Microscopie à fluorescence intravitale à grand champ de la microcirculation pulmonaire dans une lésion pulmonaire aiguë expérimentale à l’aide d’un système d’imagerie stabilisé sous vide

Ce protocole décrit en détail la préparation chirurgicale et l’utilisation d’un système stabilisé sous vide pour imager l’adhésion des leucocytes pulmonaires et la perfusion capillaire in vivo. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une imagerie intravitale stable à haute résolution du poumon miroir intact avec un minimum de traumatisme physique. Pour commencer, préparez la fenêtre d’imagerie en administrant une fine couche de graisse sous vide au sommet de l’anneau extérieur tout en évitant la contamination du canal de vide.

Placez un couvercle en verre propre de 8 millimètres sur la fenêtre et appuyez doucement pour créer un joint. Connectez la fenêtre d’imagerie à une pompe à vide équipée d’un manomètre numérique et capable de fournir 50 à 60 millimètres d’aspiration constante au mercure. Passez une longueur de câble à fibre optique à travers une canule endotrachéale de calibre 20 et immergez la pointe dans la lidocaïne HCL.

Après l’anesthésie, insérez un otoscope modifié, de sorte que les incisives supérieures s’insèrent dans l’espace du spéculum. Ajustez la portée et la position de la langue jusqu’à ce que l’épiglotte et les cordes vocales soient clairement visibles. Insérez le câble à fibre optique à travers l’espace dans le spéculum et utilisez de petits mouvements circulaires pour passer le câble entre les cordes vocales, puis en utilisant le câble à fibre optique comme guide, faites glisser doucement la canule dans la trachée pour intuber la souris.

Après avoir commencé la ventilation avec 1,5% d’isoflurane, confirmez la profondeur de l’anesthésie en testant le réflexe de pédale. Fixez la canule au museau avec du ruban adhésif médical. Utilisez du ruban adhésif d’étiquetage pour fixer la patte avant droite au coussin chauffant à la position de neuf heures et étendez la patte arrière gauche de manière caudale et fixez-la à la position de six heures.

À l’aide d’un ruban en tissu, étirez légèrement la patte avant gauche jusqu’à la position de 12 heures et fixez l’autre extrémité de la bande au sommet de la plate-forme de microscopie intravitale, puis appliquez une sonde de température rectale et un oxymètre de pouls à pattes pour surveiller les signes vitaux tout au long de l’expérience. Pour préparer la souris à la chirurgie, stérilisez le thorax et l’abdomen avec une lingette à 70% d’alcool et appliquez une légère couche d’huile minérale pour humidifier les poils du côté gauche de la souris. Faites une petite incision près du bas de la cage thoracique pour exposer la couche musculaire sous-jacente, puis étendez l’incision initiale et utilisez une dissection émoussée pour exposer la cage thoracique.

À l’aide d’une pince hémostatique, saisissez le tissu épithélial et adipeux disséqué et placez-le à l’écart de la zone chirurgicale. Pour marquer les leucocytes et le flux sanguin par fluorescence, administrer un bolus de 2,5 millilitres par kilogramme de Rhodamine 6G et de FITC-albumine par la veine caudale. À l’aide d’une pince dentée, saisissez la côte immédiatement inférieure à la position de la base du poumon à l’inspiration finale.

Rétractez légèrement la pince pour éloigner la côte du poumon, puis coupez la côte pour induire un pneumothorax. Étendez l’incision latéralement dans les deux sens, en prenant soin de ne pas toucher le poumon. Saisissez la côte la plus haute suivante avec une pince émoussée et rétractez-vous légèrement pour permettre au poumon de tomber loin de la paroi thoracique.

Si le poumon ne se détache pas, appuyez légèrement sur la paroi thoracique contre le poumon pour que le poumon adhère à la plèvre sous-jacente et tombe ainsi plus facilement. Continuez l’incision d’origine jusqu’au sternum et crâniennement jusqu’à ce que le sommet du poumon soit exposé. Utilisez des applicateurs de coton et de la gaze pour atténuer tout saignement qui survient.

