Name: Administration médiée par électroporation de ribonucléoprotéines cas9 et d’ARNm dans des hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Découvrez l'édition de gènes CRISPR-Cas9 par électroporation dans des hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés. Cette méthode permet de générer des modèles de maladies métaboliques hépatiques in vitro et in vivo.

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RNC a reçu un financement du South Carolina Bioengineering Center of Regeneration and Formation of Tissues Subvention pilote soutenue par le National Institute of General Medical Sciences (NIGMS) des National Institutes of Health, l’American Association for the Study of Liver Diseases Foundation et l’American Society of Gene & Cell Therapy sous les numéros de subvention P30 GM131959, 2021000920, et 2022000099, respectivement. Le contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les points de vue officiels de l’American Society of Gene & Cell Therapy ou de l’American Association for the Study of Liver Diseases Foundation. Le schéma de la figure 1 a été créé avec BioRender.com.

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<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Kim, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+%283D%29+printing+of+mouse+primary+hepatocytes+to+generate+3D+hepatic+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Surgical+Treatment+and+Research%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional (3D) printing of mouse primary hepatocytes to generate 3D hepatic structure.</a> Annals of Surgical Treatment and Research. 92 (2), 67-72 (2017).</li>
<li>Li, W. C., Ralphs, K. L., Tosh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+adult+mouse+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of adult mouse hepatocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 633, 185-196 (2010).</li>
<li>Lattanzi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+CRISPR%2FCas9+delivery+to+human+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells+for+therapeutic+genomic+rearrangements%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimization of CRISPR/Cas9 delivery to human hematopoietic stem and progenitor cells for therapeutic genomic rearrangements.</a> Molecular Therapy. 27 (1), 137-150 (2019).</li>
<li>Dever, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9+beta-globin+gene+targeting+in+human+haematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9 beta-globin gene targeting in human haematopoietic stem cells.</a> Nature. 539 (7629), 384-389 (2016).</li>
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Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à divulguer.

Les étapes décrites dans le protocole d’isolement des hépatocytes sont difficiles et nécessitent une pratique pour la compétence. Il existe plusieurs étapes clés pour l’isolement réussi des hépatocytes du foie. Tout d’abord, une bonne canulation de la veine cave inférieure est essentielle pour une perfusion hépatique complète. L’absence de blanchiment dans le foie après perfusion indique un déplacement du cathéter (tableau 1). La veine cave inférieure (perfusion rétrograde) a été canulée dans la procédur...

