Name: Identifier l’interaction entre les cellules tueuses naturelles et les neurones nocicepteurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Découvrez une méthode de co-culture pour étudier l'interaction entre les neurones nocicepteurs et les cellules NK dans un contexte inflammatoire. Cette approche permet d'analyser comment les neurones modulent la fonction anti-tumorale des cellules NK.

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Ces travaux ont été financés par le Fonds Nouvelles frontières en recherche (NFRFE201901326), les Instituts de recherche en santé du Canada (162211, 461274, 461275), la Fondation canadienne pour l’innovation (37439), le Programme des chaires de recherche du Canada (950-231859), le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (RGPIN-2019-06824) et le Fonds de recherche du Québec Nature et technologies (253380).

Les comités institutionnels de soin et d’utilisation des animaux de l’Université de Montréal (#22053, #22054) ont approuvé toutes les procédures relatives aux animaux. Voir le tableau 1 pour une liste des solutions et de leur composition et le tableau des matériaux pour une liste des matériaux, de l’équipement et des réactifs utilisés dans ce protocole.
1. Isolement, culture et stimulation des cellules NK
<ol><li>Générer un neurone nocicepteur intact (contrôle des compagnons de portée; TRPV1wt::D TAfl/wt) et des souris ablées (TRPV1 cre::D TA fl/wt) en croisant des souris lox-stop-lox-toxine diphtérique (DTA fl/fl) avec des souris TRPV1cre/wt.</li>
	<li>À l’aide de l’inhalation de CO2, euthanasier une souris témoin naïve (TRPV1 wt::D TAfl/wt).</li>
	<li>Recueillir la rate dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL contenant 500 μL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile.</li>
	<li>Homogénéiser la rate à l’aide d’un pilon.</li>
	<li>Diluer les cellules avec 1 mL de PBS stérile.</li>
	<li>Filtrer le mélange à travers une crépine cellulaire de 50 μm dans un tube conique de 15 mL.</li>
	<li>Remplissez le volume (10 ml) avec du PBS stérile.</li>
	<li>Prélever 10 μL et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger les cellules (500 × g, 5 min) et retirer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre les cellules à une concentration de 108 cellules/mL dans un milieu RPMI 1640 supplémenté.</li>
	<li>Suivez les instructions du fabricant pour purifier magnétiquement les cellules NK de la rate à l’aide d’un kit d’isolation des cellules NK de souris. Confirmer la pureté des cellules NK à l’aide de la cytométrieen flux 11.</li>
	<li>Prélever 10 μL et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger les cellules (500 × g, 5 min) et retirer le surnageant.</li>
	<li>Resuspendre les cellules NK dans le milieu de culture RPMI 1640 supplémenté (contenant IL-2 et IL-15).</li>
	<li>Culture 2 × 106 cellules NK/ml dans une plaque de fond en U à 96 puits pendant 48 h.</li>
</ol>2. Isolement et culture des neurones DRG
<ol><li>24 h avant la fin de la stimulation des cellules NK (étape 1.15), enduire une plaque de 96 puits de 100 μL/puits de laminine (1 ng/mL) et incuber pendant 45 min (37 °C).</li>
	<li>Après l’incubation, retirez la solution et laissez les puits sécher à l’air libre dans une enceinte de biosécurité.</li>
	<li>En inhalant du CO2 , euthanasier le neurone nocicepteur intact (contrôle du compagnon de portée; TRPV1wt::D TAfl/wt) ou ablée (TRPV1cre::D TAfl/wt). REMARQUE: L’inhalation de CO2 est préférable à la luxation cervicale car elle évite de perturber les nerfs spinaux connectés au DRG.</li>
	<li>Fixez la souris sur la planche en position couchée, soulevez la peau et incisez la peau le long de la colonne dorsale. Reportez-vous à Perner et al. pour une vidéo détaillée12.</li>
	<li>Coupez l’articulation lombo-sacrée et séparez le sacrum de la colonne lombaire avec des ciseaux.</li>
	<li>Séparez la colonne vertébrale en coupant les muscles et les côtes des deux côtés de la colonne vertébrale dans le sens crânien jusqu’à ce que la base du crâne soit atteinte.</li>
