Mise en place de xénogreffes de poisson zèbre provenant de patients atteints d’un cancer du pancréas pour des tests de chimiosensibilité

La xénogreffe dérivée de patients de poisson zèbre est un modèle préclinique puissant pour prédire le profil de chimiosensibilité des patients atteints de cancer in vivo. Le protocole décrit la génération du modèle à partir d’un échantillon chirurgical de patient. En xénogreffant un petit fragment de tissu plutôt que d’isoler des cellules dans des embryons de poisson zèbre, il est possible de maintenir le microenvironnement tumoral qui est l’étape cruciale pour la progression tumorale et la réponse à la chimiothérapie.

Le grand avantage du modèle est donné par son potentiel à prédire le pronostic du patient dans un délai clinique pertinent de seulement une semaine agissant comme un outil pour la médecine personnalisée. Commencez le traitement de l’échantillon en lavant tout le tissu tumoral prélevé sur le patient avec cinq millilitres de milieu tumoral frais. Pipeter de haut en bas 10 fois à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique.

Aspirer soigneusement et jeter le produit de lavage avant de répéter le lavage trois fois. Immergez l’échantillon dans un à deux millilitres de milieu tumoral frais. Coupez l’échantillon tumoral en morceaux cubes d’un à deux millimètres à l’aide d’une lame de scalpel, puis placez-les dans un tube en plastique stérile de cinq millilitres avec un milieu tumoral.

Après avoir réglé le McIlwain Tissue Chopper à 100 micromètres d’épaisseur, placez les morceaux tumoraux sur la table circulaire en plastique du hachoir et hachez-les. Faites pivoter la table de 90 degrés et répétez le hachage. Recueillir les fragments tumoraux hachés dans un tube en plastique de 15 millilitres contenant le milieu tumoral.

Centrifuger les fragments tumoraux hachés à 300 G pendant trois minutes avant d’aspirer et de jeter le surnageant. Incuber les fragments avec la solution de trace cellulaire ou avec un autre tracker cellulaire fluorescent tel que CM-DiI ou Deep Red pendant 30 minutes dans un bain-marie de 37 degrés Celsius. Pendant l’incubation, remettre doucement les fragments en suspension toutes les 10 minutes.

À la fin de la coloration, retirez tout colorant libre en ajoutant un milieu tumoral supplémenté en au moins 1% de protéines. Le volume sera cinq fois le volume de coloration. Centrifuger les fragments à 300 G pendant trois minutes et jeter le surnageant.

Ajoutez un millilitre de solution saline tamponnée au phosphate ou de DPBS de Dulbecco et répétez cette étape de lavage trois fois. Une fois cela fait, suspendez les fragments dans cinq millilitres de DPBS dans une boîte de Petri de 60 millimètres. Pour établir les xénogreffes dérivées de patients à base de poisson zèbre ou zPDX, anesthésiez les embryons deux jours après la fécondation.

Dans une boîte de Petri à trois cylindres d’agarose, posez un embryon de poisson zèbre sur un cylindre exposant un côté. Retirez l’excès de solution pour garder l’embryon dans un film mince. À l’aide de pinces stériles, transférer le morceau de fragments de tissu tumoral coloré d’une boîte de Petri de 60 millimètres au support 1% d’agarose où l’embryon est posé.

Ensuite, ramassez le tissu et placez-le sur le jaune d’embryon avant de le pousser dans l’espace périvitelline à l’aide de la micro-aiguille en verre tiré thermiquement. Ajouter quelques gouttes de streptomycine E3 1% pénicilline à l’embryon pour le ramener dans le liquide. Après avoir répété l’implantation du tissu tumoral dans tous les embryons, retirez les supports d’agarose de la boîte de Petri et incuber les embryons à 35 degrés Celsius.

Deux heures après l’implantation, vérifier les embryons pour les xénogreffes correctes avec coloration positive à l’aide d’un stéréomicroscope fluorescent. Jetez les embryons morts et les embryons sans les fragments tumoraux complètement à l’intérieur de l’espace périvitellin. Une fois cela fait, répartir au hasard les embryons dans six plaques multipuits, également divisées en groupes selon le plan expérimental.

Diluer les médicaments en les mélangeant dans E3 1%pen-streptocoque pour préparer le cocktail FOLFOXIRI. Après deux heures d’implantation, retirez le média de chaque puits et ajoutez le cocktail de médicaments. Placez les embryons dans l’incubateur à 35 degrés Celsius pendant trois jours avec des changements quotidiens du milieu pour renouveler les médicaments.

Pour l’imagerie, capturez des images sous un objectif 40X du microscope confocal. Utilisez la résolution de 1024 x 512 pixels avec un espacement Z de cinq micromètres. L’ensemble des images de montage de zPDX acquises pour analyser l’apoptose détectée dans le cyano a montré que la thérapie combinée augmentait l’apoptose cellulaire par rapport au groupe témoin.

L’étude de cas a rapporté qu’une augmentation statistiquement significative de la fraction de cellules apoptotiques dans les xénogreffes implantées a été identifiée pour le groupe traité par FOLFOXIRI par rapport au groupe témoin. Le protocole montre un exemple en utilisant du tissu cancéreux du pancréas, mais des xénogreffes dérivées de patients de poisson zèbre peuvent être établies à partir de différents types de cancer. De plus, le modèle ayant un faible impact éthique, il est facilement exploitable pour le criblage in vivo de nouveaux médicaments.

La méthode est techniquement difficile et nécessite un opérateur expert. Une expertise préalable dans la manipulation d’embryons de poisson zèbre et la micro-injection accélérera la formation de la technique.