Name: Élevage de masse et études moléculaires chez les insectes nuisibles tortricidae (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-03-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 22 s
Description: Apprenez l'élevage de masse et l'extraction d'acides nucléiques chez les insectes tortricidae nuisibles. Ces méthodes permettent d'étudier la biologie moléculaire et d'améliorer la gestion des ravageurs agricoles.

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Les auteurs souhaitent reconnaître le soutien de la Société japonaise pour la promotion de la science (JSPS) Bourses de recherche pour jeunes scientifiques [numéro de subvention 19J13123 et 21J00895].

1. Collecte d’insectes et élevage de masse
<ol><li>Collectez des insectes tortricides dans les champs en suivant les références 8,12 publiées précédemment. REMARQUE : Les larves de H. magnanima et d’A. honmai sont prélevées sur des feuilles de thé endommagées (figure 1A); les adultes sont attirés par la lumière UV portable de 4 W (longueur d’onde de 365 nm, voir tableau des matériaux, figure 1B).</li>
	<li>Élevez les larves recueillies (Figure 1C,D) individuellement sur un morceau de régime artificiel dans une tasse de 1/2 oz pendant 2-3 semaines jusqu’à l’éclosion adulte (Figure 1E,F). Confirmer le sexe des nymphes et des adultes par des traits morphologiques (Figure 1G,I).</li>
	<li>Accoupler les mâles et les femelles dans une boîte en plastique (30 cm x 20 cm x 5 cm) pour ovipositer des masses d’œufs sur un papier paraffine (Figure 1J-L). Placez une femelle et deux mâles dans un gobelet en plastique de 120 ml avec un morceau de papier paraffine pour établir une matriline. REMARQUE: Il est important de faire des plis sur le papier paraffine. Pour H. magnanima, le papier paraffine doit être au fond du boîtier. Pendant ce temps, pour A. honmai, mettez un papier sur le plafond du boîtier pour collecter les œufs (Figure 1L) puisque H. magnanima oviposit la masse d’œuf sur la face supérieure des feuilles de thé, mais A. honmai pond des œufs sur la face inférieure des feuilles8. Les procédures ont également été vérifiées chez d’autres espèces de tortricides, et il est préférable de placer des papiers des deux côtés si l’écologie et le comportement des espèces cibles ne sont pas clarifiés.</li>
	<li>Découpez les masses d’œufs (environ 100 à 200 œufs par masse d’œuf12, figure 1M) sur le papier paraffine avec des ciseaux. Placez les œufs dans une tasse de 1/2 oz avec du papier jeté pendant 5 à 7 jours. REMARQUE : L’embryon mature présente une capsule de points noirs (Figure 1N). Les périodes d’embryogenèse sont diversement attribuées aux espèces de tortricides, mais généralement 5 jours après la ponte (dpo) pour H. magnanima et 4 dpo pour A. honmai à 25 °C avec 60% d’humidité relative, 16 h de lumière/8 h de cyclessombres 7.</li>
	<li>Conservez les masses d’œufs montrant des capsules de tête noire à 4-8 ° C pendant 7 jours.</li>
	<li>Trancher ~ 60 g de régimes artificiels à l’aide d’une râpe pour l’élevage de masse. Placez la masse d’œufs remplie d’embryons mûrs sur le régime artificiel tranché dans un récipient en plastique (23 cm x 16 cm x 8 cm). Placez des papiers de paraffine sur la masse d’œufs avec les régimes tranchés (Figure 10). REMARQUE: Une humidité relative inférieure à 30% est considérée comme trop sèche, tandis que plus de 70% est trop humide. Créer des trous sur le couvercle du récipient en plastique est préférable pour permettre une meilleure ventilation. Remplissez les trous avec du coton pour empêcher les fuites de petites larves.</li>
	<li>Pour éliminer les contaminants de surface des œufs, faire tremper la masse d’œufs dans une solution de formol à 3 % et de chlorure de benzalkonium à 0,2 % pendant 5 min, respectivement12. Pour éradiquer les bactéries intestinales ou intracellulaires, utilisez un régime artificiel complété par du chlorhydrate de tétracycline à 0,05 % (p/p) ou de rifampicine à 0,06 % (p/p) au lieu d’un régime artificiel normal (voir tableau des matériaux). REMARQUE : cette étape est facultative. Il est important de pétrir Silk Mate 2S et 0,05% (p / p) de chlorhydrate de tétracycline ou 0,06% (p / p) de rifampicine de manière égale pour la consistance.</li>