Soulevez la cage thoracique pour exposer les vaisseaux sanguins intercostaux sur l’aspect dorsal de la cavité thoracique, en prenant soin de ne pas endommager le poumon, cautériser le vaisseau intercostal le plus inférieur près de la colonne vertébrale, puis couper la côte adjacente. Se déplacer crâniennement, et éventuellement, utiliser un modèle répété de cautérisation et de coupe pour exciser une partie d’environ un centimètre sur deux de la cage thoracique. Pour vous préparer à l’imagerie, transférez la plate-forme de microscopie intravitale au stade du microscope et positionnez la fenêtre d’imagerie directement au-dessus du poumon exposé.

Utilisez le micro-manipulateur pour abaisser soigneusement la fenêtre d’imagerie jusqu’à ce qu’elle adhère à la surface du poumon et la stabilise. Pour visualiser la microcirculation pulmonaire, utilisez un microscope à fluorescence à grand champ équipé d’un objectif 20x et d’ensembles de filtres FITC et Rhodamine standard. Utilisez une caméra CCD noir et blanc pour enregistrer les vidéos avec un contraste optimal.

À l’aide de l’ensemble de filtres FITC, identifiez un site pulmonaire en fonction du schéma convergent du flux sanguin et enregistrez une vidéo de 30 secondes avec le lieu au point, puis répétez l’enregistrement dans le même champ de vision à l’aide du filtre Rhodamine pour visualiser les leucocytes. Pour localiser une artère pulmonaire, utilisez le filtre FITC pour identifier un vaisseau avec un schéma de flux sanguin divergent et enregistrez une vidéo de 30 secondes. Répétez l’enregistrement dans le même champ de vision à l’aide du filtre Rhodamine réglé pour visualiser les leucocytes.

Pour localiser les régions capillaires d’intérêt, utilisez le jeu de filtres FITC pour identifier une zone d’alvéoles et de capillaires non recoupée par des vaisseaux plus grands et enregistrez une vidéo de 30 secondes. Répétez l’enregistrement dans le même champ de vision à l’aide du filtre Rhodamine réglé pour visualiser les leucocytes. Cette vidéo illustre l’imagerie FITC du flux sanguin dans un stade pulmonaire, comme l’indique la flèche verte.

L’imagerie à la rhodamine permet de visualiser les leucocytes dans le même lieu avec deux leucocytes adhérents indiqués par les flèches rouges. Ces méthodes ont également été appliquées pour visualiser les mêmes phénomènes et les mêmes artères pulmonaires et régions capillaires d’intérêt. Pour démontrer la quantification des paramètres microcirculatoires, des souris ont été traitées avec du LPS intranasal pour induire une inflammation pulmonaire.

Le trafic de leucocytes dans les sites pulmonaires est montré ici avec des zones décrites représentant les régions endothéliales analysées chez des souris naïves et traitées au LPS. L’adhésion et le roulement des leucocytes ont augmenté chez les souris traitées au LPS. Le trafic de leucocytes dans les artères pulmonaires est montré ici avec des zones décrites représentant les régions endothéliales analysées chez des souris naïves et traitées au LPS.

L’adhésion des leucocytes était plus élevée chez les souris traitées au LPS. Cette figure montre l’adhésion des leucocytes dans les capillaires pulmonaires chez des souris naïves et traitées au LPS. L’adhésion des leucocytes s’est avérée plus élevée chez les souris traitées par LPS que chez les souris naïves.

Cette figure montre la perfusion de capillaires pulmonaires chez des souris naïves et traitées par LPS. Il a été démontré que la densité capillaire fonctionnelle était plus faible chez les souris traitées au LPS que chez les souris naïves. Il y a beaucoup d’aspects difficiles de ce protocole.

L’optimisation du positionnement de la souris sur la plate-forme est une étape simple qui peut rendre les étapes chirurgicales et d’imagerie beaucoup plus reproductibles. Cette procédure est adaptable à un large éventail de paramètres d’étude et d’approches de microscopie. Par conséquent, il devrait faciliter la poursuite de la recherche sur la microcirculation pulmonaire dans les états sains et malades.