Name: Analyse par cytométrie en flux de biomarqueurs pour la détection des défauts fonctionnels des spermatozoïdes humains (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 48 s
Description: Découvrez l'analyse par cytométrie en flux des biomarqueurs fonctionnels des spermatozoïdes humains. Cette méthode évalue l'apoptose, le potentiel membranaire mitochondrial et l'intégrité de l'ADN pour améliorer le diagnostic de l'infertilité masculine.

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Nous remercions tous les acteurs de terrain pour leur aide et les personnes interrogées pour leur coopération.

REMARQUE : Le flux de travail pour la détection de biomarqueurs de l’endommagement de la fonction des spermatozoïdes par cytométrie en flux comprend (1) la préparation des cellules, (2) la coloration avec des réactifs fluorescents et (3) l’analyse par cytométrie en flux et l’interprétation des données (Figure 1). Le protocole suit les directives des comités d’éthique de l’Université médicale de l’armée (1.0/2013.4-12).
1. Préparation des cellules
<ol><li>Obtenir des échantillons de sperme humain par masturbation dans des bocaux en plastique pour échantillons cliniques, de préférence après 3 à 5 jours d’abstinence.</li>
	<li>Incuber immédiatement les échantillons de sperme dans un incubateur à 37 °C et liquéfier complètement les échantillons (jusqu’à 1 h).</li>
</ol>2. Spermatozoïdes comptés à l’aide de l’analyse assistée par ordinateur des spermatozoïdes (CASA)
<ol><li>Mélangez soigneusement les échantillons de sperme liquéfié.</li>
	<li>Ajouter 10 μL de sperme dans une chambre de comptage des spermatozoïdes (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Scannez les lames dans l’analyseur de classe de spermatozoïdes (voir le tableau des matériaux) et comptez au moins six zones et 400 spermatozoïdes pour l’estimation de la concentration de spermatozoïdes. REMARQUE : Les échantillons de sperme doivent être frais, et non congelés, pour l’apoptose des spermatozoïdes et l’analyse MMP.</li>
</ol>3. Coloration des spermatozoïdes
<ol><li>Détection de l’apoptose des spermatozoïdes à l’aide de la coloration à l’annexine V-FITC/PI<ol><li>Ajouter 1 × 106 spermatozoïdes dans un tube à centrifuger de 1,5 ml.</li>
		<li>Lavez les cellules avec 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate froid (PBS).</li>
		<li>Centrifuger la suspension de spermatozoïdes à 300 × g pendant 7 min et jeter le surnageant.</li>
		<li>Remettre les spermatozoïdes en suspension dans 200 μL de 1x tampon de liaison.</li>
		<li>Ajouter 2 μL d’annexine V de FITC et 2 μL de PI (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Tourbillonnez doucement les cellules, incubez-les pendant 15 minutes à température ambiante (25 °C) dans l’obscurité et placez-les immédiatement dans le cytomètre en flux pour analyse.</li>
	</ol></li>
	<li>Analyse du potentiel membranaire mitochondrial à l’aide de la sonde JC-1<ol><li>Ajouter 2 × 106 spermatozoïdes dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger à 600 × g pendant 5 min.</li>
		<li>Remettre en suspension la suspension de spermatozoïdes dans 1 mL de solution de travail JC-1 (voir le tableau des matériaux).</li>
		<li>Agiter doucement les cellules et incuber pendant 20 min à 37 °C dans l’obscurité.</li>
		<li>Centrifuger la suspension à 600 × g pendant 5 min et jeter le surnageant.</li>
		<li>Lavez les granulés deux fois avec 1 mL de PBS à une vitesse de 600 × g pendant 5 min chacun.</li>
		<li>Remettre en suspension les spermatozoïdes colorés dans 1 mL de PBS dans des tubes de cytomètre en flux et placer immédiatement les tubes dans le cytomètre en flux pour analyse.</li>
		<li>Utiliser le cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone (CCCP) comme témoin positif. Remettre les spermatozoïdes en suspension (comme décrit précédemment à l’étape 3.2.1) dans 1 mL de solution de travail CCCP (voir le tableau des matériaux), et faire tourbillonner doucement les cellules et incuber pendant 20 minutes à température ambiante. Centrifuger la suspension à 600 × g pendant 5 min et jeter le surnageant. Répétez les étapes 3.2.2 à 3.2.6.</li>
	</ol></li>
	<li>Test de la structure de la chromatine des spermatozoïdes<ol><li>Placez une aliquote de sperme brut liquéfié (0,25 ml) dans un cryotube et congelez immédiatement les échantillons de sperme dans de l’azote liquide (-196 °C) jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour l’ASCR.</li>
		<li>Décongeler les échantillons de sperme dans un bain-marie à 37 °C et les diluer avec un tampon TNE (voir le tableau des matériaux) à une concentration de 1-2 × 106 cellules/mL.</li>
		<li>Ajouter 200 μL de l’échantillon dilué dans un tube à essai de cytomètre en flux et le mélanger avec 400 μL de solution acide (voir le tableau des matériaux) pendant 30 s.</li>
		<li>Colorer les échantillons avec 1,2 mL de solution de coloration AO (voir le tableau des matériaux) et les placer immédiatement dans le cytomètre en flux pour analyse.</li>
		<li>Utiliser un échantillon de référence comme étalon interne pour la configuration et l’étalonnage du cytomètre en flux. Diluer l’échantillon de référence avec un tampon TNE à 4 °C jusqu’à une concentration de 1-2 × 106 cellules/mL. Répétez les étapes 3.3.1 à 3.3.4. REMARQUES : Toutes les solutions et tampons sont conservés à 4 °C. (1) Le sperme ne doit pas être dilué avant la congélation instantanée. Les échantillons de sperme brut doivent être décongelés et dilués avec un tampon TNE au moment des mesures de cytométrie en flux. (2) Pour les cliniques d’infertilité, ~0,25 mL de sperme brut doit être surgelé dans un congélateur ultra-froid ou un réservoir de LN2. Ces aliquotes congelées peuvent ensuite être envoyées à un laboratoire de diagnostic SCSA sur de la glace carbonique ou dans un expédieur sec LN2. (3) Un échantillon d’éjaculat humain qui démontre l’hétérogénéité de l’intégrité de l’ADN (p. ex., indice de fragmentation de l’ADN [IFD] de 15 %) a été utilisé comme référence standard interne.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Configuration du cytomètre en flux
REMARQUE : Avant de démarrer le cytomètre en flux, la vérification du système de l’instrument doit être effectuée pour vérifier les performances analytiques. Exécutez les échantillons une fois que toutes les vérifications ont été effectuées et réussies.