	<li>Recueillir les nymphes dans le récipient en plastique et distinguer le sexe en fonction de12 caractéristiques morphologiques (Figure 1G-I). REMARQUE: Généralement, les tortricides présentent 5-6 instars jusqu’à la nymphose12. Les larves de H. magnanima et d’A. honmai prennent respectivement 3 semaines et 2 semaines après l’éclosion jusqu’à la nymphose.</li>
	<li>Placez 15 mâles et 10 femelles dans une boîte en plastique (30 cm x 20 cm x 5 cm, Figure 1K) pour l’accouplement à 25 °C, 16 L/8 D. Prélevez les œufs tous les 5-7 jours et répétez les étapes 1.4-1.9. pour chaque génération. REMARQUE: Si la collecte de masses d’œufs nouvellement ovipositifs pour une analyse ultérieure est nécessaire, définissez le début et la fin de la période sombre, par exemple de 9 h à 17 h. Dans cette condition, H. magnanima et A. honami oviposit généralement des œufs après 5 h (14 h).</li>
</ol>2. Séparation des œufs et des larves pharate des masses d’œufs pour la fixation, la perméabilisation et la coloration
<ol><li>Faire tremper la masse d’œufs dans 1 000 μL de solution aqueuse d’hypochlorite de sodium à 1,2 % pendant 10 min ou dans 1 000 μL de solution aqueuse d’hydroxyde de potassium 5 M pendant 30 min pour séparer les œufs.</li>
	<li>Laver les œufs séparés dans 1 000 μL de PBSt (137 mM NaCl, 8,1 mM Na2HPO4, 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 0,05 % de polyoxyéthylène (20) monolaurate de sorbitan [Tween-20] pH 7,4, voir table des matières) à la suite du rapport publié précédemment7.</li>
	<li>Faire tremper les œufs dans un mélange de 500 μL de solution à 100 % d’heptane et de 500 μL de solution de paraformaldéhyde-PBSt à 4 % (p/v). Mélanger pendant 10 min à 1 500 tr/min à l’aide d’un mélangeur vortex.</li>
	<li>Faire tremper les œufs dans un mélange de 500 μL de 100 % d’heptane et de 500 μL de 100 % de méthanol. Mélanger pendant 10 min à 1 500 tr/min.</li>
	<li>Laver les œufs deux fois avec 1 000 μL de méthanol à 100 % et les conserver à 4 °C dans du méthanol à 100 % jusqu’à ce que d’autres expériences soient effectuées (figure 2A). REMARQUE: Les œufs peuvent être conservés pendant au moins 1 an à 4 °C.</li>
	<li>Faire tremper les œufs séquentiellement dans de l’éthanol à 99 %, 70 %, 50 % et PBSt pendant 5 min chacun pour l’hydrophilisation à la suite du rapport7 publié précédemment.</li>
	<li>Lavez les œufs avec du PBSt, immergez-les dans 1 μg/mL de solution de DAPI pendant 5 min, puis lavez les œufs avec 1x PBS deux fois. Faire tremper les œufs dans 20 μL de solution d’orcéine lactique-acétique à 1,25 % (p/p) (voir Tableau des matériaux)11 pour visualiser l’hétérochromatine jusqu’à ce que les noyaux présentent une couleur rouge brillant (cela varie de 5 à 60 min) (Figure 2B, C). REMARQUE: Les périodes de coloration lactique-acétique de l’orcéine dépendent de la température et de l’humidité. Il est préférable de vérifier la coloration appropriée à l’aide d’un microscope avec un grossissement 4x-10x.</li>
	<li>Transférer les œufs tachés à l’aide d’une pipette sur une lame de verre. Entourer les œufs colorés d’un réactif antifade (voir Tableau des matériaux) et d’un verre de couverture7.</li>
	<li>Extraire les larves de H. magnanima et d’A. honmai (4 à 5 jours après la ponte (dpo)) des masses d’œufs à l’aide d’une pince (Figure 2D). Couper les larves en deux sur une lame de verre (Figure 2E).</li>
	<li>Fixez tous les tissus (p. ex., ganglion sous-œsophagien, ganglions thoraciques, tubule malpighien, etc.) avec un mélange de 1:3 (v/v) 99,7 % d’acide acétique et de méthanol à 100 % pendant 5 min. Colorez ceux qui ont une solution d’orcéine lactique-acétique11 à 1,25% (p / p) jusqu’à ce que les noyaux soient colorés (cela peut prendre 5 à 60 minutes, selon la température et l’humidité).</li>
	<li>Déterminer le sexe de chaque spécimen en observant la présence (femelle) ou l’absence (mâle) d’hétérochromatine (le chromosome W, Figure 2F,G) au microscope. REMARQUE: Le sexe est déterminé en visualisant la chromatine sexuelle. Chaque cellule représente la chromatine sexuelle sous forme de point chez les femelles11,12, tandis que la partie restante des tissus larvaires pharates (non fixés) doit être immédiatement immergée dans le tampon de lyse cellulaire12 (10 mM Tris-HCl, 100 mM EDTA et 1% SDS, pH 8,0) ou des réactifs d’extraction d’ARN contenant du phénol pour l’extraction de l’ADN ou de l’ARN. Avant les dissections, distribuer à l’avance 20 μL des réactifs dans des tubes PCR de 0,2 mL (figure 3A). Immerger et conserver les échantillons à -80 °C jusqu’à une extraction ultérieure. Les échantillons peuvent être conservés pendant au moins 3 mois, mais il est préférable de procéder aux expériences en aval pour éviter la dégradation des acides nucléiques.</li>
