Name: Effet de l’acide hyaluronique 35 kDa sur un modèle in vitro de lésion prématurée de l’intestin grêle prématuré et cicatrisation à l’aide de monocouches dérivées d’entéroïdes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 36 s
Description: Apprenez un test de migration cellulaire sur monocouches d'entéroïdes pour étudier la régénération intestinale prématurée. Cette méthode permet une visualisation en temps réel de la cicatrisation.

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Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. SC est soutenu par la subvention P20GM134973 des National Institutes of Health. KB est soutenu par une subvention de la Fondation de l’hôpital pour enfants (CHF) et de la Presbyterian Health Foundation (PHF). Les services d’imagerie de cellules vivantes fournis par le noyau de la génomique fonctionnelle du cancer ont été soutenus en partie par la subvention P20GM103639 du National Institute of General Medical Sciences et la subvention P30CA225520 du National Institutes of Health, attribuée au Stephenson Cancer Center de l’Université de l’Oklahoma.

Toutes les procédures animales de cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma. À la suite de l’approbation institutionnelle, des échantillons de commodité de l’intestin grêle fœtal provenant d’un primate prématuré non humain (PSN, gestation à 90 %, babouin olive, Papio anubis) ont été prélevés après l’euthanasie pour une étude distincte (Protocole #101523-16-039-I)20.
1. Établissement d’entéroïdes intestinaux 3D chez les primates non humains prématurés
<ol><li>Préparation des médias REMARQUE: Les milieux peuvent être préparés jusqu’à 1 semaine avant l’isolement de la crypte en suivant la technique aseptique standard. La pénicilline/streptomycine (concentration finale de 1 %) peut être utilisée à la place des antibiotiques à large spectre pour les cellules primaires si désiré.<ol><li>Préparer le milieu de croissance organoïde humain + Y-27632 (HOGMY) en mélangeant 50 mL de milieu de croissance organoïde basal humain avec 50 mL de supplément organoïde (Tableau des matériaux). Ajouter 200 μL d’antibiotiques à large spectre (concentration finale de 100 μg/mL) (Table des matières) et Y-27632 (jusqu’à une concentration finale de 10 μM). Chaud sur la paillasse à température ambiante.</li>
		<li>Préparer le milieu de croissance organoïde humain (HOGM) en mélangeant 50 mL de milieu de croissance organoïde basal humain avec 50 mL de supplément organoïde. Ajouter 200 μL d’antibiotiques à large spectre (100 μg/mL). Chaud sur la paillasse à température ambiante. REMARQUE: HOGM sera utilisé lors du changement de support au-delà des 2-3 premiers jours après le passage.</li>
		<li>Refroidir 100 mL de 1x solution saline tamponnée au phosphate (PBS) sans calcium ni magnésium jusqu’à ce qu’elle soit glacée.</li>
		<li>Préparer 50 ml de tampon de lavage en combinant 1x PBS sans calcium ni magnésium avec 0,1% d’albumine sérique bovine (BSA). Refroidissez-le jusqu’à ce qu’il soit glacé.</li>
		<li>Préparer le tampon de lavage DMEM-F12 en ajoutant 1 mL d’antibiotiques à large spectre (100 μg/mL) à 500 mL de DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Jam’s Mixture F12 + 15 mM HEPES buffer). Gardez-le glacé.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolation et placage de cryptes REMARQUE: L’hydrogel à base de matrice extracellulaire (ECM) doit rester sur la glace pendant toute la procédure. Cette procédure suppose suffisamment de tissu pour remplir six dômes d’hydrogel à base d’ECM. Si une densité différente de cryptes est récoltée, le numéro du dôme doit être modifié en conséquence.<ol><li>Décongeler 150 μL d’extrait membranaire basal (BME) (sans phénol) à facteur de croissance réduit (DFG) pendant la nuit sur la glace à une température de 2 à 8 °C.</li>
		<li>Incuber une plaque de polystyrène à fond plat de 24 puits, traitée par culture tissulaire dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pendant au moins 30 minutes avant utilisation.</li>
		<li>Après l’euthanasie des PSN et le prélèvement de tissus, rincer le segment iléon des débris avec un embout de pipette de 1 000 μL en utilisant 1x PBS glacé dans une boîte de Petri jetable. REMARQUE : Les tissus frais doivent être récoltés rapidement et conservés au froid glacé pour récolter des entéroïdes sains.</li>
		<li>Couper l’iléon longitudinalement le long de tout l’intestin et laver avec du PBS glacé 3x. Hacher le tissu en petits fragments (environ 2 mm de longueur) avec des ciseaux stériles sur un tube conique de 50 mL contenant 15 mL de PBS glacé, en partant de la partie du segment iléal la plus proche du tube.</li>
		<li>Utilisez une pipette sérologique de 10 ml pour perturber les cryptes en pipetant de haut en bas 5-10x. Laissez les segments de tissu se déposer au fond du tube, puis retirez le surnageant et remplacez-le par du PBS frais et glacé. Répétez ce processus au moins 7x-10x jusqu’à ce que le surnageant soit clair et exempt de débris.</li>
		<li>Une fois clair, retirer le surnageant et remettre les cryptes en suspension dans 25 mL de réactif de dissociation cellulaire. Placez le tube sur une plate-forme à bascule à 20 tr / min pendant 15 min à température ambiante.</li>
		<li>Retirez le tube de la bascule, laissez les cellules se déposer pendant environ 30 s à 1 min et retirez le surnageant. Ajouter 10 ml de tampon de lavage glacé. Pipette de haut en bas avec une pipette p1000 pour se dissocier davantage en cryptes uniques.</li>
		<li>Filtrer le tissu à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube conique de 50 mL. Rincez le tube conique original de 50 ml avec 10 ml de tampon de lavage à froid glacé et filtrez à travers la passoire de 70 μm pour vous assurer que toutes les cryptes ont été retirées du tube d’origine. Répétez ce lavage des mouchoirs pour un total de 4x rinçages.</li>
		<li>Centrifuger le filtrat à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et retirer le surnageant. Ajouter 600 μL de HOGMY et perturber la pastille en pipetant de haut en bas avec une pipette de 200 μL. Placez le tube sur de la glace jusqu’à ce que la solution devienne glacée. REMARQUE: Si la solution n’est pas glacée, le dôme ne conservera pas la structure appropriée lorsqu’il est plaqué. Évitez d’introduire des bulles lors du pipetage des dômes d’hydrogel à base d’ECM, car les bulles empêcheront une bonne adhérence au fond de la plaque.</li>
