Préparation et analyse morphologique de cultures de cellules de crête neurale crânienne de poussin

Les cellules de la crête neurale émigrent des plis neuraux crâniens dans les embryons ou lorsqu’elles sont placées en culture. Cela fournit une méthode pratique pour isoler les cellules de la crête neurale migratoire primaire sans dissociation cellulaire. Alors que la migration de la crête neurale se produit généralement dans l’environnement embryonnaire tridimensionnel, la culture bidimensionnelle permet la visualisation et l’investigation des processus liés à la migration.

Bien qu’il existe des protocoles de culture de plis neuraux crâniens, cette méthode nécessite une formation et des étapes spécifiques à l’organisme. Cette vidéo démontre des techniques pour faciliter la préparation reproductible de cultures de plis neuraux crâniens de poussins. Les débutants ont souvent du mal à disséquer et à plaquer les plis neuronaux et à évaluer les résultats de la culture.

Le respect des directives de dissection et l’application de l’analyse morphométrique décrite ici permettent d’obtenir des résultats quantitatifs cohérents. Pour commencer, placez les œufs fécondés en position verticale à l’intérieur d’un incubateur humidifié à 38 degrés Celsius. Après avoir retiré les œufs de l’incubateur, désinfectez les coquilles en pulvérisant soigneusement de l’éthanol à 70% et en les laissant sécher.

Pour fixer et colorer les cultures, utilisez des lamelles de couvercle en verre placées dans une boîte de culture tissulaire multipuits et pipeter suffisamment de solution de fibronectine pour couvrir le fond du puits. Ensuite, replacez le couvercle et incuber la plaque avec une solution de fibronectine dans un incubateur humidifié à 38 degrés Celsius pendant au moins une heure tout en disséquant les plis neuraux. Utilisez des pinces émoussées pour percer un petit trou dans la coquille à 1/4 à 1/3 de la longueur de l’œuf.

Insérez délicatement la pince émoussée dans le petit trou, en veillant à ne pas perturber le jaune. Ensuite, coupez la coquille autour de l’œuf, retirez le dessus de la coquille d’œuf et positionnez l’embryon pour l’isoler. Préparez l’embryon en utilisant doucement le bord plat des pinces émoussées fermées pour essuyer tout excès d’albumine sur la surface du jaune recouvrant l’embryon.

Utilisez une pince pour placer un cadre de support en papier filtre sur l’embryon, avec l’embryon dans la fenêtre du cadre. Appuyez doucement sur le papier filtre pour adhérer au jaune. Couper autour de l’extérieur du cadre en papier filtre avec des ciseaux à dissection.

Utilisez des pinces ou des pointes de ciseaux pour saisir le bord du cadre et soulevez doucement l’embryon loin du jaune. Placez l’embryon avec le cadre en papier vers le bas dans une boîte de Petri de 60 ou 100 millilitres remplie de Ringer avec stylo-streptocoque. Gardez la boîte d’embryons sur la glace si vous les prélevez pour une application en aval d’ARN ou de protéines sensibles.

Transférer un embryon dans une boîte propre contenant la solution de pen-streptocoque de Ringer. Agitez doucement l’embryon d’avant en arrière pour éliminer tout jaune qui obscurcit la vue, et échangez la solution stylo-streptocoque du sonneur ou transférez-la dans un plat frais s’il devient trouble. Placez l’embryon dorsal et le cadre vers le haut sous un microscope à dissection.

Laissez l’embryon sur le cadre en papier pour le maintenir étiré et maintenu en place. Ensuite, retirez la membrane vitelline, en utilisant des pinces pour exposer les plis neuraux. Inclure la caudale des tissus aux vésicules optiques en expansion et les rostrales au cerveau postérieur, où les constrictions rhombomères commencent tout juste à apparaître.

À l’aide de ciseaux à ressort, excisez soigneusement les plis neuraux du mésencéphale. Prenez soin d’exciser l’aspect le plus dorsal du pli neural avec une contamination minimale du tube neural et de l’ectoderme non neural, et transférez les plis neuraux dans une boîte propre contenant la solution stylo-streptocoque de Ringer à l’aide d’une pipette P20 ou d’une pipette Pasteur en verre stérile rincée avec la solution de stylo-streptocoque jaune de Ringer. Conservez les plis collectés sur de la glace tout en disséquant les plis supplémentaires.