</ol>3. Extractions d’ADN et d’ARN de larves pharate déterminées par le sexe
<ol><li>Regrouper 12 larves de pharate mâle ou femelle déterminées par le sexe (embryon de 5 dpo) et ajouter un tampon de lyse cellulaire ou des réactifs d’extraction d’ARN (voir l’étape 2.11 et la table des matières) dans un tube de 1,5 mL. REMARQUE: Suivez les étapes 3.2-3.7 pour l’extraction de l’ADN et les étapes 3.8-3.11 pour l’extraction de l’ARN.</li>
	<li>Homogénéiser les tissus dans 600 μL du tampon de lyse cellulaire (10 mM tris-HCl, 100 mM EDTA et 1 % de FDS, pH 8,0), et centrifuger les échantillons à 10 000 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Recueillir le surnageant (500 μL) à l’aide d’une pipette et incuber à 50 °C avec 1,5 μL de protéinase K (20 mg/mL, voir Tableau des matériaux) pendant 5 h sur un bloc thermique.</li>
	<li>Traiter les échantillons avec 1,0 μL de 10 mg/mL de solution de RNase (voir tableau des matériaux) à 37 °C pendant 30 min.</li>
	<li>Ajouter 200 μL de solution de précipitation protéique (voir tableau des matériaux) dans les tubes7, puis une centrifugeuse à 17 000 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Mélanger le surnageant (500 μL) avec 500 μL d’isopropanol à 100 %, puis centrifuger à 20 400 x g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Lavez l’ADN granulé deux fois avec 1 000 μL d’éthanol à 70 %. Ensuite, sécher à l’air libre (5-10 min à température ambiante), dissoudre l’ADN dans 30 μL de tampon Tris-Cl de 10 mM (pH 8,5).</li>
	<li>Homogénéiser les tissus dans 600 μL de réactifs d’extraction d’ARN et ajouter 240 μL d’eau distillée ultra-pure au tube. Centrifuger les tubes à 12 000 x g pendant 15 min à 4 °C.</li>
	<li>Mélanger le surnageant (600 μL) avec 600 μL d’isopropanol à 100 % et transférer le mélange dans une colonne de spin de silice (voir Tableau des matériaux). Centrifuger les tubes à 17 900 x g pendant 1 min à 4 °C.</li>
	<li>Lavez la colonne avec 750 μL d’éthanol à 70 % et centrifugez la colonne deux fois à 17 900 x g pendant 1 min chacune à 4 °C.</li>
	<li>Chargez 15 μL d’eau distillée ultra-pure dans la colonne. Centrifuger les tubes à 17 900 x g pendant 1 min à 4 °C pour éluer l’ARN.</li>
	<li>Calculez et vérifiez la qualité et la quantité d’ADN et d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre UV. Évaluer la pureté des acides nucléiques à l’aide des rapports A260/A280 (acides nucléiques/protéines) et A260/A230 (acides nucléiques/sels et autres contaminants)13. REMARQUE : Pour l’extraction de l’ARN, la procédure12 publiée précédemment a été suivie, ce qui a entraîné une contamination par le phénol (tableau 1). L’ADN et l’ARN extraits d’un seul embryon ou de larves pharates donnent des échantillons de faible quantité et de mauvaise qualité. En règle générale, l’extraction de l’ADN de 12 larves pharate donne 100 à 600 ng, tandis que l’extraction de l’ARN à l’aide de la méthode actuelle génère 900 à 1 500 ng, comme le montre le tableau 1. REMARQUE : Les étapes 3.13 à 3.15 sont facultatives pour d’autres essais de séquençage à haut débit.</li>
	<li>Calculez les quantités d’ADN et d’ARN à l’aide d’un spectrophotomètre basé sur la fluorescence. REMARQUE : Le rapport des quantités d’ARN (concentration à base d’UV (ng/μL)/concentration à base de fluorescence (ng/μL)) a été calculé pour évaluer la qualité en vue d’une application expérimentale ultérieure. Par exemple, lorsque les concentrations d’UV et de fluorescence sont respectivement de 80 ng/uL et de 60 ng/uL, le rapport sera de 1,5 (80/60). Habituellement, les rapports inférieurs à 1,5 indiquent une pureté suffisante pour les applications en aval utilisant le séquençage à haut débit13.</li>
	<li>Analyser la qualité de l’ARN à l’aide de l’électrophorèseà micropuce 14.</li>
	<li>Utilisez les ARN qualifiés pour préparer la bibliothèque d’ARN à l’aide d’un kit de préparation de bibliothèque d’ARN (voir Tableau des matériaux). Séquencez les bibliothèques à l’aide d’une plate-forme adaptée aux bibliothèques préparées.</li>
