Visualisation du développement des cicatrices à l’aide du test SCAD - Un test de cicatrisation cutanée ex situ

Les modèles in vitro ou ex vivo précédemment utilisés manquent de composants cellulaires dermiques et de complexité du tissu cutané. Ce test SCAD ex situ surmonte une limitation définie et permet d’étudier le développement de cicatrices en dehors de l’animal blessé. Le test SCAD permet de visualiser la migration des fibroblastes et la formation de cicatrices dans les microenvironnements cutanés.

Il permet aux bibliothèques de dépistage d’activateurs ou d’inhibiteurs de comprendre la base mécaniste de la formation de cicatrices. Tests de criblage à haut débit de bibliothèques plates utilisant le modèle SCAD pour comprendre le processus fondamental et le cours moléculaire impliqué dans la réparation des plaies. Le test SCAD est facile à effectuer en utilisant les explants cutanés.

Pour une cicatrice constante, il est recommandé de sélectionner la peau postnatale jour zéro ou jour un. Après avoir sacrifié le bébé nouveau-né du jour zéro postnatal ou le premier jour, utilisez un scalpel chirurgical stérile pour exciser soigneusement la peau dorsale de 1,5 par 1,5 centimètre d’épaisseur jusqu’à la couche musculaire squelettique. Pelez la peau à l’aide de pinces incurvées stériles, en veillant à ce que le fascia superficiel soit intact avec le muscle panniculus carnosus sous-jacent.

Laver le tissu excisé avec 50 à 100 millilitres de milieu DMEM F-12 froid pour éliminer le sang contaminant. Ensuite, lavez le tissu avec une solution saline équilibrée Hanks pour maintenir la viabilité des tissus et des cellules. Placez la peau à l’envers avec un fascia superficiel sur le dessus dans une boîte de Petri de 10 centimètres contenant du milieu DMEM F-12.

Ensuite, à l’aide d’un poinçon de biopsie jetable de deux millimètres, éliminez les morceaux de peau ronds de pleine épaisseur pour générer des tissus croûtés, en veillant à ce que le fascia superficiel soit intact avec le muscle panniculus carnosus sous-jacent jusqu’à l’épiderme. Ajouter 200 microlitres de milieu complet DMEM F-12 frais sans rouge phénolique dans chaque puits d’une plaque de 96 puits. À l’aide de pinces stériles, transférez et immergez complètement le tissu croûté individuel à l’envers jusqu’aux puits d’une plaque de 96 puits.

Transférer la plaque dans un incubateur de culture cellulaire maintenu dans des conditions standard. Les deuxième et quatrième jours de culture, retirez le milieu en laissant 10 microlitres dans le puits et ajoutez le milieu complet DMEM F-12 préchauffé frais ainsi que les composés de traitement pour maintenir les conditions de viabilité cellulaire et tissulaire continues. Pour l’imagerie en direct des SCAD, préparer 30 millilitres de solution d’agarose à faible fusion de 2 à 3% dans du PBS dans une bouteille en verre en chauffant au micro-ondes.

Après ébullition, transférer immédiatement la bouteille et refroidir la solution d’agarose liquide dans un bain-marie à 40 degrés Celsius. Ensuite, transférez le tissu SCAD avec le fascia ou la cicatrice vers le haut sur le centre d’un plat de 35 millimètres. Ensuite, incorporez le SCAD à température ambiante en versant lentement de l’agarose liquide de 40 degrés Celsius sur le tissu à l’aide d’une pointe de pipette de 1000 microlitres.

L’agarose polymérise en deux minutes. Après polymérisation, ajouter deux millilitres de milieu complet DMEM F-12 préchauffé. Ensuite, à l’aide d’un microscope confocal ou multiphotonique équipé de systèmes d’incubation appropriés expliqués dans le manuscrit, acquérez des images time-lapse du jour zéro au premier jour.

Pour la récolte des tissus, lavez les tissus aux moments pertinents en remplaçant le milieu par du PBS stérile. À l’aide de pinces stériles, transférer chaque SCAD dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre contenant 500 microlitres de paraformaldéhyde à 2% pour fixer les tissus pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain, lavez les tissus trois fois avec du PBS avant de procéder à une coloration par immunofluorescence bidimensionnelle ou tridimensionnelle comme décrit dans le manuscrit du texte.

Les images représentatives en champ lumineux en montage entier des SCAD les jours zéro et cinq sont présentées ici. La coloration trichrome des sections tissulaires verticales du Masson révèle des signatures de cicatrices tissulaires, de contraction tissulaire et d’accumulation de matrice extracellulaire au cœur de la cicatrice aux jours zéro et cinq. La coloration par immunofluorescence des SCAD aux jours zéro et cinq est montrée.

À partir de la cicatrice précoce et tardive, le fibroblaste positif enraciné est représenté en vert et le fibroblaste négatif enraciné en rouge. Pour l’imagerie tridimensionnelle, les tissus ont été incorporés dans une solution d’agarose et surmontés de PBSGT. Les images représentatives démontrent la localisation exclusive de la protéine N-cadhérine sur le site cicatriciel d’un SCAD du cinquième jour.

La configuration d’imagerie en accéléré tridimensionnelle équipée d’une chambre d’incubation a montré les premiers événements de progression des essaims de fibroblastes au cours des 12 premières heures ou des premiers stades du développement de la cicatrice. La représentation graphique des trajectoires cellulaires unicellulaires suivies de fibroblastes individuels sur le développement de cicatrices est présentée ici. Il est crucial de placer le tissu SCAD à l’envers à l’intérieur de la plaque du puits afin que le fascia soit orienté vers le haut.

Ne pas le faire entraînerait des variations inévitables dans les schémas de migration. Cette procédure permet d’examiner les couches cutanées pour des traitements ou une culture à l’aide de modulateurs chimiques, d’anticorps neutralisants ou de méthodes virales. Cela aide à l’évaluation des réponses fibrotiques pathologiques dans divers contextes médicaux.

Nous avons montré l’expression de la connexine-43 et de la N-cadhérine en tant que molécules clés impliquées dans la mobilisation du fascia lors de la blessure. La méthodologie SCAD permet d’identifier de nouvelles stratégies thérapeutiques pour réduire les cicatrices et la fibrose.