Les MI du foie sont des troubles génétiques caractérisés par la carence d’une enzyme hépatique cruciale impliquée dans le métabolisme qui conduit à l’accumulation de métabolites toxiques. Sans traitement, les MI du foie entraînent une défaillance d’organe ou une mort prématurée 1,2. La seule option curative pour les patients atteints de MI du foie est la transplantation hépatique orthotopique, qui est limitée en raison de la faible disponibilité des organes de donneurs et des complications du traitement immunosuppresseur après la procédure 3,4. Selon des données récentes recueillies par le Réseau d’approvisionnement et de transplantation d’organes, seulement 40 % à 46 % des patients adultes sur la liste d’attente pour une greffe du foie reçoivent un organe, tandis que 12,3 % de ces patients meurent alors qu’ils sont sur la liste d’attente5. De plus, seulement 5% de toutes les maladies rares du foie ont un traitement approuvé par la FDA6. Il est clair qu’il existe un besoin critique de nouveaux traitements pour les MI du foie. Cependant, des modèles de maladie appropriés sont nécessaires pour développer de nouvelles options thérapeutiques.
La modélisation des maladies humaines à l’aide de systèmes in vitro et in vivo reste un obstacle au développement de thérapies efficaces et à l’étude de la pathologie des MI du foie. Les hépatocytes de patients atteints de maladies hépatiques rares sont difficiles à obtenir7. Les modèles animaux sont essentiels pour développer une compréhension de la pathologie de la maladie et pour tester des stratégies thérapeutiques. Cependant, un obstacle est la génération de modèles à partir d’embryons porteurs de mutations létales. Par exemple, les tentatives de création de modèles murins du syndrome d’Alagille (ALGS) avec des embryons contenant des délétions homozygotes d’une séquence de 5 kb près de l’extrémité 5 du gène Jag1 ont entraîné la mort précoce des embryons8. En outre, la génération de modèles murins par édition de gènes dans des cellules souches embryonnaires peut nécessiter beaucoup de temps et de ressources9. Enfin, des mutations apparaîtront à l’extérieur du tissu ciblé, conduisant à des variables confondantes qui peuvent entraver l’étude de la maladie9. L’édition de gènes somatiques permettrait une édition plus facile dans le tissu hépatique et contournerait les défis associés à la génération de modèles à l’aide de cellules souches embryonnaires.
L’électroporation permet l’administration de CRISPR-Cas9 directement dans le noyau en appliquant des courants à haute tension pour perméabiliser la membrane cellulaire et est compatible avec de nombreux types de cellules, y compris celles qui sont intransigeantes aux techniques de transfection, telles que les cellules souches embryonnaires humaines, les cellules souches pluripotentes et les neurones 10,11,12 . Cependant, la faible viabilité est un inconvénient potentiel de l’électroporation; l’optimisation de la procédure peut produire des niveaux élevés d’administration tout en limitant la toxicité13. Une étude récente démontre la faisabilité de l’électroporation des composants CRISPR-Cas9 dans les hépatocytes primaires de souris et d’humains comme une approche très efficace14. L’électroporation ex vivo dans les hépatocytes a le potentiel d’être appliquée pour générer de nouveaux modèles murins pour les MI humaines du foie.
Ce protocole fournit une procédure détaillée étape par étape pour isoler les hépatocytes de souris du foie et ensuite électroporer CRISPR-Cas9 en tant que complexes RNP, constitués de protéine Cas9 et d’ARN guide unique synthétique (ARNg), ou aRNm Cas9 combinés à l’ARNg pour obtenir des niveaux élevés d’édition de gènes sur cible. En outre, le protocole fournit des méthodes pour quantifier l’efficacité, la viabilité et la fonctionnalité de l’édition de gènes après l’électroporation de CRISPR-Cas9 dans des hépatocytes de souris fraîchement isolés.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.2 mL Bandelette PCR 8 tubes FLEX-FREE, capuchons plats transparents attachés, naturel</td><td>USA Scientific</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de collagène à 6 puits</td><td>Advanced Biomatrix</td><td>5073</td><td></td></tr><tr><td>accuSpin Micro 17R</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-100-675</td><td></td></tr><tr><td>Microscope fluorescent tout-en-un</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur Vortex Analogique</td><td>VWR</td><td>97043-562</td><td></td></tr><tr><td>ART Wide Bore pointes filtrées 1 000 & micro ; L</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2079GPK</td><td></td></tr><tr><td>Compteur de cellules automatisé</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>TC20</td><td></td></tr><tr><td>Plateau de dissection à la cire bleue</td><td>Braintree Scientific Inc.</td><td>DTW1</td><td>9 » x 6.5 » x 1/2"+F21</td></tr><tr><td>Racleur/élévateur de cellules</td><td>Argos Technologies</td><td>UX-04396-53</td> Tubes coniques <td>stériles et apyrogènes</td></tr><tr><td>(15 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques (50 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Applicateurs en coton</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-363-170</td><td></td></tr><tr><td>Courbés ciseaux</td><td>Cooper Surgical</td><td>62131</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri jetables</td><td>Falcon</td><td>351029</td><td>100mm,</td></tr><tr><td>stériles Boîtes de Pétri jetables</td><td>VWR</td><td>25373-100</td><td>35mm, stérile</td></tr><tr><td>Epoch Microplate Spectrophotometer</td><td>BioTek Instruments</td><td>250082</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Cell strainer (70 &micro ; m)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-771-2</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Cooper