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<ol><li>Gaston, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+magnitude+of+global+insect+species+richness%5BTitle%5D)+AND+%22Conservation+Biology%22%5BJournal%5D)">The magnitude of global insect species richness.</a> Conservation Biology. 5 (3), 283-296 (1991).</li>
<li>Pogue, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+world+revision+of+the+genus+Spodoptera+Guen%C3%A9e+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Memoirs+of+the+American+Entomological+Society%22%5BJournal%5D)">A world revision of the genus Spodoptera Guenée (Lepidoptera: Noctuidae).</a> Memoirs of the American Entomological Society. 43, 1(2002).</li>
<li>Matsuura, H., Naito, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+cold-hardiness+and+overwintering+of+Spodoptera+litura+F.+%28Lepidoptera%3A+Noctuidae%29%3A+VI.+Possible+overwintering+areas+predicted+from+meteorological+data+in+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Entomology+and+Zoology%22%5BJournal%5D)">Studies on the cold-hardiness and overwintering of Spodoptera litura F. (Lepidoptera: Noctuidae): VI. Possible overwintering areas predicted from meteorological data in Japan.</a> Applied Entomology and Zoology. 32 (1), 167-177 (1997).</li>
<li>Mita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+construction+of+an+EST+database+for+Bombyx+mori+and+its+application%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The construction of an EST database for Bombyx mori and its application.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100 (24), 14121-14126 (2003).</li>
<li>Kawamoto, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-quality+genome+assembly+of+the+silkworm%2C+Bombyx+mori%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">High-quality genome assembly of the silkworm, Bombyx mori.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 107, 53-62 (2019).</li>
<li>Fukui, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+masculinizing+function+of+the+Ostrinia+furnacalis+Masculinizer+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">In vivo masculinizing function of the Ostrinia furnacalis Masculinizer gene.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 503 (3), 1768-1772 (2018).</li>
<li>Arai, H., Ishitsubo, Y., Nakai, M., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+to+disperse+eggs+from+lepidopteran+scale-like+egg+masses+and+to+observe+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Entomological+Science%22%5BJournal%5D)">A simple method to disperse eggs from lepidopteran scale-like egg masses and to observe embryogenesis.</a> Entomological Science. 25 (1), 12497(2022).</li>
<li>vander Geest, L. P., Evenhuis, H. H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3avander+Geest%2C+LP+%22Tortricid+pests%3A+their+biology%2C+natural+enemies+and+control%22">Tortricid pests: their biology, natural enemies and control</a>. , Elsevier Science Publishers. Amsterdam. (1991).</li>
<li>Kiuchi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+female-specific+piRNA+is+the+primary+determiner+of+sex+in+the+silkworm%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single female-specific piRNA is the primary determiner of sex in the silkworm.</a> Nature. 509 (7502), 633-636 (2014).</li>
<li>Rand, M. D., Kearney, A. L., Dao, J., Clason, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeabilization+of+Drosophila+embryos+for+introduction+of+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochemistry+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Permeabilization of Drosophila embryos for introduction of small molecules.</a> Insect Biochemistry and Molecular Biology. 40 (11), 792-804 (2010).</li>
<li>Kageyama, D., Traut, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposite+sex-specific+effects+of+Wolbachia+and+interference+with+the+sex+determination+of+its+host+Ostrinia+scapulalis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+Royal+Society+B%22%5BJournal%5D)">Opposite sex-specific effects of Wolbachia and interference with the sex determination of its host Ostrinia scapulalis.</a> Proceedings of the Royal Society B. 271 (1536), 251-258 (2004).</li>