	<li>À l’aide de ciseaux, couper la colonne vertébrale au niveau de l’articulation atlanto-occipitale.</li>
	<li>Retirez les muscles et les tissus adipeux de la colonne vertébrale.</li>
	<li>Épinglez et ouvrez la colonne vertébrale pour retirer la moelle épinière et accéder au DRG. Recherchez le DRG dans le foramina intervertébral relié à la moelle épinière par la racine dorsale mais séparé des méninges.</li>
	<li>Récolter les DRG dans un tube conique de 15 mL rempli de 10 mL de DMEM supplémenté en froid glacé.</li>
	<li>Centrifuger la préparation (200 × g, 5 min, température ambiante) et retirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 250 μL de PBS contenant de la collagénase IV (1 mg/mL) et de la dispase II (2,4 U/mL).</li>
	<li>Incuber le DRG avec la solution de collagénase IV/Dispase II (C/D) (80 min, 37 °C, agitation légère). Lors de la mise en commun des ganglions de plusieurs souris, maintenir un rapport de 125 μL de solution C/D par ganglion.</li>
	<li>Pour inactiver les enzymes, ajoutez 5 mL de milieu DMEM supplémenté.</li>
	<li>Centrifuger la solution (200 × g, 5 min) et retirer délicatement le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Pour éviter la perte cellulaire indésirable, laissez ~100 μL du surnageant.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de milieu DMEM supplémenté.</li>
	<li>À l’aide d’un pistolet à pipette et de trois pipettes Pasteur en verre de tailles décroissantes, triturer doucement (~10 haut/bas par pipette Pasteur) le DRG en une préparation unicellulaire.</li>
	<li>Dans une enceinte de biosécurité, diluer l’albumine sérique bovine (BSA) dans du PBS stérile jusqu’à une concentration finale de 15 %. Conserver 1 mL d’aliquotes à −20 °C.</li>
	<li>Créer un gradient de BSA dans un tube conique de 15 mL en ajoutant 2 mL de PBS stérile et en distribuant lentement 1 mL de solution de BSA à 15% au fond du tube. Évitez de perturber le gradient en retirant doucement la pipette.</li>
	<li>À l’aide d’une pipette P200, pipeter lentement la suspension ganglionnaire triturée (qui contient les neurones) sur le côté du tube dans le gradient.</li>
	<li>Centrifuger le gradient BSA contenant des neurones (200 × g, 12 min, température ambiante). Réglez l’accélération et la décélération de la centrifugeuse à la vitesse minimale. REMARQUE: Après centrifugation, les neurones seront au fond du tube tandis que les débris cellulaires seront piégés dans le gradient BSA.</li>
	<li>Retirer délicatement tout le surnageant à l’aide d’une pipette.</li>
	<li>Remettez les cellules en suspension dans 500 μL de Neurobasal.</li>
	<li>Plaque 104 neurones par puits (200 μL de neurobasal/puits) dans une plaque de 96 puits à fond plat recouverte de laminine. REMARQUE: En moyenne, un enquêteur sera en mesure de remplir ~ 8 puits par souris.</li>
	<li>Culture des neurones (37 °C, pendant la nuit) pour permettre l’attachement.</li>
</ol>3. Co-culture et cytométrie en flux
<ol><li>Retirez lentement le neurobasal de la culture neuronale.</li>
	<li>Après 48 h de stimulation avec IL-2 et IL-15 (voir étapes 1.14-1.15), remettre en suspension les cellules NK et ajouter 105 cellules NK / puits à la culture de neurones (plaque inférieure plate à 96 puits). REMARQUE: En moyenne, l’enquêteur sera en mesure de remplir ~ 6 puits par souris.</li>
	<li>Co-culture des cellules en MX neurobasale supplémentée (37 °C, 48 h).</li>
	<li>Recueillir les cellules, laver avec du PBS (3x) et centrifuger (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Jeter le surnageant et colorer les cellules avec Viability Dye eFlour-780 (1:1 000, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Recueillir les cellules, laver avec du PBS (3x) et centrifuger (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Bloquer les sites non spécifiques sur les cellules avec CD16/32 (1:100, 15 min, 4 °C).</li>