<ol><li>Ouvrez le logiciel du cytomètre en flux et démarrez le cytomètre.</li>
	<li>Collectez des échantillons de données.<ol><li>Tout d’abord, chargez un échantillon de contrôle sur le cytomètre en flux et cliquez sur EXÉCUTER pour démarrer la collecte de données (ajustez les paramètres si nécessaire). Attendez que l’instrument commence à aspirer l’échantillon et fournissez un aperçu en temps réel des événements détectés. REMARQUE : L’échantillon témoin : un témoin négatif (spermatozoïdes non colorés) pour l’apoptose des spermatozoïdes ; un témoin positif (cellules traitées par CCCP) pour la MMP ; un échantillon de référence pour l’ASSC.</li>
		<li>Créez des diagrammes à points pour afficher les données et sélectionnez les paramètres de l’axe x/y (tels que FSC, SSC) et linéaire pour spécifier que les données sont affichées. Sélectionnez et appliquez une porte polygonale pour délimiter la population de spermatozoïdes à analyser, et de sorte que l’instrument trace les événements détectés en temps réel.</li>
		<li>Analysez les événements spermatozoïdes dans la région.<ol><li>Pour l’apoptose des spermatozoïdes, définissez le FL1 comme axe des abscisses et le FL2 comme axe des abscisses. Pour isoler les cellules vivantes, apoptotiques ou nécrotiques, appuyez sur la porte du quadrant et faites-la glisser pour réduire les populations de spermatozoïdes à quatre populations spécifiques.</li>
			<li>Pour MMP, définissez le FL1 comme axe des x et le FL2 comme axe des y. Créez une porte polygonale pour subdiviser les populations de spermatozoïdes en deux populations spécifiques.</li>
			<li>Pour l’ASSC, définissez le FL4 comme axe des abscisses (fluorescence rouge, canaux de cytométrie en flux 125/1 024) et le FL1 comme axe des ordonnées (fluorescence verte, canaux de cytométrie en flux 475/1 024). Dessinez les portes à un angle de 45° pour exclure les signaux de débris cellulaires.</li>
		</ol></li>
		<li>Définissez une limite d’exécution pour indiquer quand arrêter la collecte de données. Calculez un total de 10 000 spermatozoïdes pour chaque échantillon pour les analyses de l’apoptose des spermatozoïdes, de la MMP et de l’ASCC.</li>
		<li>Définissez le taux fluidique (lent, moyen et rapide, ou un taux fluidique personnalisé), en fonction du nombre de cellules. REMARQUES : Pour l’analyse SCSA, pour déterminer les concentrations de spermatozoïdes, décongelez l’échantillon brut congelé et faites-le passer sur le FCM. Si le débit est de >250/s, diluer l’échantillon au débit correct. Mesurez tous les échantillons indépendamment deux fois et calculez les valeurs moyennes. Un échantillon de référence a été testé tous les 10 à 15 échantillons afin d’assurer la normalisation et la stabilité de l’instrument au jour le jour.</li>
		<li>Définissez le seuil pour éliminer les débris et le bruit des échantillons de cellules. Appliquez ces paramètres à tous les échantillons de l’expérience.</li>
		<li>Si nécessaire, réglez la compensation des couleurs pour corriger le débordement de fluorescence.</li>
		<li>Pipetez doucement les échantillons avant de les charger sur le cytomètre en flux, nommez l’échantillon et exécutez les échantillons.</li>
		<li>Une fois que tous les échantillons ont été exécutés, enregistrez les exemples de données en tant que fichiers FCS en leur attribuant un nom de fichier pour une analyse logicielle plus approfondie. Enregistrez le modèle de travail de l’expérience en cours pour le récupérer lors d’exécutions ultérieures (facultatif).</li>
	</ol></li>
</ol>5. Analyse des données
<ol><li>Importez les données dans le logiciel d’analyse de données du cytomètre en flux (voir le tableau des matériaux).</li>
	<li>Double-cliquez sur le premier exemple dans l’espace de travail. Patientez jusqu’à ce qu’une fenêtre Graphique s’ouvre, affichant un tracé des événements le long des paramètres FSC et SSC. Créez une porte qui isole la population de spermatozoïdes incluse dans la porte, produisant une population « enfant » à partir de l’ensemble d’événements parent.</li>
	<li>Double-cliquez dans la zone fermée et ouvrez une nouvelle fenêtre Graphique contenant uniquement les événements de sperme. Définissez les paramètres des axes x et y pour sélectionner le canal fluorescent.</li>
	<li>Sélectionnez l’outil Porte . Cliquez dans le tracé pour faire apparaître les portes, de sorte que les portes créées isolent les différentes populations cellulaires.</li>
	<li>Cliquez avec le bouton droit de la souris (ou cliquez en maintenant la touche Contrôle enfoncée) sur l’une des lignes en surbrillance, puis sélectionnez Copier l’analyse dans le groupe. Appliquez l’arborescence de contrôle à tous les échantillons du groupe.</li>
	<li>Enregistrez et exportez la table de données.</li>
</ol>

<ol><li>Agarwal, A., Mulgund, A., Hamada, A., Chyatte, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+view+on+male+infertility+around+the+globe%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Biology+and+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">A unique view on male infertility around the globe.</a> Reproductive Biology and Endocrinology. 13 (1), 1-9 (2015).</li>
<li>Nachtigall, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((International+disparities+in+access+to+infertility+services%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">International disparities in access to infertility services.</a> Fertility and Sterility. 85 (4), 871-875 (2006).</li>
<li>Agarwal, A., Allamaneni, S. S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+DNA+damage+assessment%3A+a+test+whose+time+has+come%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Sperm DNA damage assessment: a test whose time has come.</a> Fertility and Sterility. 84 (4), 850-853 (2005).</li>
<li>Peña, F. J., Ortega Ferrusola, C., Martín Muñoz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+flow+cytometry+approaches+in+equine+andrology%5BTitle%5D)+AND+%22Theriogenology%22%5BJournal%5D)">New flow cytometry approaches in equine andrology.</a> Theriogenology. 86 (1), 366-372 (2016).</li>
<li>Oosterhuis, G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+apoptosis+in+human+spermatozoa%3A+a+biological+assay+for+semen+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Measuring apoptosis in human spermatozoa: a biological assay for semen quality.</a> Fertility and Sterility. 74 (2), 245-250 (2000).</li>
<li>Koopman, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Annexin+V+for+flow+cytometric+detection+of+phosphatidylserine+expression+on+B+cells+undergoing+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Annexin V for flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis.</a> Blood. 84 (5), 1415-1420 (1994).</li>