		<li>Ajouter 600 μL d’hydrogel glacé à base d’ECM pour suspendre la pastille de cellule et bien mélanger avec une pipette de 200 μL.</li>
		<li>Retirez la plaque à 24 puits de l’incubateur et placez-la sur un chauffe-plaques à 37 °C. Pipeter 50 μL de mélange d’hydrogel glacé à base de HOGMY/ECM au centre de 24 puits d’une plaque de culture de 24 puits (50 μL par dôme).</li>
		<li>Une fois plaqués, laisser reposer les dômes sur une plaque chauffante à 37 °C pendant 1 min pour permettre l’adhérence au fond de la plaque. Retourner soigneusement la plaque, s’assurer qu’aucune condensation ne s’est accumulée au fond de la plaque et placer la plaque inversée dans l’incubateur à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
		<li>Après 15 min, tournez la plaque vers le haut et pipeter 750 μL de HOGMY à température ambiante dans chaque puits. REMARQUE: Pipette fluide lentement sur la paroi latérale des puits, en veillant à ne pas perturber le dôme d’hydrogel 3D à base d’ECM nouvellement formé.</li>
		<li>Une fois que tous les puits ont été remplis de média, placez la plaque dans l’incubateur et changez le média tous les 3 jours avec 750 μL de HOGM. Passage entéroïdes tous les 7-10 jours.</li>
	</ol></li>
	<li>Passage entéroïde intestinal REMARQUE : Le protocole suivant s’applique à une plaque de culture de 24 puits contenant des entéroïdes de PSN à un taux fractionné de 1:2.<ol><li>Retirer le milieu entéroïde de chaque puits, en prenant soin de ne pas perturber le dôme ECM contenant des entéroïdes, ajouter 500 μL de réactif de dissociation cellulaire glacée à chaque puits à l’aide d’une pipette de 1 000 μL et incuber à température ambiante pendant 1 min.</li>
		<li>Perturbez manuellement l’ECM en tuyant de haut en bas de 8 à 12x. Transférer le contenu de 12 puits dans un tube conique de 15 mL.</li>
		<li>Une fois que toute la solution a été recueillie dans la plaque de culture de 24 puits, ajouter 250 μL de réactif de perturbation cellulaire à chaque puits pour s’assurer que tous les entéroïdes de PSN ont été retirés de chaque puits, en ajoutant ce dernier rinçage aux tubes coniques existants de 15 mL.</li>
		<li>Placer sur une plate-forme à bascule à 40 tr/min pendant 15 min à température ambiante (20 °C). Sinon, agiter manuellement les tubes pendant 15 minutes à température ambiante.</li>
		<li>Après 15 min, centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant des tubes de 15 ml jusqu’à ce qu’il ne reste que la pastille.</li>
		<li>Ajouter 8 mL de DMEM glacé + antibiotiques à large spectre à un tube conique de 15 mL, en vous assurant que la pastille est suffisamment perturbée. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant.</li>
		<li>Ajouter 600 μL de HOGMY et perturber la pastille en pipetant de haut en bas avec une pipette de 1 000 μL. Placez le tube sur de la glace jusqu’à ce que la solution devienne glacée. Une fois que la solution est glacée, ajoutez 600 μL d’ECM glacé pour suspendre la pastille de cellule et bien mélanger avec une pipette de 1 000 μL. Répétez les étapes 1.3.2.-1.3.7. pour les 12 puits restants.<ol><li>Pour les étapes restantes, reportez-vous aux étapes 1.2.11.-1.2.16.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. Mise en place d’un essai de monocouche entéroïde et de plaie par rayure
<ol><li>Milieu et préparation du traitement<ol><li>Refroidir 5 mL de PBS sans calcium ni magnésium jusqu’à ce qu’ils soient glacés.</li>
		<li>Préparer le tampon de lavage DMEM-F12 en ajoutant 1 mL d’antibiotiques à large spectre (100 μg/mL) à 500 mL de DMEM/F12 (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Jam’s Mixture F12 + 15 mM HEPES buffer). Gardez la glace froide.</li>
		<li>Préparez 100 ml de HOGMY, tel que décrit à l’étape 1.1.1., et réchauffez-le sur la paillasse à température ambiante.</li>
		<li>Réchauffer 25 mL d’acide trypsine-éthylènediaminetétraacétique (EDTA) à 0,25 % dans un bain-marie à 37 °C.</li>
		<li>Préparer des concentrations de 50 μg/mL, 100 μg/mL et 200 μg/mL d’HA35 pour le traitement cellulaire, en utilisant du PBS stérile sans calcium ni magnésium comme solvant. La dilution finale de HA35 utilisera HOMGY comme solvant. REMARQUE: La préparation de HA35 peut nécessiter plusieurs dilutions, car HA35 sort souvent de la solution à une concentration supérieure à 5 mg / mL.</li>
	</ol></li>
	<li>Formation de monocouches entéroïdes REMARQUE : La procédure suivante fournit des volumes suffisants pour la génération d’une plaque de monocouches entéroïdes à 24 puits. Ajustez les volumes pour le nombre souhaité de monocouches.<ol><li>Décongeler 96 μL d’hydrogel BME (phénol sans rouge) à base d’ECM pendant une nuit sur la glace à une température de 2 à 8 °C. Diluer l’hydrogel à base d’ECM dans du PBS glacé sans calcium ni magnésium dans un rapport de 1:50. Enduisez chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits de 200 μL d’hydrogel dilué à base d’ECM glacé.</li>
		<li>Incuber la plaque enrobée d’hydrogel à base d’ECM pendant au moins 1 h à 37 °C et 5 % de CO2. Aspirer le milieu de la plaque de culture de 24 puits contenant les entéroïdes 3D destinés aux monocouches et les remplacer par 500 μL de réactif/puits de dissociation cellulaire.</li>
		<li>Perturbez manuellement les dômes d’hydrogel à base d’ECM en tuytant de haut en bas 8x-12x et transférez le contenu de 12 puits dans un tube conique de 15 mL.</li>
		<li>Lavez les 12 puits vides avec 250 μL de réactif de dissociation cellulaire pour vous assurer que tous les entéroïdes ont été éliminés et transférez le contenu dans un tube conique de 15 mL. Répétez l’étape 2.2.5. et l’étape 2.2.6. pour les 12 puits restants en utilisant un deuxième tube conique de 15 mL.</li>
		<li>Centrifuger les tubes coniques à 300 x g pendant 5 min à 4 °C et jeter le surnageant. Ajouter 10 mL de tampon de lavage DMEM-F12 glacé à des tubes coniques de 15 mL et suspendre les pastilles entéroïdes en retournant les tubes. Centrifuger à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles cellulaires dans 12 mL de trypsine-EDTA à 37 °C. Placer les tubes dans un bain-marie à 37 °C pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que les cellules semblent solubles. Ajouter 3 mL de tampon de lavage DMEM-F12 à chaque tube pour diluer la trypsine-EDTA, mélanger en retournant les tubes et placer sur de la glace.</li>