Surgical</td><td>61864</td><td>Euro-Med Adson Tissue Forceps</td></tr><tr><td>IV cathéters&nbsp ;</td><td>Kit</td> de perfusion IV BD <td>382612</td><td>24 G x 0,75 po</td></tr><tr><td></td><td>Baxter</td><td>2C6401</td><td></td></tr><tr><td>MyFuge 12 Mini Centrifuge</td><td>Benchmark Scientific</td><td>1220P38</td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-561-20</td><td>25 G</td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Dispositif</td><td>Lonza</td><td>AAB-1001</td><td>Programme T-028 a été utilisé pour l’électroporation dans les hépatocytes de souris</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique</td><td>Masterflex</td><td>&nbsp ; HV-77120-42</td><td>10 à 60 tr/min ; 90 à 260 VAC</td></tr><tr><td>Tube de pompe de précision</td><td>Masterflex</td><td>HV-96410-14</td><td>25 pi, silicone</td></tr><tr><td>Plaques de culture primaire</td><td>Corning Life Sciences</td><td>353846</td><td>Plaques de culture de tissus contenant de l’azote</td></tr><tr><td>Pipettes sérologiques (25 mL)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-567-604</td><td></td></tr><tr><td>Seringues</td><td>BD</td><td>329464</td><td>1 mL, stériles</td></tr><tr><td>Thermocycleur T100</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1861096</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>ALT</td><td>27577</td><td>Thermo Scientific Precision Microprocessor Controlled 280 Series, 2,5 L</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alt-R S.p. Cas9 Nuclease V3</td><td>IDT</td><td>1081058</td><td></td></tr><tr><td>Beckman Coulter AMPure XP, 5 mL</td><td></td><td>Fisher Scientific NC9959336</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap Cas9 ARNm</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7606-100</td><td></td></tr><tr><td>CleanCap&nbsp ; EGFP ARNm</td><td>Trilink Biotechnologies</td><td>L-7201-100</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Matrix</td><td>Corning Life Sciences</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11885076</td><td>Faible teneur en glucose, pyruvate</td></tr><tr><td>Éthanol 70 %</td><td>VWR</td><td>71001-652</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin</td><td>Thermoscientific</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>Entretien des hépatocytes Medium (MM)</td><td>Lonza</td><td>MM250</td><td></td></tr><tr><td>Hépatocyte Plating Medium (PM)</td><td>Lonza</td><td>MP100</td><td></td></tr><tr><td>Mouse Albumine ELISA Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0010653</td><td></td></tr><tr><td>Mouse/Rat Hepatocyte Nucleofector Kit</td><td>Lonza</td><td>VPL-1004</td><td></td></tr><tr><td>OneTaq HotStart DNA polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0481L</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x pH 7.4&nbsp ;</td><td>Thermoscientific</td><td>70011-044</td><td>Sans chlorure de calcium ou de magnésium</td></tr><tr><td>Percoll (solution PVP)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-500790A</td><td></td></tr><tr><td>Acide périodique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7875-25G</td><td></td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>VWR</td><td>100496-550</td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract Solution d’extraction d’ADN</td><td>Lucigen Corporation</td><td>QE05090</td><td></td></tr><tr><td>Schiff' s réactif fuchsin-sulfite</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5133</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,25 %)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200056</td><td>Rouge de phénol</td></tr><tr><td>Vybrant MTT Essai de viabilité cellulaire</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>Perfusion Solution 1 (pH 7,4, filtre stérilisé)&nbsp ; </fort></td>Stable à 4 &deg<td></td><td></td><td> ; C pendant 2 mois</td></tr><tr><td>EBSS</td><td>Fisher Scientific</td><td>14155063</td><td>Complete à 200 mL</td></tr><tr><td>EGTA (0,5 M)</td><td>Bioworld</td><td>40520008-1</td><td>200 &micro ; L</td></tr><tr><td>HEPES (pH 7,3, 1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp ;</td></tr><tr><td><forte>Solution de perfusion 2 (pH 7,4, stérilisé par filtre)&nbsp ; </fort></td>Stable à 4 &deg<td></td><td></td><td> ; C pendant 2 mois</td></tr><tr><td>CaCl2&middot ; 2H20 (1,8 m)</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td>360 & micro ; L de 1 M de stock&nbsp ;</td></tr><tr><td>EBSS (sans calcium, sans magnésium, sans rouge de phénol)</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-155-063</td><td>Complet jusqu’à 200 mL</td></tr><tr><td>HEPES (1 M)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ16924AE</td><td>2 mL&nbsp ;</td></tr><tr><td>MgSO4 et middot ; 7H20 (0,8 mM)</td><td>Sigma</td><td>30391-25G</td><td>160 & micro ; L de 1 M de solution mère</td></tr><tr><td><forte>perfusion 3 </fort></td><td></td><td></td><td>Préparé frais avant utilisation</td></tr><tr><td>Solution 2</td><td></td><td></td><td>50 mL</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401127001</td><td>0,094 unités Wunsch/mL</td></tr><tr><td><fort>Cocktail anesthésique pour souris&nbsp ; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acépromzine</td><td></td><td></td><td>0,25 mg/mL Concentration finale</td></tr><tr><td>Kétamine</td><td></td><td></td><td>7,5 mg/mL Concentration finale</td></tr><tr><td>Xylazine</td><td></td><td></td><td>1,5 mg/mL Concentration finale</td></tr><tr><td>Software</td><td>URL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Benchling</td><td>https://www.benchling.com/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>ImageJ</td><td>https://imagej.nih.gov/ij/</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>TIDE : Suivi des indels par décomposition</td><td>https://tide.nki.nl/</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