<li>Arai, H., Lin, S. R., Nakai, M., Kunimi, Y., Inoue, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Closely+related+male-killing+and+nonmale-killing+Wolbachia+strains+in+the+oriental+tea+tortrix+Homona+magnanima%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Ecology%22%5BJournal%5D)">Closely related male-killing and nonmale-killing Wolbachia strains in the oriental tea tortrix Homona magnanima.</a> Microbial Ecology. 79 (4), 1011-1020 (2020).</li>
<li>Schalamun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+MinION%3A+An+example+of+how+to+establish+long-read+sequencing+in+a+laboratory+using+challenging+plant+tissue+from+Eucalyptus+pauciflora%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Resources%22%5BJournal%5D)">Harnessing the MinION: An example of how to establish long-read sequencing in a laboratory using challenging plant tissue from Eucalyptus pauciflora.</a> Molecular Ecology Resources. 19 (1), 77-89 (2019).</li>
<li>Winnebeck, E. C., Millar, C. D., Warman, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+insect+RNA+look+degraded%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Why does insect RNA look degraded.</a> Journal of Insect Science. 10 (1), 159(2010).</li>
<li>Ivey, C. T., Carr, D. E., Eubanks, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inbreeding+in+Mimulus+guttatus+on+tolerance+to+herbivory+in+natural+environments%5BTitle%5D)+AND+%22Ecology%22%5BJournal%5D)">Effects of inbreeding in Mimulus guttatus on tolerance to herbivory in natural environments.</a> Ecology. 85 (2), 567-574 (2004).</li>
<li>Saccheri, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+and+extinction+in+a+butterfly+metapopulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inbreeding and extinction in a butterfly metapopulation.</a> Nature. 392 (6675), 491-494 (1998).</li>
<li>Crnokrak, P., Roff, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+depression+in+the+wild%5BTitle%5D)+AND+%22Heredity%22%5BJournal%5D)">Inbreeding depression in the wild.</a> Heredity. 83 (3), 260-270 (1999).</li>
<li>Keller, L. F., Waller, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inbreeding+effects+in+wild+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Inbreeding effects in wild populations.</a> Trends in Ecology & Evolution. 17 (5), 230-241 (2002).</li>
<li>Margaritis, L. H., Kafatos, F. C., Petri, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+of+Drosophila+melanogaster.+I.+Fine+structure+of+the+layers+and+regions+of+the+wild-type+eggshell%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The eggshell of Drosophila melanogaster. I. Fine structure of the layers and regions of the wild-type eggshell.</a> Journal of Cell Science. 43 (1), 1-35 (1980).</li>
<li>Sugimoto, T. N., Ishikawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+male-killing+Wolbachia+carries+a+feminizing+factor+and+is+associated+with+degradation+of+the+sex-determining+system+of+its+host%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Letters%22%5BJournal%5D)">A male-killing Wolbachia carries a feminizing factor and is associated with degradation of the sex-determining system of its host.</a> Biology Letters. 8 (3), 412-415 (2012).</li>
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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Tortricid comprend plusieurs ravageurs agricoles et forestiers; la présente étude a présenté des méthodes pour élever la tortrix au fil des générations, observer l’embryogenèse et le sexe des insectes, et effectuer une analyse moléculaire à l’aide d’embryons matures.
L’un des obstacles à l’étude des insectes nuisibles est d’établir des méthodes d’élevage. En particulier, la consanguinité affecte parfois négativement la condition physique de l’espèce. La réduction de la condition physique par l...

Les insectes lépidoptères représentent plus de 10 % de toutes les espèces vivantes décrites1, et certaines espèces de taxons causent de graves dommages aux plantes et de graves pertes agricoles 2,3. Bien que des études moléculaires et génétiques aient été développées à l’aide d’insectes modèles tels que le ver à soie Bombyx mori 4,5, les insectes nuisibles n’ont pas encore fait l’objet d’enquêtes, en partie à cause des difficultés d’élevage et de manipulation 6,7. Par conséquent, des études et des techniques fondamentales sont nécessaires pour comprendre la biologie de ces insectes nuisibles non modèles.