		<li>Filtrer les entéroïdes dissociés à travers une crépine à cellules maillées de 37 μM, en recueillant le contenu dans des tubes coniques propres de 15 mL. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Pendant que les cellules s’enrobent dans la centrifugeuse, retirez la plaque enduite d’hydrogel à base d’ECM de l’incubateur et aspirez tout excès de solution d’hydrogel à base d’ECM sans rayer la surface revêtue ou laisser la plaque sécher complètement.</li>
		<li>Retirer le surnageant des tubes coniques et remettre en suspension les pastilles cellulaires avec 6 mL de HOMGY. Ajouter 500 μL de la suspension cellulaire combinée de 12 mL HOMGY dans chaque puits de la plaque de 24 puits recouverte d’hydrogel à base d’ECM à une densité d’ensemencement d’environ 3 x 105 cellules/puits. Faites tourner la plaque avec un couvercle pour assurer une répartition uniforme des cellules dans les puits.</li>
		<li>Incuber la plaque à 37 °C et 5% de CO 2, en échangeant les milieux HOMGY tous les2 jours jusqu’à ce que les monocouches atteignent &gt;90% de confluence.</li>
	</ol></li>
	<li>Traitement monocouche et dosage des plaies par égratignures<ol><li>Une fois que les monocouches atteignent &gt;90% de confluence, aspirez le milieu pour éliminer toutes les cellules qui ne parviennent pas à se fixer. Traiter les cellules avec 500 μL de HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou de PBS, dissous dans HOMGY, pendant 24 h.</li>
		<li>Après 24 h, retirez le support en veillant à ne pas perturber la surface de la monocouche. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 μL, effectuez un grattage linéaire sur tout le diamètre de surface de la monocouche dans chaque puits, en prenant soin de ne pas laisser sécher les monocouches.</li>
		<li>Lavez les monocouches rayées 1x avec 500 μL de 1x PBS. Ajouter 500 μL de HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou de PBS dissous dans HOMGY et transférer la plaque dans l’instrument d’analyse des cellules vivantes (Tableau des matériaux) dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 .</li>
		<li>Sous l’icône Calendrier dans le logiciel d’analyse de cellules sous tension (Table des matériaux), cliquez sur l’icône Assistant Lancer l’ajout d’un nouveau navire et réglez la fréquence de balayage pour numériser selon un calendrier. Créez un nouveau vaisseau Puits entier sous Type de numérisation, spécifiez les paramètres de numérisation (c.-à-d. Phase pour les canaux d’image et 4x pour Objectif), puis cliquez sur Suivant.</li>
		<li>Sélectionnez le fabricant de la plaque et le numéro de catalogue dans la liste fournie. Sous l’icône Calendrier , choisissez le symbole plus où la plaque sera placée dans l’instrument d’analyse de cellules vivantes. Sélectionnez le modèle de numérisation souhaité, puis créez une carte de plaque en sélectionnant « + » sur la page Disposition de la plaque. Sélectionnez Reporter l’analyse à plus tard, puis définissez le calendrier d’analyse toutes les 4 heures pendant 24 heures et vérifiez les paramètres d’acquisition sous la page Résumé de l’assistant de navire . Enfin, sélectionnez Ajouter à la planification.</li>
		<li>Une fois le test 24 terminé, sous l’icône Affichage, double-cliquez sur Nom du navire et exportez des images et des films. Sélectionnez des puits et une série d’images à afficher et à exporter au format JPEG. Analysez les images pour le pourcentage de cicatrisation des plaies à l’aide du plug-in Wound Healing Size pour ImageJ21, conformément à l’étape 2.4. sous.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse des rayures<ol><li>Ouvrez le logiciel ImageJ. Téléchargez les images du test de plaie par égratignures (. TIFF ou .JPG).</li>
		<li>Sélectionnez Image &gt; Type &gt; 8 bits pour modifier l’image de RVB 24 bits en 8 bits. Installez le plugin Wound Healing Size en sélectionnant Plugins &gt; Macros &gt; Install &gt; Wound Healing Size Plugin.</li>
		<li>Faites pivoter l’image de sorte que la rayure soit verticale et initialisez le plug-in Wound Healing Size Tool.</li>
		<li>Sélectionnez les paramètres du plug-in dans la boîte de dialogue pour s’adapter au mieux à la plaie de rayure. Définissez la valeur des paramètres pour les options de taille de cicatrisation des plaies comme suit : Rayon de la fenêtre de variance à 20, Valeur de seuil à 100 et Pourcentage de pixels saturés à 0,001, puis choisissez Oui pour Définir l’échelle globale. Finalisez la sélection en cliquant sur le bouton OK. Vérifiez si la zone sélectionnée est la zone de la plaie. Les paramètres ci-dessus peuvent nécessiter une normalisation d’un laboratoire à l’autre.</li>
		<li>Répétez les étapes 2.4.2.-2.4.4. pour les points de temps restants pour chaque égratignure.</li>
		<li>Calculer le pourcentage de cicatrisation des cellules migrantes ou proliférantes sur 24 heures comme suit : % de cicatrisation = <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/63758/63758eq01.jpg" style="margin: auto;"> où T 0 = % Surface au temps 0 h et Tc = % Superficie à 0 h, 4 h, 12 h ou 24 h.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Roodsant, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+2D+primary+organoid-derived+epithelial+monolayer+model+to+study+host-pathogen+interaction+in+the+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A human 2D primary organoid-derived epithelial monolayer model to study host-pathogen interaction in the small intestine.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 272(2020).</li>
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<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+an+ex-vivo+model+of+host-pathogen+interactions+in+the+gastrointestinal+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as an ex-vivo model of host-pathogen interactions in the gastrointestinal tract.</a> Experimental Biology and Medicine. 239 (9), 1124-1134 (2014).</li>
<li>Foulke-Abel, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+enteroids+as+a+model+of+upper+small+intestinal+ion+transport+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Human enteroids as a model of upper small intestinal ion transport physiology and pathophysiology.</a> Gastroenterology. 150 (3), 638-649 (2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêts.