administration médiée par électroporation de ribonucléoprotéines cas9 et d’arnm dans des hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés

Electroporation-Mediated Delivery of Cas9 Ribonucleoproteins and mRNA into Freshly Isolated Primary Mouse Hepatocytes

Ce protocole décrit une méthode rapide et efficace pour isoler les hépatocytes primaires de souris, suivie d’une administration de CRISPR-Cas9 médiée par électroporation sous forme de ribonucléoprotéines (RNP) et d’ARNm. Les hépatocytes primaires de souris ont été isolés à l’aide d’une méthode de perfusion rétrograde en trois étapes, ce qui a donné des rendements élevés allant jusqu’à 50 × 106 cellules par foie et une viabilité cellulaire de >85%. Ce protocole fournit des instructions détaillées pour le placage, la coloration et la culture des hépatocytes. Les résultats indiquent que l’électroporation offre une efficacité de transfection élevée de 89%, mesurée par le pourcentage de cellules positives aux protéines fluorescentes vertes (GFP) et une viabilité cellulaire modeste de >35% dans les hépatocytes de souris.
Pour démontrer l’utilité de cette approche, CRISPR-Cas9 ciblant le gène de l’hydroxyphénylpyruvate dioxygénase a été électroporé dans des hépatocytes primaires de souris en tant que preuve de principe de l’édition de gènes pour perturber un gène thérapeutique lié à une maladie métabolique héréditaire (MI) du foie. Une édition sur cible plus élevée de 78 % a été observée pour les RNI par rapport à une efficacité d’édition de 47 % avec l’ARNm. La fonctionnalité des hépatocytes a été évaluée in vitro à l’aide d’un test à l’albumine qui a indiqué que l’administration de CRISPR-Cas9 sous forme d’ARN et d’ARNm entraînait une viabilité cellulaire comparable dans les hépatocytes primaires de souris. Une application prometteuse de ce protocole est la génération de modèles murins pour les maladies génétiques humaines affectant le foie.

Isolement des hépatocytes primaires plaqueables du foie Le processus global de perfusion hépatique et d’isolement des hépatocytes est illustré à la figure 1. Dans cette expérience, des souris C57BL6/6J de type sauvage, âgées de 8 à 10 semaines, ont été utilisées. La procédure devrait produire 20 à 50 × 10à 6 cellules par souris avec une viabilité comprise entre 85% et 95%. Si la viabilité est &lt;70%, un traitement par percoll doit être suivi pour éliminer les ...

Ce protocole décrit des techniques pour isoler les hépatocytes primaires de souris du foie et électroporer CRISPR-Cas9 sous forme de ribonucléoprotéines et d’ARNm afin de perturber un gène cible thérapeutique associé à une maladie métabolique héréditaire du foie. Les méthodes décrites se traduisent par une viabilité élevée et des niveaux élevés de modification des gènes après électroporation.

Administration médiée par électroporation de ribonucléoprotéines cas9 et d’ARNm dans des hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés

This protocol describes a fast and effective method for isolating primary mouse hepatocytes followed by electroporation-mediated delivery of CRISPR-Cas9 ...