<li>Freitas, M. J., Vijayaraghavan, S., Fardilha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+mechanisms+in+mammalian+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Signaling mechanisms in mammalian sperm motility.</a> Biology of Reproduction. 96 (1), 2-12 (2017).</li>
<li>Lehti, M. S., Sironen, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+and+function+of+sperm+tail+structures+in+association+with+sperm+motility+defects%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Formation and function of sperm tail structures in association with sperm motility defects.</a> Biology of Reproduction. 97 (4), 522-536 (2017).</li>
<li>Durairajanayagam, D., Singh, D., Agarwal, A., Henkel, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+sperm+mitochondrial+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of sperm mitochondrial dysfunction.</a> Andrologia. 53 (1), 13666(2021).</li>
<li>Agnihotri, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+membrane+potential+%28MMP%29+regulates+sperm+motility%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+and+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial membrane potential (MMP) regulates sperm motility.</a> In Vitro Cellular and Developmental Biology. Animal. 52 (9), 953-960 (2016).</li>
<li>Smiley, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+heterogeneity+in+mitochondrial+membrane+potentials+revealed+by+a+J-aggregate-forming+lipophilic+cation+JC-1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Intracellular heterogeneity in mitochondrial membrane potentials revealed by a J-aggregate-forming lipophilic cation JC-1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (9), 3671-3675 (1991).</li>
<li>Evenson, D. P., Darzynkiewicz, Z., Melamed, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relation+of+mammalian+sperm+chromatin+heterogeneity+to+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Relation of mammalian sperm chromatin heterogeneity to fertility.</a> Science. 210 (4474), 1131-1133 (1980).</li>
<li>Evenson, D. P., Djira, G., Kasperson, K., Christianson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relationships+between+the+age+of+25%2C445+men+attending+infertility+clinics+and+sperm+chromatin+structure+assay+%28SCSA%C2%AE%29+defined+sperm+DNA+and+chromatin+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Relationships between the age of 25,445 men attending infertility clinics and sperm chromatin structure assay (SCSA®) defined sperm DNA and chromatin integrity.</a> Fertility and Sterility. 114 (2), 311-320 (2020).</li>
<li>Evenson, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+chromatin+structure+assay+%28SCSA%C2%AE%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Sperm chromatin structure assay (SCSA®).</a> Methods in Molecular Biology. 927, Clifton, N.J. 147-164 (2013).</li>
<li>Agarwal, A., Said, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+sperm+chromatin+abnormalities+and+DNA+damage+in+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction+Update%22%5BJournal%5D)">Role of sperm chromatin abnormalities and DNA damage in male infertility.</a> Human Reproduction Update. 9 (4), 331-345 (2003).</li>
<li>Ricci, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptosis+in+human+sperm%3A+its+correlation+with+semen+quality+and+the+presence+of+leukocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Apoptosis in human sperm: its correlation with semen quality and the presence of leukocytes.</a> Human Reproduction. 17 (10), 2665-2672 (2002).</li>
<li>Zhang, H. -B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+apoptotic+changes+in+human+spermatozoa+and+their+relationships+with+conventional+semen+parameters+and+sperm+DNA+fragmentation%5BTitle%5D)+AND+%22Asian+Journal+of+Andrology%22%5BJournal%5D)">Early apoptotic changes in human spermatozoa and their relationships with conventional semen parameters and sperm DNA fragmentation.</a> Asian Journal of Andrology. 10 (2), 227-235 (2008).</li>
<li>WHO laboratory manual for the examination and processing of human semen. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787">https://www.who.int/publications/i/item/9789240030787</a> (2022).</li>
<li>Evenson, D. P., Wixon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environmental+toxicants+cause+sperm+DNA+fragmentation+as+detected+by+the+Sperm+Chromatin+Structure+Assay+%28SCSA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicology+and+Applied+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Environmental toxicants cause sperm DNA fragmentation as detected by the Sperm Chromatin Structure Assay (SCSA).</a> Toxicology and Applied Pharmacology. 207 (2), 532-537 (2005).</li>
<li>Wang, Y. X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phthalate+exposure+in+association+with+serum+hormone+levels%2C+sperm+DNA+damage+and+spermatozoa+apoptosis%3A+A+cross-sectional+study+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Research%22%5BJournal%5D)">Phthalate exposure in association with serum hormone levels, sperm DNA damage and spermatozoa apoptosis: A cross-sectional study in China.</a> Environmental Research. 150, 557-565 (2016).</li>
<li>Ni, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diurnal+variation+in+sperm+DNA+fragmentation%3A+analysis+of+11%2C382+semen+samples+from+two+populations+and+in+vivo+animal+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Chronobiology+International%22%5BJournal%5D)">Diurnal variation in sperm DNA fragmentation: analysis of 11,382 semen samples from two populations and in vivo animal experiments.</a> Chronobiology International. 36 (11), 1455-1463 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’y a pas de conflits d’intérêts.

L’intégrité de la chromatine, la MMP et l’apoptose des spermatozoïdes humains se sont avérées être des prédicteurs précieux des résultats de la reproduction. Le dernier manuel de laboratoire de l’OMS pour l’examen et le traitement du sperme humain (sixième édition) a également mis en évidence certains de ces indicateurs (intégrité de la chromatine et apoptose) comme des examens étendus au-delà de l’examen de base de paramètres de routine tels que le nombre de spermatozoïdes18. Des publications récentes suggèrent également que ces indicateurs pourraient être des marqueurs plus sensibles de la réponse à des expositions externes dangereuses, indiquant leur potentiel pour l’identification des dommages à la reproduction à un stade plus précoce19,20. La combinaison de ces indicateurs avec des examens de routine peut également fournir une compréhension plus complète du profil du dysfonctionnement des spermatozoïdes et de la complexité des dommages à la reproduction masculine dans la population.