Le tractus gastro-intestinal d’un nouveau-né prématuré est soumis à une pression régénératrice continue due à des expositions répétées à des agressions environnementales associées à la dysbiose, aux métabolites bactériens inflammatoires et aux toxines, et à l’hypoxie intermittente23,24. Malheureusement, l’épithélium intestinal du nouveau-né prématuré est incapable d’établir rapidement l’intégrité fonctionnelle23, ce qui entraîne un dysfonc...

L’entérocolite nécrosante (ECN) est l’une des urgences gastro-intestinales les plus courantes chez les nouveau-nés prématurés1. La maladie se caractérise par une inflammation intestinale sévère qui peut rapidement se détériorer en nécrose intestinale, septicémie et potentiellement la mort. Bien que l’étiologie ne soit pas claire, les preuves suggèrent que l’ECN est multifactorielle et le résultat d’une interaction complexe de l’alimentation, d’une colonisation bactérienne anormale et d’un épithélium intestinal immature 2,3. Les nouveau-nés prématurés ont une perméabilité intestinale accrue, une colonisation bactérienne anormale et une faible capacité de régénération des entérocytes4,5, ce qui augmente leur risque de dysfonctionnement de la barrière intestinale, de translocation bactérienne et de développement d’ECN. Par conséquent, l’identification de stratégies ou d’interventions pour accélérer la maturation épithéliale intestinale et promouvoir la régénération ou la guérison de l’épithélium intestinal est essentielle pour prévenir cette maladie mortelle.
Des études ont démontré que le lait maternel (HM) protège contre l’ECN chez les nouveau-nés prématurés 6,7,8,9,10,11. Des études humaines et animales ont montré que les préparations à base de bovins augmentent la perméabilité intestinale et sont directement toxiques pour les cellules épithéliales intestinales 2,12. Bien qu’elles ne soient pas entièrement élucidées, les preuves suggèrent que les effets protecteurs de la HM sont médiés par des composants bioactifs tels que la lactoferrine, l’immunoglobuline A (IgA) et les oligosaccharides HM13. HM est également riche en hyaluronane (HA), un glycosaminoglycane uniquement non sulfaté avec de l’acide D-glucuronique répétitif et des disaccharides N-acétyl-D-glucosamine14,15. Fait important, nous avons montré que l’HA oral de 35 kDa (HA35), un imitateur de HM HA, atténue la gravité des lésions intestinales, empêche la translocation bactérienne et diminue la mortalité dans un modèle de lésion intestinale murine de type NEC16,17. 
Ici, les effets de HA35 sur la guérison intestinale et la régénération in vitro sont étudiés plus avant. Actuellement, le test in vitro le plus largement utilisé pour les lésions intestinales et la réparation est un test de plaie par égratignure effectué dans les monocouches de cellules du cancer colorectal (CCR). La pertinence physiologique d’un tel modèle pour l’intestin prématuré du nourrisson est limitée, car la réparation des plaies des cellules du CCR repose fortement sur la nature hautement proliférative des cellules cancéreuses plutôt que sur les processus de réparation induits par les cellules souches18. Pour surmonter cette limitation, l’établissement d’un modèle 2D de plaies entéroïdes égratignables, y compris la procédure d’isolement et de maintien des entéroïdes intestinaux grêles dérivés de cellules souches primaires provenant de primates prématurés non humains (PNH), est décrit ici. Étant donné que l’ECN prématurée est le plus souvent signalée dans l’intestin grêle distal, l’utilisation d’organoïdes de cellules épithéliales primaires dans un modèle de lésions et de réparations intestinales fournit un modèle in vitro plus physiologiquement traduisible par rapport aux modèles existants utilisant des monocouches colorectales traditionnelles18,19.