	<li>Recueillir les cellules, laver avec du PBS (3x) et centrifuger (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Coloration (15 min, 4 °C) des cellules avec BV421 anti-NK-1.1 (1:100), isothiocyanate de fluorescéine (FITC) anti-NKp46 (1:100) et phycoérythrine (PE) anti-GM-CSF (1:100).</li>
	<li>Recueillir les cellules, laver avec du PBS (3x) et centrifuger (500 × g, 5 min, 4 °C).</li>
	<li>Jeter le surnageant, remettre les cellules en suspension dans le tampon FACS (500 μL) et immunophénotyper les cellules NK par cytométriede flux 11. Voir la figure 1A pour la stratégie d’établissement de points de contrôle.</li>
</ol>

<ol><li>Berta, T., Qadri, Y., Tan, P. H., Ji, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+dorsal+root+ganglia+and+primary+sensory+neurons+for+the+treatment+of+chronic+pain%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opinion+on+Therapeutic+Targets%22%5BJournal%5D)">Targeting dorsal root ganglia and primary sensory neurons for the treatment of chronic pain.</a> Expert Opinion on Therapeutic Targets. 21 (7), 695-703 (2017).</li>
<li>Baral, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptor+sensory+neurons+suppress+neutrophil+and+gammadelta+T+cell+responses+in+bacterial+lung+infections+and+lethal+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Nociceptor sensory neurons suppress neutrophil and gammadelta T cell responses in bacterial lung infections and lethal pneumonia.</a> Nature Medicine. 24, 417-426 (2018).</li>
<li>Binshtok, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nociceptors+are+interleukin-1beta+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nociceptors are interleukin-1beta sensors.</a> Journal of Neuroscience. 28 (52), 14062-14073 (2008).</li>
<li>Chesne, J., Cardoso, V., Veiga-Fernandes, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuro-immune+regulation+of+mucosal+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunology%22%5BJournal%5D)">Neuro-immune regulation of mucosal physiology.</a> Mucosal Immunology. 12 (1), 10-20 (2019).</li>
<li>Samad, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1beta-mediated+induction+of+Cox-2+in+the+CNS+contributes+to+inflammatory+pain+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1beta-mediated induction of Cox-2 in the CNS contributes to inflammatory pain hypersensitivity.</a> Nature. 410 (6827), 471-475 (2001).</li>
<li>Godinho-Silva, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-entrained+and+brain-tuned+circadian+circuits+regulate+ILC3s+and+gut+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Light-entrained and brain-tuned circadian circuits regulate ILC3s and gut homeostasis.</a> Nature. 574, 254-258 (2019).</li>
<li>Talbot, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feeding-dependent+VIP+neuron-ILC3+circuit+regulates+the+intestinal+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Feeding-dependent VIP neuron-ILC3 circuit regulates the intestinal barrier.</a> Nature. 579, 575-580 (2020).</li>
<li>Raulet, D. H., Gasser, S., Gowen, B. G., Deng, W., Jung, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ligands+for+the+NKG2D+activating+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Regulation of ligands for the NKG2D activating receptor.</a> Annual Review of Immunology. 31, 413-441 (2013).</li>
<li>Vivier, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+or+adaptive+immunity%3F+The+example+of+natural+killer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate or adaptive immunity? The example of natural killer cells.</a> Science. 331, 44-49 (2011).</li>
<li>Davies, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+Killer+Cells+Degenerate+Intact+Sensory+Afferents+following+Nerve+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Natural Killer Cells Degenerate Intact Sensory Afferents following Nerve Injury.</a> Cell. 176, 716-728 (2019).</li>
<li>Perner, C., Sokol, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+dissection+and+culture+of+murine+dorsal+root+ganglia+neurons+to+study+neuropeptide+release%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for dissection and culture of murine dorsal root ganglia neurons to study neuropeptide release.</a> STAR Protocols. 2, 100333(2021).</li>