Les Tortricidae (Lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers8. Parmi les taxons d’insectes, la tortrix de thé orientale Homona magnanima Diakonoff et la tortrix de fruits d’été Adoxophyes honmai Yasuda sont de graves ravageurs polyphages connus pour endommager les théiers en Asie de l’Est7. Les deux espèces pondent des grappes d’œufs plates et ovales en forme d’écailles (ou masses d’œufs) constituées d’œufs minces, mous et fragiles recouverts de sécrétions maternelles. Bien que les stades de l’embryogenèse soient cruciaux pour le développement des insectes et la détermination du sexe9, les structures des œufs empêchent une analyse plus approfondie de comprendre la biologie des insectes. Il est important de surmonter les difficultés pour une étude plus approfondie sur les ravageurs ovipositant une masse d’œufs aussi complexe.
Ici, pour comprendre la biologie des tortricides, des méthodes d’élevage de masse, des observations et des études moléculaires ont été développées à l’aide de A. honmai et H. magnanima. Tout d’abord, les méthodes d’élevage de masse maintiennent les deux tortricides sur 100 générations par consanguin. La séparation des œufs de la masse d’œufs concaténée en forme d’écailles a facilité l’observation de l’embryogenèse des tortricides à l’aide de solvants alcalins et organiques précédemment développés à partir de techniques utilisées chez les mouches10. En outre, la présente étude a établi la discrimination sexuelle des petits embryons en développant des méthodes de coloration de la chromatine sexuelle des femelles lépidoptères utilisant l’orcéine lactique-acétique11. En combinant ces méthodes, des acides nucléiques de haute qualité et de grande quantité ont été extraits d’embryons déterminés par le sexe, ce qui était autrement difficile à établir6. L’ARN extrait a été utilisé pour le séquençage de nouvelle génération. Collectivement, les méthodes présentées ici s’appliquent à d’autres insectes lépidoptères et à d’autres taxons d’insectes.

<table><tbody><tr><td>tasse de 1/2 once</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070009</td><td>l’élevage d’insectes ; couvercle de tasse de https://www.askul.co.jp/p/6010417/</td></tr> 1<tr><td>/2 once</td><td>FP CHUPA</td><td>CP070011</td><td>l’élevage d’insectes ; https://www.askul.co.jp/p/6010434/?int_id=recom_DtTogether</td></tr><tr><td>99,7 % d’acide acétique</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon</td><td>36289</td><td>fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01ALF036289.html</td></tr><tr><td>Bioanalyseur Agilent 2100</td><td>Agilent Technologies</td><td>non montré</td><td>Quantification des acides nucléiques ; https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-instrument</td></tr><tr><td>Agilent RNA6000 nano kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td>Quantification des acides nucléiques ; https://www.agilent.com/cs/library/usermanuals/Public/G2938-90034_RNA6000Nano_KG .pdf</td></tr><tr><td>solution de chlorure de benzalkonium</td><td>Nihon Pharmaceutical Co., Ltd</td><td>No.4987123116046</td><td>Stérilisation ; https://www.nihon-pharm.co.jp/consumer/products/disinfection.html</td></tr><tr><td>Coton</td><td>AOUME</td><td>8-1611-02</td><td>élevage d’insectes ; https://item.rakuten.co.jp/athlete-med/10006937/?scid=af_pc_etc&sc2id=af_113_0_1</td></tr><tr><td>solution DAPI</td><td>Dojindo, Tokyo, Japon</td><td>340-07971</td><td>colorations ; https://www.dojindo.co.jp/products/D523/</td></tr> <tr><td>Hydrogénophosphate disodique</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Na2HPO4 ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0286.html</td></tr><tr><td>kit de quantification HS de l’ADNdb</td><td>Invitrogen</td><td>Q33231</td><td>Quantification des acides nucléiques ; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33230?SID=srch-srp-Q33230</td></tr><tr><td>colonne Econospin RNA II</td><td>Epoch Life Science Inc.</td><td>EP-11201</td><td>Extraction de l’ARN ; Éthanol http://www.epochlifescience.com/Product/SpinColumn/minispin.aspx</td></tr><tr><td></td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon</td><td>4.98748E+12</td><td>fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0105-0045.html</td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine-N,N,N',N'-tétraacétique Sel tétrasodique tétrahydraté (4NA)</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tampon de lyse cellulaire (EDTA) ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01T02N003.html</td></tr><tr><td>Papier cristal</td><td>HEIKO</td><td>2100010</td><td>l’élevage d’insectes ; https://www.monotaro.com/p/8927/0964/?utm_id=g_pla&amp ; utm_medium=cpc& utm_source= Bloc chauffant Adw</td></tr><tr><td>WSC-2620 