<table><tbody><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-675-49</td><td></td></tr><tr><td>100x21mm Pipette 100x21mm, Nunclon Delta</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>172931</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tube conique</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>24 puits, traité TC, Plaque à fond plat</td><td>Corning</td><td>3524</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro ; M Filtre à cellules réversibles</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>27215</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tube conique</td><td>VWR</td><td>89039-658</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro ; m Passoires à cellules stériles</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB22-363-548</td><td></td></tr><tr><td>Albumine bovine (BSA)</td><td>VWR</td><td>0332-100G</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viabilité Test</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Ham’s Mixture F-12 (DMEM-F12) avec tampon HEPES 15 mM</td><td>STEMCELL</td><td>Technologies 36254</td><td></td></tr><tr><td>Gentle Cell Réactif de dissociation</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>100-0485</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>NIH</td><td>imagej.nih.gov/ij/</td><td></td></tr> <tr><td>Incucyte S3 Instrument d’analyse de cellules vivantes</td><td>Sartorius</td><td>4647</td><td></td></tr><tr><td>Module logiciel d’analyse des plaies par égratignures d’incucytes</td><td>Sartorius</td><td>9600-0012</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td>C’est HOGMY, mais sans le Y-27632 ni les antibiotiques. Également utilisé comme base pour HOGM, mais il ne manque alors que les antibiotiques.</td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides d’Escherichia coli O111 :B4, purifiés par chromatographie de filtration sur gel</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel à facteur de croissance réduit (GFR) Matrice de membrane basale,</td><td>Corning</td> sans rouge de phénol <td>356231</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 puits, Nunclon traité Delta, microplaque à fond plat</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate), 1X [-] Calcium, Magnésium, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Primocin</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>Il s’agit d’antibiotiques à large spectre</td></tr><tr><td>Hyaluronate de sodium, qualité recherche, HA20K</td><td>Lifecore Biomedical</td><td>HA20K-1</td><td></td></tr><tr><td>TC20 Compteur de cellules automatisé</td><td>Société : Bio-Rad</td><td>1450102</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA 1X, 0,25 % Trypsine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25053CI</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>72302</td><td></td></tr></tbody></table>

effet de l’acide hyaluronique 35 kda sur un modèle in vitro de lésion prématurée de l’intestin grêle prématuré et cicatrisation à l’aide de monocouches dérivées d’entéroïdes

Effect of Hyaluronic Acid 35 kDa on an In Vitro Model of Preterm Small Intestinal Injury and Healing Using Enteroid-Derived Monolayers