Le principal avantage de notre technique est qu’il s’agit d’une approche facile, rapide et reproductible pour modifier les gènes dans les hépatocytes primaires de souris afin de générer des modèles de maladies in vitro et in vivo. En utilisant notre technique, il peut être possible d’abattre un gène cible dans des hépatocytes isolés, puis de les transplanter chez le patient, pour remplacer les cellules malades par des hépatocytes génétiquement modifiés. Il est conseillé aux utilisateurs de lire attentivement et de pratiquer la procédure et les méthodes de dépannage avant de commencer.Tina Parker, gestionnaire d’établissement clinique, et Ilayda Ates, assistante de recherche diplômée, feront la démonstration de la perfusion hépatique et de l’isolement des hépatocytes. La procédure d’électroporation sera démontrée par Callie Stuart, une assistante de recherche diplômée de mon laboratoire. Sous un plan chirurgical d’anesthésie.Commencez la perfusion hépatique en faisant une incision latérale en forme de U dans la peau de l’abdomen à l’aide de ciseaux et élargissez le trou sur les côtés. Continuez à ouvrir la peau de la cage thoracique. À l’aide de ciseaux, coupez à travers le péritoine pour exposer la cavité abdominale jusqu’à la cage thoracique.Attention à ne pas entailler les organes. Déplacez les intestins vers le côté droit à l’aide de l’arrière des forceps ou de la surface émoussée des ciseaux. Identifier la veine porte et la veine cave inférieure.Démarrez la pompe pour rincer la solution de perfusion préchauffée à travers le cathéter. Arrêtez la pompe et retirez le cathéter. Insérez ensuite la pointe de l’aiguille reliée au cathéter dans la veine cave inférieure à un angle de 10 à 20 degrés par rapport à la veine, retirez l’aiguille du cathéter.Poussez ensuite doucement le cathéter dans la veine dans un mouvement parallèle à la veine. Connectez le tube au cathéter sans déplacer le cathéter plus loin dans la veine. Démarrez la pompe avec un débit de deux millilitres par minute.Recherchez le foie qui pâlit immédiatement comme un signe que la perfusion est réussie. Couper la veine porte à l’aide de ciseaux. Augmentez progressivement le débit à cinq millilitres par minute.Une fois que la solution de perfusion trois circule, surveillez attentivement l’élasticité du foie. Pour déterminer si le foie s’est ramolli, appuyez doucement sur le foie avec un coton-tige ou une pince et vérifiez si des indentations se forment sur le foie. Attention à ne pas trop perfuser pour éviter la perte de viabilité cellulaire.Une fois que le foie se ramollit après 30 à 50 millilitres de solution de perfusion trois a coulé, arrêtez la pompe, retirez le cathéter et la vésicule biliaire. Attention à ne pas renverser son contenu. Ensuite, disséquez soigneusement le foie.Placez le foie dans une boîte de Petri de 100 millimètres contenant du DME M glacé avec 10% FBS moyen. Remuez doucement la boîte de Petri pour éliminer les éventuels caillots sanguins. Transférer le foie dans une nouvelle boîte de Petri contenant du DME M glacé et 10% FBS milieu.Pour libérer les cellules de la capsule hépatique, placez la boîte de Petri sur de la glace, puis à l’aide de deux paires de pinces stériles, déchirez doucement la capsule hépatique sur tous les lobes. Faites tourner doucement le foie dans le milieu à l’aide d’un élévateur cellulaire pour libérer les hépatocytes. Continuez ce mouvement jusqu’à ce que le foie devienne très petit et que la suspension devienne brune et opaque.Retirez les restes de tissu hépatique de la plaque et, à l’aide d’une pipette sérologique de 25 millilitres réglée à basse vitesse, transférez soigneusement la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres prérefroidi sur glace et équipé d’une crépine cellulaire de 100 micromètres. Ajouter du DMEM frais glacé et 10% de milieu FBS à la boîte de Petri pour laver et recueillir les cellules restantes de la surface. Ensuite, transférer dans le tube conique de 50 millilitres.Répétez cette étape jusqu’à ce que toutes les cellules soient collectées. Pour laver et purifier les hépatocytes des cellules non parenchymateuses, centrifuger les cellules recueillies dans le tube conique de 50 millilitres à 50 RCF à quatre degrés Celsius pendant cinq minutes à faible décélération ou sans interruption. Jetez le super-naton contenant des débris et des cellules non parenchymateuses.Ensuite, remettez en suspension la pastille dans le super-naton restant en faisant tourner doucement le tube. Après la remise en suspension des granulés, ajoutez 30 millilitres de DMEM frais glacé et 10% FBS moyen. Commencez à préparer les substrats CRISPR