Puce de glomérule rénal isogénique conçue à partir de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

La puce de glomérule isogénique permettra la modélisation de maladies spécifiques au patient et les tests de néphrotoxicité et des applications avancées de médecine de précision. L’épithélium glomérulaire et l’endothélium sont dérivés d’une seule population de cellules souches pluripotentes induites par l’homme, ou CSIP. Les IPSC possèdent un auto-renouvellement illimité et peuvent se différencier dans presque tous les types de cellules.

Cette technique peut être utilisée pour évaluer les phénotypes cellulaires pathologiques et la maladie. La puce d’organe spécifique au patient peut également servir de plate-forme pour le dépistage de médicaments et les études mécanistes. Ce modèle peut être appliqué au développement d’un système de corps sur puce personnalisé pour un patient spécifique.

Ce système a le potentiel de prédire les réponses spécifiques au patient avant les essais cliniques. Commencez par ajouter doucement 25 microlitres de solution de matrice 2 de membrane basale au canal urinaire et 20 microlitres dans le canal capillaire de la puce. Prenez deux bouchons de tubes coniques stériles de 15 millilitres et remplissez-les de 500 microlitres d’eau distillée stérile.

Placez le bouchon dans la boîte de Petri pour éviter le séchage et placez le couvercle sur la boîte. Incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit. En continuant, aspirer le milieu à partir de flacons T75 contenant une culture de 15 jours de cellules endothéliales vasculaires à 90% de confluence.

Ajouter cinq millilitres de tampon de détachement cellulaire et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq à sept minutes. Ensuite, transférez les cellules dans un tube conique de 15 millilitres et ajoutez cinq millilitres de DMEM / F-12. Centrifuger à 200 fois G pendant cinq minutes.

Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 300 microlitres de milieu d’entretien endothélial. Compter les cellules avec un hémocytomètre pour obtenir environ 2 millions de cellules. À l’aide d’une pointe barrière P200, rincer les canaux supérieur et inférieur de la puce microfluidique avec 200 microlitres de DMEM/F-12 tout en aspirant simultanément depuis la périphérie de la sortie.

Tenez fermement la puce avec l’embout de barrière P200 fixé à l’aspirateur loin de la sortie du canal inférieur. Injectez fermement 20 microlitres de la suspension de cellules endothéliales vasculaires dans le canal capillaire de la puce et aspirez soigneusement le milieu de la périphérie de la sortie. Vérifiez au microscope s’il y a des bulles ou une densité de semis inégale.

Inverser doucement la puce afin que les cellules puissent adhérer à la face basale de la membrane PDMS flexible. Placez la puce dans la cartouche de support et ajoutez trois millilitres de PBS dans la cartouche pour empêcher la membrane de sécher. Incuber la puce à 37 degrés Celsius pendant trois heures.

Vérifiez le canal inférieur sous le microscope pour une couche confluente de cellules attachées à la membrane PDMS flexible. Lavez les cellules non attachées en ajoutant 200 microlitres de milieu d’entretien endothélial à l’entrée du canal inférieur tout en aspirant à partir de la périphérie de la sortie du canal capillaire. Replacez la puce dans la cartouche du support et incuber à 37 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, rincez doucement le canal capillaire avec 200 microlitres de milieu d’entretien endothélial. Rincez le canal urinaire avec 200 microlitres de DMEM/F-12 et déposez 50 microlitres de DMEM/F-12 sur les orifices d’entrée et de sortie. En procédant aux cellules intermédiaires du mésoderme, remplacer le milieu d’induction du mésoderme intermédiaire de chaque puits de la plaque de 12 puits par un millilitre de trypsine EDTA et incuber à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Grattez doucement les cellules à l’aide d’un élévateur de cellules et dissociez les cellules à l’aide d’un pipetage. Ajouter deux millilitres de solution de neutralisation de la trypsine à chaque puits et transférer les cellules dans un tube conique de 50 millilitres. Compléter le volume de la suspension cellulaire à 50 millilitres avec DMEM/F-12 et centrifuger à 200 fois G pendant cinq minutes.

Aspirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 500 microlitres de milieu d’induction mésodermique intermédiaire pour obtenir environ 3 millions de cellules. Comptez les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Tenez la puce et injectez fermement 25 microlitres de suspension cellulaire dans le canal urinaire de la puce tout en aspirant soigneusement le milieu à partir de la périphérie de la sortie.

Vérifiez s’il y a des bulles ou une densité d’ensemencement cellulaire inégale. Ajoutez trois millilitres de PBS dans la cartouche du porte-puce et incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Après l’incubation, rincer les deux canaux avec 200 microlitres de leur milieu de culture cellulaire respectif.