Il y a plusieurs questions clés qui déterminent de manière substantielle le succès de l’analyse du sperme avec la FCM. Tout d’abord, la mesure de la MMP et de l’apoptose des spermatozoïdes nécessite un examen immédiat après la liquéfaction du sperme. Pour minimiser le coût en temps, deux techniciens peuvent prendre en charge séparément le prétraitement de la MMP et l’analyse de l’apoptose d’un échantillon. Comme le prétraitement de l’apoptose est plus simple, il serait transféré à l’étape de cytométrie en flux plus rapidement que l’analyse MMP. Pour l’analyse de l’ASCR, les échantillons de sperme frais doivent être cryoconservés dès qu’ils sont disponibles après liquéfaction. Les échantillons de sperme peuvent ensuite être conservés dans de l’azote liquide pendant une période relativement longue et ne nécessitent pas d’examen immédiat.
En conséquence, le coût du temps sur site de l’expérience peut être compressé à 40 minutes, ce qui correspond à la durée de l’analyse MMP plus l’étape de cytométrie en flux de l’analyse du sperme. Deuxièmement, la configuration de la grille dans la plate-forme de cytométrie en flux doit être décidée séparément pour chaque lot d’échantillons. Les échantillons de spermatozoïdes avec des sous-groupes de cellules claires dans le nuage de points peuvent être sélectionnés comme référence pour dessiner la zone de contrôle. Troisièmement, comme il n’existe pas de valeurs de référence cliniques largement acceptées pour les indicateurs de cette expérience, les résultats historiques peuvent être utilisés comme un outil important pour le contrôle de la qualité. Il est également recommandé d’établir des contrôles positifs et négatifs dans chaque lot de mesures, en particulier pour l’ACTS et le MMP.
Les résultats représentatifs de l’analyse du sperme fournis ici sont obtenus à l’aide d’un Accuri C6. Cependant, la technique pourrait être appliquée à d’autres plates-formes commerciales avec des modifications mineures. Habituellement, un total de 5 × 10 à 6 spermatozoïdes serait nécessaire pour répondreà l’exigence de mesure de tous les indicateurs. Si la concentration de spermatozoïdes d’un échantillon est beaucoup plus faible que le niveau moyen, le besoin de volume de sperme augmenterait.
Comme pour les paramètres de routine des spermatozoïdes, il existe également une variation intraindividuelle notable de l’intégrité de la chromatine, de la MMP et de l’apoptose des spermatozoïdes humains21. En conséquence, plusieurs tests d’échantillons prélevés à différents moments peuvent fournir une estimation plus précise du niveau de dommages à la fonction des spermatozoïdes. Bien qu’il n’y ait pas de période d’abstinence recommandée avant le prélèvement de spermatozoïdes pour l’analyse par cytométrie en flux, 2 à 7 jours d’abstinence éjaculatoire, suggérés pour l’analyse de routine du sperme par l’OMS, peuvent être adoptés. Cela peut aider à améliorer la comparabilité des résultats entre les laboratoires et entre les différents échantillons prélevés sur les mêmes hommes.
Une limitation majeure de cette méthode est que deux des trois biomarqueurs testés - l’apoptose et le potentiel membranaire mitochondrial - nécessitent des échantillons de sperme frais. Cela peut limiter leur application aux hommes qui peuvent fournir des échantillons de sperme au laboratoire. Pour le test de dommages à l’ADN (SCSA), des échantillons de référence doivent être préparés avant l’expérience pour calibrer le cytomètre en flux. Il convient de noter que l’application du présent protocole nécessite l’utilisation d’un instrument FCM dans le laboratoire, ce qui représente encore un défi considérable pour de nombreux laboratoires cliniques, bien que la coopération avec un service tiers puisse être un choix alternatif dans certaines régions.
De plus, le coût des colorants et autres réactifs est également un facteur financier pour les hommes qui peuvent avoir besoin de l’examen. Enfin, il peut être nécessaire de modifier le protocole si différentes marques ou versions de FCM sont utilisées pour examiner les biomarqueurs. En résumé, cet article présente une approche pratique pour estimer trois biomarqueurs des dommages causés aux spermatozoïdes humains par un seul appareil de cytométrie en flux. Cela peut fournir des informations précieuses sur la santé reproductive masculine et compléter l’examen de routine du sperme.

L’infertilité est devenue un problème de santé publique, l’infertilité masculine contribuant à 40 à 50 % de tous les cas 1,2. Bien que l’analyse conventionnelle de la qualité du sperme joue un rôle important dans la détermination du potentiel de fertilité masculine, environ 15 % des patients souffrant d’infertilité ont des paramètres de sperme normaux tels que le nombre, la motilité et la morphologie des spermatozoïdes3. De plus, les examens de routine des spermatozoïdes ont une faible répétabilité, fournissent des informations limitées sur la fonction des spermatozoïdes et ne peuvent pas donner une évaluation précise de la fertilité masculine ou refléter les défauts subtils des spermatozoïdes. De multiples techniques ont été développées pour tester la fonction des spermatozoïdes, telles que le test de l’hémizona (HZA), le test de pénétration des spermatozoïdes, le test de gonflement hypo-osmotique, le test des anticorps antispermatozoïdes, mais ces méthodes prennent du temps et sont vulnérables aux influences subjectives des opérateurs. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes rapides et précises pour l’analyse de la fonction des spermatozoïdes.
La FCM est une technologie d’analyse rapide à cellule unique développée dans les années 1970, qui a été largement utilisée dans divers domaines de la biologie cellulaire et de la médecine. FCM est un outil robuste pour l’évaluation de la fonction des spermatozoïdes qui analyse les spermatozoïdes marqués à l’aide d’une sonde de fluorescence spécifique4. Les spermatozoïdes passent à travers des lasers monocanaux ou multicanaux, et la lumière diffusée et la fluorescence émise sont produites par un faisceau laser. La lumière diffusée comprend la lumière diffusée vers l’avant (FSC) et la lumière diffusée latéralement (SSC), qui reflète la taille de la cellule testée et la granularité cellulaire ou la structure interne. Ces signaux sont collectés, affichés et analysés par le système informatique et, par conséquent, une série de caractéristiques des spermatozoïdes sont mesurées rapidement et avec précision. Par conséquent, la FCM est une technique rapide, objective, multidimensionnelle et à haut débit qui a attiré de plus en plus l’attention dans le domaine de l’analyse du sperme. L’application de la FCM peut combler les lacunes des méthodes traditionnelles et fournit une nouvelle approche pour la détection de la structure interne et de la fonction des spermatozoïdes.