<li>Goswami, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signatures+of+mouse+TRPV1-lineage+neurons+revealed+by+RNA-Seq+transcriptome+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pain%22%5BJournal%5D)">Molecular signatures of mouse TRPV1-lineage neurons revealed by RNA-Seq transcriptome analysis.</a> Journal of Pain. 15, 1338-1359 (2014).</li>
<li>Mishra, S. K., Tisel, S. M., Orestes, P., Bhangoo, S. K., Hoon, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPV1-lineage+neurons+are+required+for+thermal+sensation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">TRPV1-lineage neurons are required for thermal sensation.</a> EMBO J. 30, 582-593 (2011).</li>
<li>Kim, H. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Attenuation+of+natural+killer+cell+functions+by+capsaicin+through+a+direct+and+TRPV1-independent+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Attenuation of natural killer cell functions by capsaicin through a direct and TRPV1-independent mechanism.</a> Carcinogenesis. 35, 1652-1660 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Davies et al.11 ont constaté que les neurones blessés régulent positivement RAE1. Grâce au contact cellule-cellule, les cellules NK exprimant NKG2D ont ensuite pu identifier et éliminer les neurones RAE1+ , ce qui limite la douleur chronique11. Étant donné que les cellules NK expriment également divers récepteurs neuropeptidiques et que ces neuropeptides sont connus pour leurs capacités immunomodulatrices, il semble de plus en plus important d’étudier l’...

Les corps cellulaires des neurones sensoriels proviennent des ganglions de la racine dorsale (DRG). Les DRG sont situés dans le système nerveux périphérique (SNP), entre la corne dorsale de la moelle épinière et les terminaisons nerveuses périphériques. La nature pseudo-unipolaire des neurones DRG permet le transfert de l’information de la branche périphérique, qui innerve le tissu cible, vers la branche centrale, qui transporte l’information somatosensorielle vers la moelle épinière1. À l’aide de récepteurs de canaux ioniques spécialisés, les neurones de premier ordre détectent les menaces posées par les agents pathogènes, les allergènes et les polluants2, conduisant à l’afflux de cations (Na+, Ca2+) et à la génération d’un potentiel d’action 3,4,5.
Ces neurones envoient également un potentiel d’action antidromique vers la périphérie, où la détection initiale du danger s’était produite, ce qui conduit à la libération locale des neuropeptides 1,4. Par conséquent, les neurones nocicepteurs servent de mécanisme de protection, alertant l’hôte du danger environnemental 4,5,6,7.
Pour communiquer avec les neurones de second ordre, les nocicepteurs libèrent divers neurotransmetteurs (p. ex. glutamate) et neuropeptides (p. ex. peptide lié au gène de la calcitonine (CGRP), substance P (SP) et peptide intestinal vasoactif (VIP))6,7. Ces peptides agissent sur les capillaires et favorisent l’extravasation plasmatique, l’œdème, l’afflux local et la modulation des cellules immunitaires 2,4,7.
Les systèmes somatosensoriel et immunitaire utilisent un système de communication partagé composé de cytokines et de neuropeptides, et de leurs récepteurs apparentésrespectifs 4. Bien que cette communication bidirectionnelle aide à protéger du danger et à préserver l’homéostasie, elle peut également contribuer à la physiopathologie de la maladie4.
Les cellules NK sont classées comme cellules lymphoïdes innées et sont spécialisées pour éliminer les cellules infectées par le virus. La fonction des cellules NK est régie par un équilibre de récepteurs stimulateurs et inhibiteurs, y compris le récepteur activateur NKG2D8. Le ligand endogène de NKG2D, acide rétinoïque inductible précoce1 (RAE1), est exprimé par des cellules subissant des stress tels que tumorigenèse et infection 8,9.