Les tests in vitro sur les rayures sont couramment utilisés pour étudier les mécanismes et les caractéristiques de la cicatrisation épithéliale dans divers types de tissus. Ici, nous décrivons un protocole pour générer une monocouche bidimensionnelle (2D) à partir d’entéroïdes de primates non humains tridimensionnels (3D) dérivés des cryptes intestinales de l’iléon terminal. Ces monocouches dérivées d’entéroïdes ont ensuite été utilisées dans un essai in vitro sur des rayures pour tester la capacité de l’hyaluronane 35 kDa (HA35), un imitateur HA du lait humain, à favoriser la migration et la prolifération cellulaires le long du bord de la plaie épithéliale. Une fois que les monocouches ont été cultivées jusqu’à la confluence, elles ont été grattées manuellement et traitées avec HA35 (50 μg/mL, 100 μg/mL, 200 μg/mL) ou témoin (PBS). La migration et la prolifération des cellules dans l’espace ont été imagées à l’aide d’un microscope à lumière transmise équipé pour l’imagerie de cellules vivantes. La fermeture des plaies a été quantifiée en pourcentage de cicatrisation à l’aide du plug-in Wound Healing Size dans ImageJ. La zone de rayure, le taux de migration cellulaire et le pourcentage de fermeture de la plaie ont été mesurés sur 24 heures. HA35 in vitro accélère la cicatrisation des plaies dans les monocouches entéroïdes de l’intestin grêle, probablement par une combinaison de prolifération cellulaire au bord de la plaie et de migration vers la zone de la plaie. Ces méthodes peuvent potentiellement être utilisées comme modèle pour explorer la régénération intestinale dans l’intestin grêle humain prématuré.

Les effets de l’AH sur la réparation tissulaire et la cicatrisation des plaies dans divers tissus et organes sont bien documentés; cependant, les effets spécifiques de l’HA d’un poids moléculaire de 35 kDa sur la cicatrisation et la régénération de l’intestin grêle fœtal ou néonatal sont actuellement inconnus. Pour tester la capacité de HA35 à favoriser la cicatrisation des plaies dans un modèle de l’intestin grêle fœtal ou néonatal, nous avons généré des entéroïdes intestinaux 3D à partir du tissu iléal NHP et dissocié ...

Ce protocole décrit une méthode pour établir et effectuer un essai de plaie par égratignures sur des monocouches bidimensionnelles (2D) dérivées d’entéroïdes tridimensionnels (3D) isolés de l’iléon de primates non humains.

Effet de l’acide hyaluronique 35 kDa sur un modèle in vitro de lésion prématurée de l’intestin grêle prématuré et cicatrisation à l’aide de monocouches dérivées d’entéroïdes

In vitro scratch wound assays are commonly used to investigate the mechanisms and characteristics of epithelial healing in a variety of tissue types. ...