L’apoptose des spermatozoïdes est étroitement liée à la fertilité masculine5. La détection de l’apoptose des spermatozoïdes est un indice important pour évaluer la fonction des spermatozoïdes au niveau moléculaire. La FCM est largement reconnue comme une méthode fiable et sensible pour détecter l’apoptose des spermatozoïdes à l’aide de la coloration à l’annexine V-FITC/PI. Le principe de base est que la phosphatidylsérine (PS) est transférée de la couche interne de la membrane cellulaire à sa couche externe au stade précoce de l’apoptose. L’annexine V est une protéine phospholipidique dépendante du Ca2+ (généralement marquée par FITC) qui a une forte affinité pour le PS, détectant ainsi le PS exposé à la surface externe de la membrane cellulaire6. La nécrose et l’apoptose peuvent être distinguées en combinaison avec la coloration Pl. Par conséquent, la méthode de double coloration de l’annexine V-FITC/PI est largement utilisée, car elle est rapide, simple et facile à détecter différents spermatozoïdes apoptotiques.
Un spermatozoïde de mammifère mature contient environ 72 à 80 mitochondries7, ce qui suggère une raison biologique à la rétention des mitochondries des spermatozoïdes8. Il a été démontré que les mitochondries des spermatozoïdes jouent un rôle important dans le maintien de la motilité et de la fertilité des spermatozoïdes9. La coloration JC-1, qui peut être utilisée comme indicateur de MMP dans une variété de types de cellules, est l’un des fluorochromes les plus populaires pour l’évaluation de l’activité mitochondriale des spermatozoïdes10. JC-1 est un colorant cationique qui s’accumule de manière dépendante du potentiel dans les mitochondries. JC-1 a une émission de fluorescence maximale à 525 nm (vert) et forme des agrégats J 11 lorsqu’il se lie à des membranes à fort potentiel (ΔΨm, 80-100 mV), ce qui entraîne un décalage de l’émission de fluorescence à ~590 nm (orange-rouge). Par conséquent, la dépolarisation mitochondriale des spermatozoïdes est indiquée par une diminution du rapport d’intensité de fluorescence rouge/vert, et la FCM peut être utilisée pour détecter les niveaux de MMP dans les échantillons de sperme humain.
La méthodologie SCSA a été inventée par Evenson et al.12 et est considérée comme un test précis et reproductible avec des données uniques à double paramètre (fluorescence rouge vs verte) sur une échelle de 1 024 × 1 024 canaux 13. Dans les spermatozoïdes endommagés, l’ADN et les protéines altérées dans les noyaux des spermatozoïdes sont marqués par AO, et les cassures du brin d’ADN sont mesurées par fluorescence rouge, tandis que les doubles brins intacts émettent une fluorescence verte dans FCM14. De nos jours, de nombreuses méthodes ont été développées pour estimer l’intégrité de l’ADN des spermatozoïdes. Cependant, contrairement à l’ACSS, ces tests sont souvent à forte intensité de main-d’œuvre et ne permettent pas de diagnostiquer l’infertilité masculine. Les résultats du test SCSA sont significativement corrélés avec l’ADN humain, la grossesse et la fausse couche, fournissent des preuves convaincantes que l’ACS peut être utile dans l’analyse du sperme humain et peuvent servir d’outil précieux aux cliniciens de l’infertilité15.
L’intégrité de la chromatine, la MMP et l’apoptose reflètent différents aspects de la fonction des spermatozoïdes et, par conséquent, la combinaison de ces biomarqueurs peut fournir un aperçu plus complet de l’état des spermatozoïdes. Le FCM peut être utilisé pour des mesures distinctes de l’intégrité de la chromatine, de la MMP ou de l’apoptose dans des échantillons de sperme humain. Bien que le coût de la FCM et le coût des colorants aient limité l’application à grande échelle de ces techniques dans les laboratoires cliniques de santé génésique, leur valeur pour l’estimation de la fécondité est acceptée.
Cependant, comme chacune des expériences nécessite un prétraitement des échantillons de sperme et que tous les échantillons prétraités doivent être testés dès que possible, la mesure simultanée des trois biomarqueurs d’un échantillon avec un seul FCM peut entraîner un long temps d’attente pour certaines expériences et nuire à la fiabilité des résultats. En effet, les spermatozoïdes subissent des dommages supplémentaires pendant le processus d’attente, si le protocole n’est pas correctement organisé en tenant compte des trois expériences. Cet article présente un protocole qui permet de mesurer de manière fluide les trois biomarqueurs dans une seule cytométrie sans compromettre substantiellement la qualité de l’expérience induite par des temps d’attente prolongés.

<table><tbody><tr><td>Tampon d’acide citrique 0,1 M</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co., États-Unis</td><td>251275-5G</td><td>Ajouter 21,01 g/L d’acide citrique monohydraté (FW = 210,14 ; 0,10 M) à 1,0 L H2O. Stocker jusqu’à plusieurs mois à 4 &deg ;C.</td></tr><tr><td>0,2 M Tampon Na2PO4</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co.,</td><td>États-Unis V900061-500G</td><td>Ajouter 28,4 g de phosphate dibasique de sodium (FW = 141,96 ; 0,2 M) à 1,0 L H2O. Conserver jusqu’à plusieurs mois à 4 °C.</td></tr><tr><td>10 mM de solution mère de CCCP</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co., USA</td><td>C2759</td><td>Ajouter 20,46 mg de CCCP à 10,0 mL de DMSO, jusqu’à l’obtention finale de CCCP à une concentration de 10 mM, aliquote et stocker à &minus ; 80 °C.</td></tr><tr><td>10 et micro ; M Solution de travail</td><td></td><td></td> CCCP <td>Ajouter 10 mL de PBS dans un tube à centrifuger en polypropylène de 15 mL et ajouter 10 &mu ; L Solution mère de CCCP, jusqu’à la finale de CCCP à une concentration de 10 & micro ;M.</td></tr><tr><td>1 mM JC-1 solution mère</td><td>Sigma-Aldrich Chemical Co., USA</td><td>T4069</td><td>JC-1 est acheté lyophilisé. Ajoutez une petite quantité de DMSO dans le flacon et faites un tourbillon pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que tout le colorant soit dissous. Transvaser la solution dans un tube étanche à la lumière et rincer le flacon avec un volume approprié de DMSO, jusqu’à la fin de JC-1 à une concentration de 1 mg/mL. aliquote et stocker chez &minus ; 20 &°C.