Des recherches récentes ont montré que les lésions nerveuses périphériques conduisent les neurones sensoriels à exprimer des molécules inadaptées telles que la stathmine 2 (STMN2) et RAE1. Ainsi, par contact cellule-cellule, les cellules NK exprimant NKG2D ont été activées par interaction avec les neurones exprimant RAE1. À leur tour, les cellules NK ont été capables d’éliminer les neurones nocicepteurs blessés et l’hypersensibilité à la douleur contondante normalement associée à une lésion nerveuse10. En plus de l’axe NKG2D-RAE1, les cellules NK expriment les récepteurs apparentés de divers médiateurs produits par les nocicepteurs. Il est donc possible que ces médiateurs modulent l’activité des cellules NK. Cet article présente une méthode de co-culture pour étudier la biologie de l’interaction neurone-cellule NK nocicepteur. Cette approche aidera à faire progresser la compréhension de la façon dont les neurones nocicepteurs modulent les réponses innées des cellules immunitaires aux blessures, aux infections ou aux tumeurs malignes.

<table><tbody><tr><td>Anti-souris CD16/32</td><td>Jackson Laboratory</td><td>N° de chat : 017769</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Jackson Laboratory</td><td>N° de chat : 009669</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA) de qualité de culture</td><td>World Precision Instruments</td><td>N° de catalogue : 504167</td><td></td></tr><tr><td>BV421 anti-souris NK-1.1</td><td>Fisher Scientific</td><td>N° de chat : 12430112</td><td></td></tr><tr><td>Passoire à cellules (50 &mu ; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>N° de chat : A3160702</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase IV</td><td>Fisher Scientific</td><td>N° de chat : 15140148</td><td></td></tr><tr><td>Toxine diphtériafl/fl</td>Fisher <td>Scientific</td><td>N° de chat : SH3057402</td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Fisher Scientific</td><td>N° de chat : 13-678-20B</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>Cat n° : 07-200-95</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse NK Cell Isolation Kit</td><td>Sigma</td><td>Cat no : CLS2595</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>Sigma</td><td>Cat no : C0130</td><td></td></tr><tr><td>FACSAria III</td><td>Sigma</td><td>Cat no : 04942078001</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovin sérum bovin (FBS)</td><td>Sigma</td><td>Cat no : 806552</td><td></td></tr><tr><td>FITC anti-souris NKp46</td><td>Sigma</td><td>Cat no : L2020</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à fond plat à 96 puits</td><td>Sigma</td><td>N° de cat : 03690</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur en verre</td><td>Sigma</td><td>N° de cat : 470236-274</td><td></td></tr><tr><td>Facteur neurotrophique dérivé de la lignée cellulaire gliale (GDNF)</td><td>VWR</td><td>N° de cat : 02-0131</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Cedarlane</td><td>N° de cat : 03-50/31</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Gibco</td><td>N° de cat : A14867-01</td><td></td></tr><tr><td>Souris IL-15 recombinante</td><td>Gibco</td><td>N° de cat : 22400-089</td><td></td></tr><tr><td>Souris recombinante IL-2</td><td>Gibco</td><td>N° de cat : 21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Facteur de croissance nerveuse (NGF)</td><td>Life Technologies</td><td>N° de cat : 13257-019</td><td></td></tr><tr><td>Milieu neurobasal</td><td>PeproTech</td><td>N° de cat : 450-51-10</td><td></td></tr><tr><td>PE anti-souris GM-CSF</td><td>PeproTech</td><td>N° de cat : 212-12</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline et Streptomycine</td><td>PeproTech</td><td>N° de cat : 210-15</td><td></td></tr><tr><td>Pestles</td><td>Stem Cell Technology</td><td>N° de cat : 19855</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Biolegend</td><td>N° de cat : 108732</td><td>Clone PK136</td></tr><tr><td>RPMI 1640 media</td><td>Biolegend</td><td>N° de cat : 137606</td><td>Clone 29A1.4</td></tr><tr><td>TRPV1Cre</td><td>Biolegend</td><td>N° de cat : 505406</td><td>Clone MP1-22E9</td></tr><tr><td>Pinces à épiler et outils de dissection.