PowerBLOCK</td><td>ATTO, Tokyo, Japon</td><td>4002620</td><td>incubation ; https://www.attoeng.site/</td></tr> <tr><td>heptane</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon</td><td>4.98748E+12</td><td>fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0108-0015.html</td></tr><tr><td>INSECTA LF</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>non illustré</td><td>Régime artificiel ; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>ISOGENII</td><td>Nippon Gene</td><td>311-07361</td><td>Extraction de l’ARN ;</td></tr><tr><td>https://www.nippongene.com/siyaku/product/extraction/isogen2/isogen2.html isopropanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Extraction d’acides nucléiques ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0232-0004.html</td></tr><tr><td>Acide lactique</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Colorations ;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0112-0005.html méthanol</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon</td><td>4.98748E+12</td><td>fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0113-0182.html</td></tr><tr><td>MSV-3500 vortex</td><td>Biosan</td><td>BS-010210-TAK</td><td>Mélangeur Voltex ; https://biosan.lv/products/-msv-3500-multi-speed-vortex/</td></tr><tr><td>Nano Photomètre NP 80</td><td>Implen</td><td>non montré</td><td>Quantification des acides nucléiques ; https://www.implen.de/product-page/implen-nanophotometer-np80-microvolume-cuvette-spectrophotometer/tech-specs/</td></tr> <tr><td>Natural pack wide</td><td>Inomata chemical</td><td>1859</td><td>insect harvesting ; https://www.monotaro.com/g/03035766/?t.q=%E3%83%8A%E3%83%81%E3%83%A5%E3 % 83 %A9 %E3%83 %AB %E3%83%91 % E3%83%83 %E3%82 %AF %E3%83 % AF %E3 % 82 %A4 %E3%83%89</td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II Kit de préparation de banque d’ARN pour Illumina</td><td>New England BioLabs</td><td>E7770S</td> Préparation de bibliothèque<td> ; https://www.nebj.jp/products/detail/2039</td></tr><tr><td>orcein</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Colorations ;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0115-0094.html Paraformaldéhyde</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>160-16061</td><td>fixation ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-1606.html</td></tr><tr><td>polyoxyéthylène(20) monolaurate de sorbitan</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tween-20 ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-2121.html</td></tr><tr><td>Lumière noire UV portable (4W, longueur d’onde 365nm)</td><td>Southwalker Co., Ltd., Kanagawa, Japon</td><td>non illustré</td><td>Collection d’insectes ; http://www.southwalker.com/shopping/?pid=1364614057-467328</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KCl ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0354.html</td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>KH2PO4 ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0116-0424.html</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Invitrogen, MA, USA</td><td>P36965</td><td>anti-effacement ; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/P36965</td></tr><tr><td>Proteinase K Solution</td><td>Merck</td><td>71049-4CN</td><td>Extraction d’ADN ; https://www.merckmillipore.com/JP/ja/product/Proteinase-K-Solution-600-mAU-ml,EMD_BIO-71049</td></tr><tr><td>solution de précipitation de protéines</td><td>Qiagen</td><td>158912</td><td>extraction de l’ADN ; https://www.qiagen.com/us/products/discovery-and-translational-research/lab-essentials/buffers-reagents/puregene-accessories/?cmpid=PC_DA_NON_ BIOCOMPARE_ProductListing_ 0121_RD_MarketPlace_ProductC</td></tr><tr><td>Qubit V4</td><td>Invitrogen</td><td>Q33238</td><td>Quantification des acides nucléiques ; https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q33238</td></tr><tr><td>rifampicine</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon</td><td>4.98748E+12</td><td>Stérilisation ;</td></tr><tr><td>https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0118-0100.html Kit de quantification de l’ARN HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32855</td><td>Quantification des acides nucléiques ; solution https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/Q32852</td></tr><tr><td>RNase</td><td>Nippon Gene</td><td>313-01461</td><td>Extraction de l’ARN ; https://www.nippongene.com/siyaku/product/modifying-enzymes/rnase-a/rnase-s.html</td></tr><tr><td>Silk Mate 2S</td><td>Nosan Co., Ltd</td><td>non illustré</td><td>Régime artificiel ; https://www.nosan.co.jp/business/fodder/ist.htm</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>NaCl ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0166.html</td></tr><tr><td>Dodécylsulfate de sodium</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tampon de lyse cellulaire (FDS) ;</td></tr><tr><td>solution aqueuse d’hypochlorite de sodium</td> https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-1398.html <td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon</td><td>4.98748E+12</td><td>séparation des œufs ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0119-0220.html</td></tr><tr><td>Chlorhydrate de tétracycline</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co., Osaka, Japon</td><td>4.98748E+12</td><td>Stérilisation; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1656.html</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>FUJIFILM Wako Chemicals Co.