</td></tr><tr><td>37 &deg ; C incubateur</td><td>Thermo Scientific, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 &micro ; M JC-1 solution de travail</td> Ajouter 10 mL de PBS dans un tube à centrifuger en polypropylène de 15 mL et ajouter 50 &mu ;<td></td><td></td><td> L d’une aliquote de stock JC-1 décongelée. Remuez doucement pour assurer une dilution homogène. Cette solution doit être stockée dans l’obscurité et utilisée rapidement.</td></tr><tr><td>Cytomètre en flux Accuri C6</td><td>BD Pharmingen, San Diego, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution acide, pH 1,2</td><td></td><td></td><td>Combiner 20,0 mL de HCl 2,0 N (0,08 N), 4,39 g de NaCl (0,15 M) et 0,5 mL de Triton X-100 (0,1 %) dans H2O pour un volume final de 500 mL. Ajustez le pH à 1,2 avec 5 mol/L de HCl.</td></tr><tr><td>Solution mère d’orange d’acridine (AO), 1,0 mg/mL</td><td>Polysciences, Inc, Warrington, Pa</td><td>65-61-2</td><td>Dissoudre l’AO purifié par chromatographie dans du dd-H2O à 1,0 mg/mL.</td></tr><tr><td>Solution de coloration AO (solution de travail)</td><td></td><td></td><td>Ajouter 600 &mu ; L de solution mère d’AO pour chaque 100 mL de tampon de coloration.</td></tr><tr><td>Capot de sécurité biologique</td><td>Airtech, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système d’analyse de sperme assisté par ordinateur (CASA)</td> <td>Microptic, Barcelone, Espagne</td><td></td><td>Analyseur de classe de sperme 5.3.00</td></tr><tr><td>Chambre de comptage de spermatozoïdes</td><td>Goldcyto, Espagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Equipments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FITC Annexin V Kit de détection de l’apoptose I</td><td>BD Biosciences, San José, CA</td><td>556547</td><td>Inclus : (1) FITC Annexin V est embouteillé à 100 ng/&micro ; L; (2) Iodure de propidium (PI) : La solution de coloration PI est composée de 50 & micro ; g PI/mL dans le PBS (pH 7,4) et est de 0,2 &micro ; M stérile filtré ; (3) 10 tampons de liaison : 0,1 M Hepes (pH 7,4), 1,4 M NaCl, 25 mM CaCl2. Pour une solution de travail 1x, diluez 1 partie du tampon de liaison 10x Annexin V dans 9 parties d’eau distillée. Conserver à 4 &deg ; C et à l’abri d’une exposition prolongée à la lumière. Ne pas congeler.</td></tr><tr><td>FlowJo&nbsp ; 10</td><td>Tree Star, Inc., San Carlos, CA, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse horizontale</td><td>Thermo Scientific, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>réservoir d’azote liquide</td><td>Thermolyne, États-Unis</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Beyotime, Shanghai, Chine</td><td>C0221A</td><td>Les tampons PBS prêts à l’emploi sont achetés et stockés à température ambiante</td></tr><tr><td>Tampon de coloration, pH 6,0</td><td></td><td></td><td>Combinez 370 mL de tampon d’acide citrique 0,10 M, 630 mL de tampon Na2PO4, 372 mg d’EDTA (disodique, FW = 372,24 ; 1 mM) et 8,77 g de NaC1 (0,15 M). Mélanger toute la nuit sur une plaque à agiter pour s’assurer que l’EDTA est entièrement en solution. pH à 6,0 avec une solution saturée de NaOH.</td></tr><tr><td>L’échantillon de référence pour l’analyse</td><td></td><td></td> SCSA <td>L’échantillon de référence a été dilué avec du froid (4 & deg ; C) Tampon TNE à une concentration de travail de 1&ndash ; 2 & fois ; 106 cellules/mL, et utilisé pour régler le vert à 475/1 024 canaux de cytométrie en flux et régler le rouge à 125/1 024 canaux de cytométrie en flux.</td></tr><tr><td>Tampon TNE, 1x, pH 7,4 (solution de travail)</td><td></td><td></td><td>Combiner 60 mL de 10x TNE et 540 mL de H2O. Vérifiez le pH (7,4).</td></tr><tr><td>Tampon TNE, 10x, pH 7,4</td><td>Perfemiker, Shanghai, Chine</td><td>PM11733</td><td>Les tampons prêts à l’emploi sont achetés et stockés à 4 &deg ;C.</td></tr></tbody></table>

analyse par cytométrie en flux de biomarqueurs pour la détection des défauts fonctionnels des spermatozoïdes humains

Flow Cytometric Analysis of Biomarkers for Detecting Human Sperm Functional Defects

L’analyse conventionnelle des paramètres du sperme est largement utilisée pour évaluer la fertilité masculine. Cependant, des études ont montré que ~ 15% des patients infertiles ne présentent aucune anomalie dans les paramètres conventionnels du sperme. Des technologies supplémentaires sont nécessaires pour expliquer l’infertilité idiopathique et détecter les défauts subtils des spermatozoïdes. Actuellement, les biomarqueurs de la fonction des spermatozoïdes, y compris l’apoptose des spermatozoïdes, le potentiel membranaire mitochondrial (MMP) et les dommages à l’ADN, révèlent la physiologie des spermatozoïdes au niveau moléculaire et sont capables de prédire la fertilité masculine.
Avec les techniques de cytométrie en flux (FCM), chacun de ces marqueurs peut être mesuré rapidement, avec précision et précision dans des échantillons de sperme humain, mais les coûts en temps augmentent considérablement et les résultats pourraient être obstrués si tous les biomarqueurs doivent être testés avec un seul cytomètre. Dans ce protocole, après le prélèvement et l’incubation immédiate à 37 °C pour la liquéfication, les échantillons de sperme ont été analysés plus en détail pour l’apoptose des spermatozoïdes à l’aide d’une coloration à l’isothiocyanate d’annexine V-fluorescéine (FITC) et à l’iodure de propidium (PI). Le MMP a été marqué à l’aide d’une sonde de 5,5′,6,6′-tétrachloro-1,1′,3,3′-tétraéthyl-benzimidazolylcarbocyanine iodure (JC-1), et les dommages à l’ADN ont été évalués à l’aide du test de structure de la chromatine spermatique (SCSA) avec coloration à l’acridine orange (AO). Ainsi, l’analyse par cytométrie en flux des marqueurs de la fonction des spermatozoïdes peut être une boîte à outils pratique et fiable pour le diagnostic de l’infertilité et l’évaluation de la fonction des spermatozoïdes à la fois sur le banc et au lit.