Après avoir retiré la capsule de culture de l’incubateur, utilisez une pipette ou une pipette Pasteur pour retirer la solution de fibronectine des lamelles de couvercle, de la capsule ou du puits. Après avoir rincé le substrat recouvert de fibronectine avec la solution stylo-streptocoque de Ringer, ajouter un volume approprié de milieu de culture complet dans la capsule ou le puits. Pour bloquer le plastique et empêcher le tissu de coller, utilisez un pipetor P20 ou P200 et rincez l’embout de la pipette avec la solution de stylo-streptocoque jaune de Ringer.

Ensuite, transférez les plis neuronaux isolés vers le centre de la housse recouverte de fibronectine, en prenant soin de transférer le moins possible la solution de stylo-streptocoque de Ringer. Après avoir laissé les explants se déposer pendant 10 à 15 minutes, placez-les dans une chambre humidifiée à 38 degrés Celsius en portant lentement et soigneusement le plat de culture avec des plis neuronaux plaqués. Retirez le milieu de culture à l’aide d’une pipette Pasteur et rincez les puits avec du PBS stérilisé par filtre.

Ajouter 4% de paraformaldéhyde et le conserver sur une plate-forme agitateur pendant 15 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, enlever le paraformaldéhyde, rincer les puits trois fois avec du PBS et ajouter du PBST contenant 5% de sérum. Maintenant, pipeter 30 microlitres de phalloïdine conjuguée Oregon Green 200-nanomolaire sur une surface lisse pour chaque glissement de couvercle.

À l’aide d’une paire de pinces, retirez le couvercle du PBST contenant 5% de sérum, en assurant l’orientation des cellules vers le haut. Évacuez l’excès de liquide en touchant brièvement le bord du couvercle à un essuie-glace délicat. Placer délicatement chaque couvercle glisser côté cellule vers le bas sur la goutte de phalloïdine diluée et incuber pendant 30 minutes à température ambiante.

Après la période d’incubation, soulevez le couvercle de la solution de coloration et replacez-le dans la boîte de culture, en le retournant pour que le côté cellulaire soit relevé. Assurez-vous de couvrir le bordereau de couverture avec PBST et placez-le sur un agitateur de plate-forme pendant 10 minutes, en gardant les bordereaux de couverture couverts et dans l’obscurité. Retirez le PBST et lavez deux fois les feuillets de couvercle pour un total de trois lavages de 10 minutes.

Placez une goutte de support de montage sur une lame de microscope. Montez la cellule de glissement du couvercle côté vers le bas en abaissant lentement le glissement du couvercle à un angle sur le support de montage pour éviter de créer des bulles et permettre au support de se définir avant l’imagerie. Enfin, imagez les cellules colorées et exportez-les sous forme de fichiers TIFF.

Les cellules de la crête neurale ont commencé à émerger des explants adhérents du pli neural dans les trois à quatre heures suivant l’incubation, et la migration a été achevée après environ 20 heures. Les cellules de la crête neurale migratoire ont été marquées à l’aide de HNK-1, et la plupart des cellules semblaient être HNK-1 positives. Les cellules de la crête neurale migrées ont été visualisées en colorant l’actine filamenteuse avec de la phalloïdine.

Les images des cellules colorées à la phalloïdine ont été traitées à l’aide d’ImageJ pour produire une image de seuil dans laquelle les cellules apparaissaient noires avec un fond blanc. L’image du seuil a été analysée et diverses mesures affichées dans des graphiques à barres contrastés ou des tracés de violon. Par exemple, la surface moyenne des 69 cellules analysées était d’environ 802,11 micromètres carrés, allant de 60,27 à 2 664,53 micromètres carrés.

La circularité reflète la saillie de la cellule et varie de 0,101 à 0,875. Les valeurs inférieures indiquent une forme allongée, tandis qu’une valeur de un indique un cercle parfait. La plupart des cellules présentaient une forme allongée, ce qui est le plus facilement visible dans le tracé du violon.

Les cellules de crête neurale migratrices dans ce domaine avaient un rapport d’aspect moyen d’environ 2,13, et un rapport d’aspect de un indique une forme symétrique. Une excision et un placage d’explantation soigneux sont cruciaux pour des cultures réussies. Laissez les plis neuronaux se déposer côté coupé vers le bas pendant 10 à 15 minutes, puis transférez-les lentement dans l’incubateur pour favoriser l’adhérence.

Les variations de ces techniques comprennent la manipulation génétique transitoire avant la culture et l’imagerie accélérée pendant l’incubation. De plus, ce protocole permet la collecte de populations de cellules de crête neurale prémigratoires et migratrices pour une analyse au niveau omique.