</td><td>4.98748E+12</td><td>Tampon de lyse cellulaire ; https://labchem-wako.fujifilm.com/jp/product/detail/W01W0120-1536.html</td></tr><tr><td>extraction d’ARN 10977023 d’Invitrogen ultra-pure</td><td></td><td></td> ; <td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10977015</td></tr></tbody></table>

Élevage de masse et études moléculaires chez les insectes nuisibles tortricidae

Mass-Rearing and Molecular Studies in Tortricidae Pest Insects

Les tortricidae (lépidoptères), communément appelés tortrix ou tordeuses, comprennent de nombreux ravageurs agricoles et forestiers, qui causent de graves pertes agricoles. Pour comprendre la biologie de ces papillons nuisibles, les techniques fondamentales ont été très demandées. Ici, des méthodes d’élevage de masse, d’observations et d’études moléculaires sont développées à l’aide de deux tortrix de thé, Homona magnanima et Adoxophyes honmai (Lepidoptera: Tortricidae). Les insectes ont été élevés en masse avec un régime artificiel tranché et maintenus par consanguinité pendant plus de 100 générations en tenant compte de leurs caractéristiques biologiques. Les insectes ont divers dimorphismes sexuels; par conséquent, il est difficile de distinguer le sexe pendant les stades de développement, qui ont empêché les tests ultérieurs. Le présent travail a mis en évidence que le sexe des larves de tortricides pouvait être déterminé en observant les testicules ou la coloration lactique-acétique de l’orcéine pour visualiser le chromosome W spécifique à la femelle. De plus, en utilisant les méthodes de détermination du sexe, la présente étude a permis d’extraire des acides nucléiques d’embryons déterminés par le sexe et de les appliquer au séquençage à haut débit. Ces conseils sont applicables à d’autres insectes nuisibles et faciliteront d’autres études morphologiques et génétiques.

Mise en place des lignes hôtes et leur maintenance La viabilité des larves collectées sur le terrain est attribuée différemment à l’emplacement, aux saisons et aux conditions d’élevage sur le terrain (p. ex., 90 % de la viabilité à Taïwan, Taoyuan, comme le montrent Arai et al.12). Environ 30% à 50% des paires généreront la prochaine génération comme d’habitude. Pour H. magnanima et A. honmai, les matrilines sont maintenues par consanguinité depuis plus de 100...

Le présent protocole décrit la méthode d’élevage des insectes ravageurs tortricides dans les laboratoires. Les procédures permettant de distinguer le sexe des insectes et d’extraire les acides nucléiques pour le séquençage à haut débit sont établies à l’aide de deux ravageurs tortricides.

Tortricidae (Lepidoptera), commonly known as tortrix or leafroller moths, comprises many agricultural and forestry pests, which cause serious agricultural ...

Nous présentons des masses fondamentales, mais très demandées pour l’élevage de masse, des observations et des études moléculaires utilisant des masses de Tortrix nuisibles graves, pour étudier leur biologie. Jusqu’à présent, la structure des œufs d’insectes a empêché une analyse plus approfondie. Nous avons notamment permis l’étude d’ovules fins, mous et fragiles recouverts de sécrétion maternelle.Il existe des techniques simples qui devraient être applicables pour d’autres recherches sur la tortrix, en essayant d’autres insectes et d’autres taxons. Commencez par placer une femelle et deux mâles dans un gobelet en plastique de 120 millilitres avec un morceau de papier paraffine pour établir une ligne Matra. Trancher environ 60 grammes de régimes artificiels à l’aide d’une râpe pour l’élevage de masse.Placez la masse d’œufs remplie d’embryons matures sur le régime artificiel tranché dans un récipient en plastique. Placez des papiers de paraffine sur la masse d’œufs avec les régimes tranchés. Placez 15 mâles et 10 femelles dans une boîte en plastique pour l’accouplement à 25 degrés Celsius.Recueillez les œufs tous les cinq à sept jours et répétez les étapes d’élevage en masse pour c

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