CAS 9, les cellules et l’instrument d’électroporation en allumant le bouton d’alimentation du dispositif d’électroporation.Réglez ensuite le programme d’électroporation en appuyant sur le bouton X, puis sur le bouton flèche bas jusqu’à ce que le programme T 0 28 apparaisse à l’écran. Préparation des puits de destination pour les hépatocytes électroporés en ajoutant 1,5 millilitre de PM à six plaques enrobées de collagène de puits. Incuber les plaques dans un incubateur à 37 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes à l’emploi.Dans les tubes à bandelettes fendues par PCR, préparer les complexes CAS 9 RMP et ARNm tels que décrits dans le manuscrit textuel. Conservez le mélange d’ARN sg sur de la glace jusqu’à électroporation. Préparer séparément un tube contenant un microgramme d’ARNm E G F P pour vérifier la réussite de l’électroporation à l’aide de la microscopie à fluorescence.Centrifuger la réaction d’électroporation à 100 RCF pendant deux minutes à quatre degrés Celsius. Retirez le supernaton de la pastille cellulaire et ajoutez 100 microlitres de solution de nucléoffection par réaction le long du côté de la paroi du tube. Remettre en suspension les hépatocytes dans la solution d’électroporation en balançant doucement le tube à la main.Une fois que les hépatocytes sont uniformément dispersés dans la solution d’électroporation, transférer 100 microlitres de la suspension hépatocytes dans les tubes de bande contenant les neuf complexes CAS. Transférer le contenu de la bande bien dans un récipient d’électroporation. Placez le vaisseau nucléo-vétérinaire dans la fente du dispositif d’électroporation.Électroporate les hépatocytes en appuyant sur le bouton X. Après l’électroporation, attendez qu’un écran apparaisse sur l’appareil qui dit:OK. Appuyez à nouveau sur le bouton X et retirez le récipient.Incuber le récipient électroporé sur de la glace pendant 15 minutes. Ajouter 500 microlitres à un PM armé de la poignée dans le récipient d’électroporation. Transférer 300 microlitres de la réaction d’électroporation à chaque puits de destination sur la plaque préchauffée.Incuber les plaques pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ajouter la matrice membranaire au milieu d’entretien des hépatocytes glacés et mélanger en pipetant de haut en bas 10 fois. Retirer le milieu des puits désignés pour l’analyse de l’édition de gènes 24 heures après le placage des cellules.Pipeter le mélange de superposition lentement sur les cellules et replacer la plaque à 37 degrés Celsius. 24 heures après le placage, transférer le milieu conditionné du puits désigné pour les dosages MTT et albumine et conserver dans un tube micro-fuge jusqu’à ce qu’il soit prêt à effectuer le dosage de l’albumine. Procéder à l’analyse de l’activité CAS neuf sur cible en extrayant l’ADN génomique et en mettant en place la PCR comme décrit dans le manuscrit texte.Dans les 3 à 12 heures suivant le placage, les hépatocytes ont adhéré à la plaque et la morphologie cellulaire a pris un aspect polygonal ou hexagonal typique dans les 24 heures La pureté des cellules isolées a été vérifiée par coloration au glycogène à l’aide du réactif périodique de décalage acide 24 heures après le placage. Le cytoplasme des hépatocytes colorés est apparu magenta. Les hépatocytes ont été imagés 24 heures après l’électroporation et en moyenne, 89,8% des hépatocytes étaient positifs à la GFP.Trois jours après l’électroporation, CAS neuf induit dans le locus HPD a été analysé et les résultats ont montré sur la cible des indels de 47,4% dans les hépatocytes électroporés avec CRISPR Cas neuf ARNm et 78,4% indels pour le CAS neuf RNP. Le test MTT a montré une viabilité de 35,4 et 45,9% dans les hépatocytes traités avec CRISPR Cas neuf ARNm et R N P.Conformément aux résultats MTT, les taux d’albumine normalisés étaient de 31,8% dans les hépatocytes traités avec CAS nine RNA et de 34,5% pour CAS nine r p. La chose la plus importante à retenir est que la canulation appropriée affecte toutes les étapes ultérieures et le succès de la procédure.Après cette procédure, les hépatocytes peuvent être transplantés et les souris à enquêter sur leurs greffes. De plus, l’ADN génomique des hépatocytes plaqués peut être extrait pour analyser l’efficacité et la spécificité de l’édition CAS nine.

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Découvrez l'édition de gènes CRISPR-Cas9 par électroporation dans des hépatocytes primaires de souris fraîchement isolés. Cette méthode permet de générer des modèles de maladies métaboliques hépatiques in vitro et in vivo.

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