Ce protocole étend le test très courant des plaies par égratignures utilisé pour les études de régénération avec des monocouches dérivées d’entéroïdes représentant tous les principaux types de cellules de l’intestin grêle. Cette technique permet de visualiser en temps réel la fermeture de la plaie dans un modèle monocouche entéroïde 2D prématuré de régénération intestinale. Notre technique peut être appliquée à l’étude de l’intestin des mammifères prématurés, qui est généralement mal modélisé à l’aide de lignées cellulaires transformées de cancer colorectal.Commencez par décongeler 96 microlitres de matrice extracellulaire, ou BME d’hydrogel à base d’ECM, pendant la nuit sur de la glace à deux à huit degrés Celsius. Diluer l’hydrogel à base d’ECM et le PBS glacé sans calcium ni magnésium dans un rapport de un à 50. Enduisez chaque puits d’une plaque de culture tissulaire de 24 puits avec 200 microlitres d’hydrogel à base d’ECM dilué glacé et incuber la plaque enduite pendant au moins une heure à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Aspirez ensuite le média de la plaque de culture de 24 puits contenant les entéroïdes 3D destinés aux monocouches et remplacez-le par 500 microlitres de réactif de dissociation cellulaire par puits. Perturbez manuellement les dômes d’hydrogel à base d’ECM en pipetant de haut en bas huit à 12 fois et en transférant le contenu de 12 puits dans un tube conique de 15 millilitres. Lavez les 12 puits vides avec 250 microlitres de réactif de dissociation cellulaire pour vous assurer que tous les entéroïdes ont été éliminés et transférez le contenu dans des tubes coniques de 15 millilitres.Centrifuger les tubes coniques à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant. Ajouter 10 millilitres de tampon de lavage DMEM/F-12 glacé aux tubes coniques et suspendre les pastilles entéroïdes en retournant les tubes. Centrifuger à 300g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius et retirer le surnageant.Remettez en suspension les granulés cellulaires dans 12 millilitres de trypsine-EDTA à 37 degrés Celsius et placez les tubes dans un bain-marie de 37 degrés Celsius pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que les cellules semblent solubles. Ajouter trois millilitres de tampon de lavage DMEM / F-12 à chaque tube pour diluer la trypsine-EDTA. Mélanger en inversant les tubes et placer sur de la glace.Filtrer les entéroïdes dissociés à travers une crépine à mailles de 37 micromètres. Recueillir le contenu dans des tubes coniques propres de 15 millilitres et centrifuger les tubes à 300 g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le surnageant des tubes coniques et remettez en suspension les pastilles de la cellule avec six millilitres de HOMGY.Ensuite, retirez la plaque enduite d’hydrogel à base d’ECM de l’incubateur et aspirez tout excès de solution d’hydrogel à base d’ECM sans rayer la surface revêtue ou sécher complètement la plaque. Ajouter 500 microlitres de la suspension cellulaire combinée HOMGY de 12 millilitres dans chaque puits de la plaque de 24 puits recouverte d’hydrogel à base d’ECM. Faites tourner la plaque avec le couvercle pour assurer une répartition uniforme des cellules dans les puits.Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone, en échangeant les milieux HOMGY tous les deux jours jusqu’à ce que les monocouches atteignent plus de 90% de confluence. Une fois que les monocouches atteignent plus de 90% de confluence, aspirez le support pour éliminer toutes les cellules qui ne parviennent pas à se fixer. Traiter les cellules avec 500 microlitres de HA35 ou de PBS dissous dans HOMGY pendant 24 heures.Après cela, retirez le support sans perturber la surface de la monocouche. À l’aide d’une pointe de pipette de 200 microlitres, effectuez une rayure linéaire sur tout le diamètre de surface de la monocouche dans chaque puits, en prenant soin de ne pas laisser sécher les monocouches. Lavez les monocouches rayées une fois avec 500 microlitres de 1X PBS et ajoutez 500 microlitres de HA35 ou PBS dissous dans HOMGY.Transférez la plaque à l’instrument d’analyse de cellules vivantes dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone. Sous l’icône Planifier dans le logiciel d’analyse de cellules en direct, cliquez sur l’icône Assistant Lancer l’ajout d’un nouveau navire. Sélectionnez Analyser selon le calendrier, puis cliquez sur Suivant.Sélectionnez Nouveau sous Créer un vaisseau et cliquez sur Suivant, puis sélectionnez Puits entier sous Type de numérisation et cliquez sur Suivant. Choisissez Phase pour les canaux d’image et 4x pour l’objectif. Sélectionnez le fabricant de la plaque et le numéro de catalogue dans la liste fournie et cliquez sur Suivant.Sélectionnez un emplacement de navire vide suivi du modèle de balayage souhaité. Entrez le nom de la plaque dans Nom, puis sélectionnez plus pour créer une disposition de plaque. Sélectionnez petit plus pour créer un nom de traitement.Entrez le nom court, puis OK. Mettez en évidence les puits à plaques correspondant à ce traitement et frappez grand plus pour désigner les puits avec ce traitement. Entrez la concentration du composé et cliquez sur OK. Lorsque la plaque est terminée, sélectionnez OK, Suivant. Sélectionnez Reporter l’analyse à plus tard, puis Créer une nouvelle planification avec des analyses à des intervalles de quatre heures.Arrêtez l’analyse à un jour, zéro heure. Assurez-vous que le résumé est correct, puis ajoutez-le à la planification. Dans le logiciel d’analyse de cellules dynamiques, sélectionnez Afficher en haut de l’écran.Dans le menu Nom du navire, accédez à votre analyse terminée sur 24 heures et double-cliquez sur le nom du navire. Sélectionnez l’icône Exporter les images et les films sur la gauche, suivie de l’option Comme affiché. Mettez en surbrillance les puits d’intérêt, puis sélectionnez les points d’intérêt temporels et la série d’images affichée.Assurez-vous que le type de séquence et les analyses sont corrects. Sélectionnez l’emplacement du dossier cible souhaité. Choisissez JPEG dans le menu déroulant, puis Exporter.Ouvrez le logiciel ImageJ et téléchargez l’image du test de la plaie par rayure. Sélectionnez Image, puis tapez 8 bits pour modifier l’image à partir de RVB 24 bits. Sélectionnez Plugins, Macros, Installer Wound_healing_size plugin pour installer le plugin Wound Healing Size.Après cela, définissez le rayon de la fenêtre de variance sur 20, la valeur seuil sur 100, le pourcentage de pixels saturés sur 0,001. Oui pour Set Scale global, puis cliquez sur OK. Vérifiez que la zone définie est la zone de la plaie et répétez l’opération pour d’autres égratignures. Enfin, calculez le pourcentage de cicatrisation de la zone de rayure des cellules migrantes ou proliférantes sur 24 heures à l’aide de l’équation affichée à l’écran.Ici, T0 est la zone au temps zéro heure, et TC est la zone à zéro heure, quatre heures, 12 heures ou 24 heures. La génération d’entéroïdes et la procédure de cicatrisation des plaies monocouche dérivée d’entéroïdes sont montrées dans ces images. Une culture d’entéroïdes intestinaux tridimensionnels non humains de primates est utilisée pour se dissocier en monocouches bidimensionnelles.Les monocouches ont été cultivées à plus de 90% de confluence dans une plaque de 24 puits, puis traitées avec HA35 ou PBS pendant 24 heures. Les monocouches ont ensuite été rayées avec une pointe de pipette P200. Voici les images représentatives de HA35 dans les traitements de contrôle des monocouches entéroïdes de primates non humains.Les images ont été obtenues à zéro heure, quatre heures, 12 heures et 24 heures après avoir effectué une rayure avec une pointe de pipette P200. L’effet de HA35 sur les monocouches andoïdes cicatrisantes est montré ici. Le changement dans la cicatrisation des plaies au fil du temps dans les monocouches entéroïdes dépend de la concentration du traitement HA35.HA35 a significativement augmenté la cicatrisation des plaies après quatre heures et 12 heures à 100 microgrammes par millilitre et 200 microgrammes par millilitre par rapport au contrôle, mais les taux de guérison ont convergé entre les traitements de 24 heures. L’une des choses les plus importantes à retenir avec cette procédure est que les monocouches entéroïdes intestinales sont de courte durée. Ainsi, une fois qu’ils sont à 90% confluides, les enquêteurs devraient chercher à les utiliser rapidement.Cette technique est devenue notre modèle de prédilection pour la régénération intestinale prématurée in vitro, surtout si nous sommes intéressés par des lésions plus mécaniques qu’inflammatoires.