</td><td>Biolegend</td><td>N° de cat : 65-0865-14</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à 96 puits à fond en U</td><td>Biolegend</td><td>N° de cat : 101319</td><td></td></tr><tr><td>Viability Dye eFlour-780</td><td>Becton Dickinson</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

identifier l’interaction entre les cellules tueuses naturelles et les neurones nocicepteurs

Teasing Out the Interplay Between Natural Killer Cells and Nociceptor Neurons

Les neurones somatosensoriels ont évolué pour détecter les stimuli nocifs et activer les réflexes défensifs. En partageant des moyens de communication, les neurones nocicepteurs ajustent également les défenses de l’hôte en contrôlant l’activité du système immunitaire. La communication entre ces systèmes est principalement adaptative, aidant à protéger l’homéostasie, elle peut également conduire à, ou favoriser, l’apparition de maladies chroniques. Les deux systèmes ont co-évolué pour permettre une telle interaction locale, comme on le trouve dans les tissus lymphoïdes primaires et secondaires et les muqueuses. Des études récentes ont démontré que les nocicepteurs détectent directement les antigènes étrangers, les cytokines dérivées des cellules immunitaires et les microbes et y répondent.
L’activation des nocicepteurs entraîne non seulement une hypersensibilité à la douleur et des démangeaisons, mais abaisse le seuil de déclenchement des nocicepteurs, conduisant à la libération locale de neuropeptides. Les peptides qui sont produits par, et libérés de, les terminaisons périphériques des nocicepteurs peuvent bloquer la chimiotaxie et la polarisation des lymphocytes, contrôlant la localisation, la durée et le type d’inflammation. Des preuves récentes montrent que les neurones sensoriels interagissent avec les cellules immunitaires innées par contact cellule-cellule, par exemple, engageant les récepteurs du groupe 2D (NKG2D) sur les cellules tueuses naturelles (NK).
Étant donné que les cellules NK expriment les récepteurs apparentés de divers médiateurs produits par les nocicepteurs, il est concevable que les nocicepteurs utilisent des neuropeptides pour contrôler l’activité des cellules NK. Ici, nous concevons une méthode de co-culture pour étudier les interactions neurone-cellule NK dans une boîte. En utilisant cette approche, nous avons constaté que les neurones nocicepteurs lombaires diminuent l’expression des cytokines des cellules NK. Dans l’ensemble, une telle méthode réductionniste pourrait être utile pour étudier comment les neurones innervant les tumeurs contrôlent la fonction anticancéreuse des cellules NK et comment les cellules NK contrôlent l’élimination des neurones lésés.

Les cellules NK ont été purifiées magnétiquement à partir de splénocytes de souris témoins (TRPV1 wt::D TAfl/wt) et stimulées (48 h) avec IL-2 et IL-15. Les cellules NK ont ensuite été cultivées seules ou co-cultivées avec des neurones DRG prélevés à partir de neurones nocicepteurs intacts (contrôle des compagnons de portée; TRPV1wt::D TAfl/wt) ou ablated (TRPV1cre::D TAfl/wt). Les cellules ont ensuite été exposées à l’agoniste TRPV1 capsaïcine (1 μM) ou à...

Les neurones nocicepteurs et les cellules NK interagissent activement dans un contexte inflammatoire. Une approche de co-culture permet d’étudier cette interaction.

Identifier l’interaction entre les cellules tueuses naturelles et les neurones nocicepteurs

Somatosensory neurons have evolved to detect noxious stimuli and activate defensive reflexes. By sharing means of communication, nociceptor neurons also ...