Fixez les embouts de barrière P200 vides dans les deux sorties des canaux urinaire et capillaire. Pipeter 200 microlitres de milieu d’entretien endothélial et en injecter la moitié dans l’entrée du canal capillaire. Relâchez l’embout de la pipette à l’intérieur de l’entrée de sorte que l’entrée et la sortie du canal soient fixées à des embouts de pipette remplis de milieu.

Répétez cette procédure pour l’entrée du canal urinaire avec 200 microlitres de milieu d’entretien mésodermique intermédiaire. Incuber les copeaux avec des pointes intégrées à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Pour connecter les puces au bioréacteur de puces d’organes, retirez d’abord les embouts P200 des canaux.

Ajouter des gouttelettes de média respectif à l’entrée et à la sortie des canaux urinaires et capillaires pour éviter le dessèchement. Ajouter trois millilitres de milieu d’induction podoctytaire chaud au réservoir d’entrée urinaire et trois millilitres de milieu d’entretien endothélial chaud au réservoir d’entrée capillaire. Ajoutez 300 microlitres du média respectif aux réservoirs de sortie directement au-dessus de l’orifice de sortie.

Faites glisser les capsules sur le plateau et dans le bioréacteur de la puce d’organe. Utilisez le cadran rotatif pour sélectionner et démarrer le cycle principal pendant deux minutes. Inspectez visuellement la face inférieure de la capsule à la recherche de petites gouttelettes aux quatre orifices fluidiques.

Pour obtenir un contact fluide à fluide entre la face inférieure de la capsule et les ports de puce microfluidique, faites glisser doucement le support de puce dans la capsule. Appuyez doucement sur la languette du support de puce vers l’intérieur et vers le haut. Aspirez l’excès de milieu de la surface de la puce.

Réglez le débit du bioréacteur à puce d’organe à 60 microlitres par heure. Réglez la contrainte cyclique à 10 % à 0,4 hertz. Utilisez le cadran rotatif du bioréacteur à puce d’organe pour sélectionner le cycle de régulation et fonctionner pendant deux heures.

Inspectez visuellement les réservoirs de sortie pour une augmentation du niveau de milieu. Utilisez le cadran rotatif du bioréacteur de la puce d’organe pour sélectionner le cycle de régulation. Après le jour 17 de culture, aspirer quotidiennement le milieu des réservoirs de sortie du canal urinaire en diagonale loin du port, mais garder un peu de milieu dans le réservoir.

Reconstituer le réservoir d’entrée du canal urinaire avec jusqu’à trois millilitres de milieu d’induction podocytaire tous les deux jours pendant cinq jours. Après cinq jours, aspirez le milieu du canal urinaire, mais gardez un peu de milieu dans le réservoir. Reconstituer quotidiennement le réservoir d’entrée du canal urinaire avec trois millilitres de milieu d’entretien podocytaire.

De même, aspirez le milieu à partir de la sortie du canal capillaire et remplissez quotidiennement les réservoirs d’entrée avec un milieu d’entretien endothélial. En utilisant ce protocole, des cellules souches pluripotentes induites par l’homme ont été utilisées pour développer un modèle fonctionnel in vitro du glomérule en multipliant des cellules endothéliales vasculaires et des podocytes. Au jour 21 après l’induction du podocyte et la propagation de l’endothélium vasculaire, les cellules des puces ont exprimé des marqueurs d’identification de la lignée tels que Podocin et Nephrine pour les podocytes, VE Cadhérin et PECAM-1 pour les cellules endothéliales vasculaires.

Les couches de cellules endothéliales podocytes et vasculaires ont exprimé le collagène IV qui est la protéine GBM la plus abondante dans le glomérule rénal. Les puces de glomérule filtraient sélectivement de petites molécules telles que l’inuline du capillaire dans le canal urinaire, tout en empêchant les grosses protéines comme l’albumine de quitter le canal capillaire, montrant une fonction de filtration moléculaire sélective. Au cours de l’induction endothéliale du quatrième au septième jour, une augmentation du nombre de cellules peut entraîner une couche secondaire de cellules, mais un ensemencement excessif peut provoquer une agrégation qui peut entraver la différenciation.

Un écoulement croisé inattendu entre les canaux urinaire et capillaire peut être observé en cas de liaison inadéquate des composants de la puce PDMS, de blocage dans la voie d’écoulement du fluide ou de barrière de filtration compromise. Lors de l’ensemencement de l’endothélium et de l’épithélium et de l’entretien des copeaux à partir du jour 15, il est important d’inspecter visuellement les bulles d’air dans les canaux à chaque étape. Dans la puce du glomérule isogénique, des candidats médicaments cliniquement pertinents peuvent être administrés pour tester leur potentiel thérapeutique ou leurs niveaux de toxicité.

Cette technique ouvre maintenant la possibilité de comprendre la base génétique de la maladie rénale humaine et de développer des thérapies personnalisées.