est important d'étudier le comportement spatial et temporel des protéines impliquées. Nous décrivons ici un système de microscopie TIRF base pour étudier la transduction du signal dans les cellules T, mais est largement applicable.

Une technique de microscopie TIRF en temps réel, imagerie simultanée du TCR et de ses associés protéines de signalisation

Fluorescence à réflexion interne totale (TIRF) microscopie est une approche puissante pour observer des structures à proximité de la surface de la cellule au contraste élevé et une résolution temporelle. Nous montrons comment la FRBR peut être utilisée pour étudier la dynamique des protéines au niveau du cortex des parois cellulaires fermés cellules bactériennes et fongiques.

Visualisation de Cortex organisation et la dynamique de micro-organismes, l&#39;aide totale microscopie de fluorescence à réflexion

Cette vidéo décrit TIRF, une technique basée sur la microscopie à réflexion interne totale pour visualiser la dynamique de polymérisation de l’actine et des microtubules. La méthode permet l’imagerie à haute résolution de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules en temps réel, ce qui est essentiel pour comprendre les interactions cellulaires.

Microscopie TIRF pour visualiser la dynamique du couplage de l’actine et des microtubules

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de microscopie à réflexion interférentielle (IRM) pour visualiser la croissance des microtubules sur une surface de lamelle en présence d’un tampon approprié. Lors de l’éclairage avec la lumière incidente, l’interface lamelle-tampon et l’interface tampon-microtubule réfléchissent la lumière, qui se combine pour créer un motif d’interférence, permettant la visualisation des microtubules sous forme d’images à contraste élevé sur un fond clair.

Microscopie à réflexion interférentielle pour une visualisation sans marquage de la dynamique des microtubules

Source : Winkle, C. C., et al. Utilisation de méthodologies combinées pour définir le rôle de l’administration de la membrane plasmique lors de la ramification des axones et de la morphogenèse neuronale. J. Vis. Exp. (2016)Cette vidéo fait la démonstration de la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) pour visualiser les événements exocytaires dans les neurones corticaux. Un marqueur de protéine fluorescente verte (GFP) sensible au pH devient fluorescent lors de la fusion...

Microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour la visualisation d’événements exocytaires 

Ce protocole décrit comment utiliser la microscopie à fluorescence à réflexion interne totale pour visualiser et suivre des récepteurs uniques à la surface de cellules vivantes et ainsi analyser la mobilité latérale des récepteurs, la taille des complexes récepteurs, ainsi que pour visualiser les interactions transitoires récepteur-récepteur. Ce protocole peut être étendu à d’autres protéines membranaires.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Ce protocole est un guide pour la mise en œuvre de la microscopie de réflexion d'interférence sur un microscope de fluorescence standard pour l'imagerie à haute vitesse sans étiquette, à contraste élevé, des microtubules utilisant des essais in vitro de surfaces.

Mise en œuvre de la microscopie de réflexion sur les interférences pour l'imagerie à haute vitesse sans étiquette des microtubules

Ici, un essai de reconstitution in vitro basé sur la microscopie TIRF est présenté pour quantifier et comparer simultanément la dynamique de deux populations de microtubules. Une méthode est décrite pour visualiser simultanément l’activité collective de plusieurs protéines associées aux microtubules sur des faisceaux de microtubules réticulés et des microtubules simples.

Visualisation simultanée de la dynamique des microtubules réticulés et simples in vitro par microscopie TIRF

Nous présentons ici un protocole pour reconstituer des faisceaux de microtubules in vitro et quantifier directement les forces exercées en leur sein en utilisant le piégeage optique simultané et la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale. Ce test permet de mesurer à l’échelle nanométrique les forces et les déplacements générés par les ensembles de protéines au sein de réseaux de microtubules actifs.

Mesure directe des forces dans les faisceaux de microtubules actifs reconstitués

Ce protocole est un guide pour visualiser l’actine dynamique et les microtubules à l’aide d’un test de microscopie à fluorescence interne totale (TIRF) in vitro .

Visualisation de la dynamique de couplage de l’actine et des microtubules in vitro par microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF)

Découvrez une méthode de microscopie IRM et TIRF pour imager simultanément les microtubules et les protéines fluorescentes. Cette technique permet une visualisation haute résolution des dynamiques cellulaires sans marquage complexe.

Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées (Vidéo) | JoVE Journal

Microscopie à fluorescence par interférence simultanée et à réflexion interne totale pour l’imagerie de microtubules dynamiques et de protéines associées

Explorer plus de vidéos