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Cette vidéo démontre le développement de la maladie d’entérocolite nécrosante dans un modèle d’entéroïde néonatal d’origine humaine induit par un traitement par lipopolysaccharides. Ce modèle permet d’étudier la physiopathologie intestinale.

Induction de l’entérocolite nécrosante dans un modèle d’entérocolite épithéliale humaine

Ce protocole décrit la mesure de la perméabilité de la barrière épithéliale dans en temps réel suite à un traitement pharmacologique en humain organoïdes intestinale à l’aide de la microscopie fluorescente et microscopie des cellules en direct.

Mesure en temps réel de la perméabilité de la barrière épithéliale dans organoïdes intestinale humaine

Enteroids sont en train de devenir un nouveau modèle dans l’étude des maladies humaines. Le protocole décrit comment simuler un modèle enteroid de l’entérocolite nécrosante humain utilisant lipopolysaccharide (LPS) traitement d’enteroids produit du tissu néonatal. Enteroids recueillis montrent des modifications inflammatoires semblables à ceux vus dans l’entérocolite nécrosante humaine.

Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante

Les organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (hiPSC) offrent des possibilités passionnantes de modéliser les maladies entériques in vitro. Nous démontrons la différenciation des hiPSCs en organoïdes intestinaux (iHOs), la stimulation de ces iHOs avec des cytokines, et la microinjection de Salmonella Typhimurium dans la lumière de l’OHI, permettant l’étude d’une invasion épithéliale par cette agent.

Utilisation d’organoïdes intestinaux dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme pour étudier et modifier la protection des cellules épithéliales contre la salmonelle et d’autres agents pathogènes

Ici, nous décrivons la préparation de monocouches épithéliales intestinales dérivées d’organoïdes humains pour étudier la fonction de barrière intestinale, la perméabilité et le transport. Comme les organoïdes représentent la réponse originale du tissu épithélial aux stimuli externes, ces modèles combinent les avantages de l’extensibilité des lignées cellulaires et la pertinence et la complexité des tissus primaires.

Monocouche épithéliale dérivée d’organoïdes : un modèle in vitro cliniquement pertinent pour la fonction de barrière intestinale

Ce protocole décrit un modèle apico-out d’entérocolite nécrosante (ECN) dans une boîte utilisant des entéroïdes intestinaux grêles à polarité inversée, permettant l’accès à la surface apicale. Nous fournissons un protocole de coloration immunofluorescente pour détecter la perturbation épithéliale liée à l’ECN et une méthode pour déterminer la viabilité des entéroïdes à sortie apicale soumis au protocole NEC-in-a-dish.

In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

Ce protocole détaille l’établissement d’entéroïdes, un modèle intestinal tridimensionnel, à partir de tissu intestinal fœtal. L’imagerie immunofluorescente de biomarqueurs épithéliaux a été utilisée pour la caractérisation du modèle. L’exposition apicale aux lipopolysaccharides, une endotoxine bactérienne, à l’aide d’une technique de micro-injection a induit une perméabilité épithéliale d’une manière dose-dépendante mesurée par la fuite de dextrane fluorescent.

Test de perméabilité épithéliale dans les entéroïdes dérivés du tissu fœtal

Nous décrivons ici la construction d’un système modèle de base de lignées cellulaires intestinales tridimensionnelles (3D) et d’un protocole d’enrobage de paraffine pour l’évaluation par microscopie optique d’équivalents intestinaux fixes. La coloration de protéines sélectionnées permet d’analyser plusieurs paramètres visuels à partir d’une seule expérience en vue d’une utilisation potentielle dans des études précliniques de criblage de médicaments.

Système de modèle intestinal tridimensionnel (3D) de base avec une composante immunitaire

Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.

Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

Ce protocole vise à évaluer les peptides biofonctionnels auto-assemblés pour l’adhésion cellulaire, la morphologie des organoïdes et l’expression génique par immunomarquage. Nous utiliserons une lignée cellulaire de cancer colorectal pour fournir un moyen rentable d’obtenir des organoïdes pour des tests intensifs.

Fabrication et caractérisation d’organoïdes de cancer colorectal à partir de la lignée cellulaire SW1222 dans une matrice peptidique auto-assemblée ultracourte

Cette étude présente un protocole de génération de monocouches intestinales bovines 2D à partir d’organoïdes, offrant un meilleur accès pour l’étude des interactions hôte-pathogène. Il comprend des méthodes d’évaluation de l’intégrité et de la fonctionnalité des membranes, faisant progresser des modèles in vitro qui imitent la physiologie gastro-intestinale des bovins. Cette approche promet d’importants avantages biomédicaux et agricoles, notamment des stratégies de traitement améliorées.

Progrès de la technologie des organoïdes bovins utilisant des interfaces monocouches de l’intestin grêle et du gros intestin

Apprenez un test de migration cellulaire sur monocouches d'entéroïdes pour étudier la régénération intestinale prématurée. Cette méthode permet une visualisation en temps réel de la cicatrisation.

Effet de l’acide hyaluronique 35 kDa sur un modèle in vitro de lésion prématurée de l’intestin grêle prématuré et cicatrisation à l’aide de monocouches dérivées d’entéroïdes (Vidéo) | JoVE Journal

Effet de l’acide hyaluronique 35 kDa sur un modèle in vitro de lésion prématurée de l’intestin grêle prématuré et cicatrisation à l’aide de monocouches dérivées d’entéroïdes

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