La figure 2 montre la mesure de l’apoptose des spermatozoïdes à l’aide de la coloration à l’annexine V-FITC/PI. Le signal FITC (fluorescence verte) a été mesuré dans le canal FL1, et le signal PI (fluorescence rouge) a été mesuré dans le canal FL2. Dans l’analyse bivariée de l’annexe V/PI, les fabricants de quadrants ont identifié quatre populations de spermatozoïdes distinctes. Les résultats ont été exprimés sous la forme de pourcentages de spermatozoïdes d’annexine V-/PI− (cellules viables ou vivantes), de spermatozoïdes d’annexine V+/PI− (cellules apoptotiques précoces ou cellules apoptotiques), de spermatozoïdes d’annexine V+/PI+ (cellules apoptotiques tardives) et de spermatozoïdes d’annexine V−/PI+ (cellules nécrotiques)16,17 (Figure 2B). Un témoin négatif (spermatozoïdes non colorés) a également été utilisé pour mettre en place la compensation et les quadrants (Figure 2A).
La figure 3 montre la mesure de la MMP à l’aide de la sonde JC-1 dans le sperme humain. Le % MMP est présenté comme le rapport de fluorescence orange-rouge/(vert + orange-rouge) en analysant le cytogramme. Un échantillon de sperme de bonne qualité présente généralement une fluorescence orange-rouge élevée et une faible fluorescence verte (mitochondries actives, quadrant supérieur gauche) (Figure 3A). À l’inverse, un échantillon de sperme de mauvaise qualité présente généralement une faible fluorescence orange-rouge et une fluorescence verte élevée (mitochondries inactives, quadrant inférieur droit), peut-être en raison d’une perturbation mitochondriale (Figure 3B).
La figure 4 montre les données de la SCSA13,14. Ces cytogrammes typiques de l’ASSC ont été obtenus à partir de deux échantillons individuels. L’échantillon A provenait d’un homme fertile et l’échantillon B d’un homme infertile. L’analyse des données de cytométrie en flux a été réalisée à l’aide du logiciel FlowJo. Les cytogrammes montrent la source de chaque composante des données de l’ACSS. L’axe des abscisses (fluorescence rouge avec 1 024 gradations de fluorescence rouge) indique un ADN fragmenté ; l’axe des ordonnées (fluorescence verte avec 1 024 gradations) indique la coloration native de l’ADN. La ligne pointillée à y = 750 représente la limite des spermatozoïdes normaux. Au-dessus de cette ligne de y = 750 se trouvent des spermatozoïdes avec de la chromatine partiellement non condensée, qui ont été déterminés comme des spermatozoïdes immatures.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63790/63790fig01.jpg"> Figure 1 : Flux de travail pour la détection de biomarqueurs de l’endommagement de la fonction des spermatozoïdes par cytométrie en flux. Des échantillons de sperme ont été prélevés et prétraités comme décrit à l’étape 1 du protocole. (1) la préparation des cellules, (2) la coloration avec des réactifs fluorescents, et (3) l’analyse par cytométrie en flux et l’interprétation des données. Abréviations : MMP = potentiel membranaire mitochondrial ; SCSA = test de la structure de la chromatine des spermatozoïdes ; PBS = solution saline tamponnée au phosphate ; AO = orange acridine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63790/63790fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63790/63790fig02.jpg"> Figure 2 : Résultats représentatifs de l’apoptose des spermatozoïdes par coloration à l’annexine V-FITC/PI. Le quadrant inférieur gauche contient les spermatozoïdes d’annexine V-/PI− (cellules viables ou vivantes), le quadrant inférieur droit montre les spermatozoïdes d’annexine V+/PI− (cellules apoptotiques précoces ou cellules apoptotiques), le quadrant supérieur droit représente les spermatozoïdes d’annexine V+/PI+ (cellules apoptotiques tardives) et le quadrant supérieur gauche contient les spermatozoïdes d’annexine V−/PI+ (cellules nécrotiques). (A) Contrôle négatif (spermatozoïdes non colorés) ; (B) un échantillon avec apoptose des spermatozoïdes. Abréviations : FITC = isothiocyanate de fluorescéine ; PI = iodure de propidium. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63790/63790fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63790/63790fig03.jpg"> Figure 3 : Mesure du potentiel membranaire mitochondrial à l’aide de la sonde JC-1. (A) La sous-population de spermatozoïdes avec une MMP élevée. (B) La sous-population de spermatozoïdes à faible MMP. Définissez FL1-A et FL2-A comme l’axe x (fluorescence verte) et l’axe y (fluorescence orange-rouge), respectivement. Abréviations : MMP = potentiel membranaire mitochondrial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63790/63790fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63790/63790fig04.jpg"> Figure 4 : Détection des dommages à l’ADN dans les spermatozoïdes humains à l’aide d’un test de la structure de la chromatine des spermatozoïdes. (A) Un échantillon de sperme avec une structure de chromatine normale. (B) Un échantillon de sperme avec une forte proportion de spermatozoïdes avec une structure de chromatine anormale. Le logiciel FlowJo a été utilisé pour créer des portes informatiques autour des populations cellulaires identifiées comme : 1) spermatozoïdes normaux, 2) spermatozoïdes HDS, 3) spermatozoïdes DFI et 4) débris cellulaires, et les pourcentages de spermatozoïdes HDS et DFI ont été calculés. Abréviation : SCSA = test de la structure de la chromatine des spermatozoïdes ; HDS = haute coloration de l’ADN ; DFI = indice de fragmentation de l’ADN. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63790/63790fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Le présent protocole fournit une solution pratique qui permet de mesurer l’apoptose, le potentiel de la membrane mitochondriale et les dommages à l’ADN dans les spermatozoïdes humains avec un seul cytomètre.

Analyse par cytométrie en flux de biomarqueurs pour la détection des défauts fonctionnels des spermatozoïdes humains

The conventional semen parameter analysis is widely used to assess male fertility. However, studies have found that ~15% of infertile patients show no ...