Étant donné que les neurones nocicepteurs sécrètent divers neuropeptides et que les cellules NK expriment le récepteur de ces neuropeptides, nous avons décidé de concevoir une méthode de co-culture pour étudier l’interaction entre la cellule NK et les neurones nocicepteurs. Une telle méthode réductionniste pourrait être utile pour étudier comment les neurones nocicepteurs contrôlent la fonction antitumorale des cellules NK, et il pourrait également être intéressant d’étudier comment les cellules NK contrôlent l’élimination des neurones lésés. La démonstration de la procédure sera faite par Ali Ahmadi, un ancien étudiant en maîtrise de mon laboratoire.Pour commencer l’isolement et la culture des cellules tueuses naturelles ou NK, recueillir la rate de souris dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de PBS stérile, puis homogénéiser la rate à l’aide d’un pilon. Ensuite, diluez les cellules avec un millilitre de PBS stérile et filtrez le mélange à travers une passoire cellulaire de 50 microns dans un tube conique de 50 millilitres. Complétez le volume d’homogénat filtré à 10 millilitres en utilisant du PBS stérile.Compter les cellules dans 10 microlitres de l’homogénat dilué à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger les cellules restantes pendant cinq minutes à 500 G et retirer le surnageant. Puis remettre les cellules en suspension à 10 à la huitième cellule par millilitre dans un milieu RPMI 1640 supplémenté.Purifiez magnétiquement les cellules NK de la rate à l’aide d’un kit d’isolation de cellules NK de souris et confirmez la pureté des cellules NK à l’aide de la cytométrie en flux. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre, suivi d’une centrifugation à cinq minutes à 500 G, puis retirer le surnageant. Pour stimuler les cellules NK granulées, remettre ces cellules en suspension dans un milieu de culture RPMI 1640 supplémenté en IL-2 et IL-15.Culture deux fois 10 à la sixième cellule NK par millilitre dans une plaque de fond en U de 96 puits pendant 48 heures. 24 heures avant la stimulation des cellules NK, enduisez la plaque de 96 puits de 100 microlitres par puits de laminine et incuberez-la pendant 45 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, retirer la solution et laisser sécher les puits à l’air libre dans l’enceinte de biosécurité.Ensuite, fixez la souris euthanasiée sur le tableau en position couchée. Soulever la peau et inciser la peau le long de la colonne dorsale. Coupez l’articulation lombo-sacrée et séparez le sacrum de la colonne lombaire avec des ciseaux.Ensuite, séparez la colonne vertébrale en coupant les muscles et les côtes des deux côtés dans le sens crânien jusqu’à ce que la base du crâne soit atteinte. Utilisez des ciseaux pour couper la colonne vertébrale au niveau de l’articulation atlanto-occipitale. Ensuite, retirez le muscle et le tissu adipeux de la colonne vertébrale.Épinglez et ouvrez la colonne vertébrale pour enlever la moelle épinière avant d’accéder au ganglion de la racine dorsale ou DRG dans le foramina intervertébral relié à la moelle épinière par la racine dorsale. Ensuite, récoltez les DRG dans un tube conique de 15 millilitres rempli de 10 millilitres de DMEM supplémenté par du froid glacé. Centrifuger ensuite la préparation pendant cinq minutes à 200 G à température ambiante et retirer le surnageant.Ajouter 250 microlitres de PBS contenant un milligramme par millilitre de collagénase IV et 2,4 unités par millilitre de dispase II.Incuber ce DRG avec une solution de collagénase-dispase pendant 80 minutes avec une légère agitation. Pour inactiver les enzymes, ajoutez cinq millilitres de milieu DMEM supplémenté et centrifugez la solution à 200 G.Après cinq minutes, retirez doucement le surnageant à l’aide d’une pipette et laissez environ 100 microlitres du surnageant pour éviter la perte cellulaire indésirable. Ensuite, ajoutez un millilitre de milieu DMEM supplémenté aux cellules et utilisez