Cette technique présente une approche pratique pour estimer plusieurs biomarqueurs fonctionnels de spermatozoïdes humains par cytométrie en flux sans compromettre substantiellement la qualité de l’expérience induite par des temps d’attente prolongés. Cette technique peut être une boîte à outils pratique et fiable pour le diagnostic de l’infertilité et l’évaluation de la fonction des spermatozoïdes à la fois sur le banc et au lit, et compléter l’examen de routine du sperme. Cette procédure est réalisée avec la plate-forme Accuri C6 et elle pourrait être appliquée à d’autres plates-formes commerciales avec des modifications mineures.Pour commencer, incubez l’échantillon de sperme à 37 degrés Celsius et liquéfiez complètement l’échantillon pendant une heure. Pour compter les spermatozoïdes, mélangez soigneusement l’échantillon de sperme liquéfié, puis ajoutez 10 microlitres de sperme dans une chambre de comptage des spermatozoïdes et scannez la lame dans un analyseur de classe de sperme. Comptez au moins six zones et 400 spermatozoïdes pour estimer la concentration de spermatozoïdes.Pour la détection de l’apoptose des spermatozoïdes, à l’aide de la coloration à l’annexine-5 FITC PI, ajoutez 10 aux sixièmes spermatozoïdes dans un tube à centrifuger de 1,5 millilitre. Lavez les cellules avec 500 microlitres de PBS froid. Ensuite, centrifugez la suspension des spermatozoïdes et jetez le surnageant avant de remettre les cellules en suspension dans 200 microlitres de tampon de liaison.Ensuite, ajoutez deux microlitres d’annexine-5 FITC et deux microlitres de PI. Faites vortex doucement les cellules et incubez-les pendant 15 minutes à température ambiante dans l’obscurité avant de les placer dans le cytomètre en flux pour analyse. Pour l’analyse du potentiel membranaire mitochondrial, ou MMP, à l’aide de la sonde JC-1, ajoutez deux fois 10 aux sixièmes spermatozoïdes dans un tube de 1,5 millilitre et centrifugez. Après centrifugation, remettez en suspension la suspension de spermatozoïdes dans une solution de travail JC-1 d’un millilitre.Faites tourbillonner doucement les cellules et incubez-les pendant 20 minutes à 37 degrés Celsius dans l’obscurité. Encore une fois, centrifugez la suspension, jetez le surnageant et lavez la pastille deux fois avec un millilitre de PBS. Ensuite, suspendez à nouveau les spermatozoïdes colorés dans un millilitre de PBS dans un tube de cytomètre en flux et placez immédiatement le tube dans le cytomètre en flux pour analyse.Ensuite, utilisez le cyanure de carbonyle m-chlorophénylhydrazone, ou CCCP comme témoin positif. Remettre les spermatozoïdes en suspension dans un millilitre de solution de travail CCCP et les faire tourbillonner doucement avant d’incuber à température ambiante pendant 20 minutes. Après l’incubation, centrifugez la suspension, jetez le surnageant et effectuez les étapes d’analyse de la MMP à l’aide de la sonde JC-1 comme démontré.Pour le test de la structure de la chromatine des spermatozoïdes, ou SCSA, décongelez l’échantillon de sperme au bain-marie à 37 degrés Celsius et diluez-le avec un tampon TNE à une concentration d’une à deux fois 10 à la sixième cellule par millilitre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de l’échantillon dilué dans un tube à essai de cytomètre en flux et mélangez-le avec 400 microlitres de solution acide. Colorer l’échantillon avec 1,2 millilitre de solution d’acridine orange.Utilisez un échantillon de référence comme étalon interne pour la configuration et les étalonnages du cytomètre en flux. Diluer l’échantillon avec un tampon TNE à quatre degrés Celsius à une concentration d’une à deux fois 10 à six cellules par millilitre, et effectuer les étapes pour l’ACSS, comme démontré. Ouvrez le logiciel du cytomètre en flux et démarrez le cytomètre.Pour collecter des données d’échantillon, chargez un échantillon de contrôle sur le cytomètre en flux et cliquez sur Exécuter pour démarrer la collecte de données. Créez des diagrammes à points pour afficher les données. Sélectionnez les paramètres de l’axe XY et affichez linéaire pour spécifier les données.Ensuite, sélectionnez et appliquez une porte polygonale pour délimiter la population de spermatozoïdes à analyser. Pour l’apoptose des spermatozoïdes, définissez FL1 comme axe X et FL2 comme axe Y. Ensuite, pour isoler les cellules apoptotiques ou nécrotiques vivantes, appuyez et faites glisser la porte du quadrant pour subdiviser les populations de spermatozoïdes en quatre populations spécifiques.Pour MMP, définissez FL1 comme axe X et FL2 comme axe Y. Ensuite, créez une porte polygonale pour subdiviser les populations de spermatozoïdes en deux populations spécifiques. Pour SCSA, définissez FL4 comme axe X et FL1 comme axe Y.Dessinez la porte, définissez un angle de 45 degrés pour exclure les signaux de débris cellulaires. Calculez 10 000 spermatozoïdes pour chaque échantillon pour les analyses d’apoptose des spermatozoïdes, MMP et SCSA, définissez une limite de traitement pour indiquer quand arrêter la collecte de données, le taux fluidique, en fonction du nombre de cellules et le seuil pour éliminer les débris et le bruit. Appliquez ces paramètres à tous les échantillons.Si nécessaire, réglez la compensation des couleurs pour corriger les débordements fluorescents. Pipetez doucement l’échantillon avant de le charger sur le cytomètre en flux. Ensuite, entrez le nom de l’exemple et cliquez sur Exécuter.Une fois l’exécution terminée, enregistrez les exemples de données en tant que fichier FCS en donnant un nom de fichier pour une analyse plus approfondie. La mesure de l’apoptose des spermatozoïdes à l’aide de la coloration FITC PI à l’annexine-cinq est présentée ici. Cette analyse comprenait un contrôle négatif des spermatozoïdes non colorés pour définir la compensation et les quadrants.Dans un échantillon présentant une apoptose des spermatozoïdes, les résultats ont été exprimés sous la forme de pourcentages de cellules apoptotiques précoces ou apoptotiques viables ou vivantes, d’apoptose tardive et de cellules nécrotiques. La sous-population de spermatozoïdes avec une MMP élevée et faible est montrée ici. Un échantillon de sperme de bonne qualité a montré une fluorescence orange élevée et une faible fluorescence verte.À l’inverse, un échantillon de sperme de mauvaise qualité présentait une faible fluorescence orange et une fluorescence verte élevée. Les cytogrammes SCSA d’un homme fertile et infertile sont présentés ici. La population de spermatozoïdes a été identifiée comme normale avec une stabilité élevée de l’ADN, un indice de fragmentation de l’ADN et des débris cellulaires.L’échantillon de sperme doit être incubé à 37 degrés Celsius et complètement liquéfié pendant une heure maximum.

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