un pistolet à pipette et trois pipettes Pasteur en verre de tailles décroissantes pour triturer doucement le DRG en une seule préparation cellulaire.Pendant que vous travaillez dans une enceinte de biosécurité, diluer l’albumine sérique bovine ou BSA dans du PBS stérile jusqu’à une concentration finale de 15 % et conserver une aliquote d’un millilitre à moins 20 degrés Celsius. Pour créer un gradient BSA dans un tube conique de 15 millilitres, ajoutez deux millilitres de PBS stérile, puis distribuez lentement un millilitre de solution BSA à 15% au fond du tube. Évitez de perturber le gradient en retirant doucement la pipette.À l’aide d’une pipette P200, ajouter la suspension ganglionnaire triturée contenant les neurones sur le côté du tube dans le gradient. Réglez ensuite l’accélération et la décélération au minimum pour centrifuger le neurone contenant le gradient BSA pendant 12 minutes à 200 G.Après la centrifugation, retirer tout le surnageant à l’aide d’une pipette et remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de Neurobasal. Plaque 10 000 neurones par puits dans une plaque à fond plat recouverte de laminine à 96 puits.Pour permettre la fixation des neurones, incuber la plaque de 96 puits pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Pour commencer la co-culture, retirez lentement le Neurobasal de la culture neuronale. Après 48 heures de stimulation avec IL-2 et IL-15, remettez en suspension les cellules NK et ajoutez 10 à la cinquième cellule NK par puits à la culture de neurones.Co-culture des cellules dans Neurobasal MX supplémenté à 37 degrés Celsius. Après 48 heures, recueillir et laver les cellules trois fois avec du PBS et les centrifuger pendant cinq minutes à 500 G à quatre degrés Celsius. Jeter le surnageant avant de colorer les cellules avec un à 1 000 colorant de viabilité dilué eFluor 780 pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Lavez et centrifugez les cellules comme démontré, puis traitez avec CD 1632 pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius pour bloquer les sites non spécifiques sur les cellules, puis collectez et lavez les cellules avec du PBS trois fois. Après le prochain cycle de lavage et de centrifugation, colorez les cellules avec BV421, anti-NK-1.1, isothiocyanate de fluorescéine anti-NKp46 et phycoérythrine anti-GM-CSF pendant 15 minutes. Encore une fois, collectez et lavez les cellules trois fois avec du PBS, centrifugez-les et jetez le surnageant, puis remettez les cellules en suspension dans 500 microlitres de tampon FACS et immunophénotype les cellules NK en utilisant la cytométrie de flux.Lorsqu’elles sont cultivées seules, les cellules NK expriment des niveaux basaux de facteur de stimulation des colonies de macrophages granulocytaires ou GM-CSF et NKp46. Lorsqu’elle est co-cultivée avec des neurones DRG récoltés sur des souris nociceptrices intactes, la stimulation de la capsaïcine diminue l’expression des cellules NK du GM-CSF. La capsaïcine n’a eu aucun impact sur les activations des cellules NK lorsqu’elle était co-cultivée avec des neurones DRG récoltés sur des souris ablées par nocicepteur.Le niveau de NKp46 n’a pas été affecté. Les étapes clés de ce protocole sont la dissociation et l’isolement DRG. L’idée est de garder une viabilité neuronale maximale en évitant de faire des bulles et en utilisant la pipette de bonne taille.Après le protocole, le chercheur peut utiliser le séquençage de l’ARN ou qPCR pour mesurer le changement de transcription dans les cellules purifiées FACS, ou il peut utiliser ELISA pour mesurer la sécrétion de cytokines ou de neuropeptides. Une telle interaction révèle que la fonction des cellules NK est probablement réglée par le neurone nocicepteur. Et cette diaphonie peut être importante dans les processus biologiques allant des lésions nerveuses, des infections bactériennes et virales, jusqu’aux tumeurs malignes.

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