Name: Infection virale expérimentale chez les moustiques adultes par alimentation orale et micro-injection (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 2 s
Description: Découvrez l'infection virale expérimentale chez les moustiques adultes par alimentation orale et micro-injection. Cette méthode évalue la compétence vectorielle d'Aedes aegypti pour les arbovirus.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ce travail a été soutenu par le projet de plan scientifique et technologique de Wuhan (2018201261638501).

1. Préparation de virus et de moustiques
<ol><li>Préparation des virus REMARQUE : Tous les procédés ont été effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Le niveau de biosécurité utilisé doit être déterminé par l’évaluation des risques de l’agent pathogène et les réglementations spécifiques aux pays et aux régions. Le processus doit être effectué dans une enceinte de biosécurité.<ol><li>Inoculer 1 x 106 cellules C6/36 dans une fiole de culture T75. Remplir la fiole avec 10 ml de milieu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 contenant 10 % de sérum fœtal bovin inactivé par la chaleur et 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S). REMARQUE: Le milieu L-15 de Leibovitz (L15) ou le milieu d’Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) peuvent également être utilisés pour maintenir les cellules C6/36.</li>
		<li>Maintenir les cellules dans 5% de CO2 à 28 °C pendant la nuit et retirer le surnageant cellulaire le lendemain lorsque les cellules sont confluentes à 80%-90%.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de dilution virale (multiplicité de l’infection (MOI) = 0,01) dans la fiole et incuber les cellules pendant 1 h dans 5 % de CO2 à 28 °C. Le virus du lac Ebinur (EBIV)15, un orthobunyavirus transmis par les moustiques, a été utilisé comme virus modèle pour ce protocole.</li>
		<li>Retirer le surnageant et laver les cellules 3x avec 5 mL de PBS. Remplir la fiole avec 15 mL de nouveau milieu RPMI avec 2% FBS. Maintenir la fiole dans 5 % de CO2 à 28 °C.</li>
		<li>Prélever le surnageant contenant le virus lorsque le titre viral requis est atteint (après près de 5 jours, selon le virus utilisé). Pour EBIV, cette valeur de titre était de 107 unités formant des plaques (UFP)/mL. Sous-emballez-les dans des tubes de stockage individuels à bouchon à vis de 2 ml et entreposer les tubes contenant 0,5 à 1 mL de virus à -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Détermination du titre viral REMARQUE : Déterminer le titre viral à l’aide des dosagesde plaque 16. BHK-21 a été utilisé pour déterminer le titre viral du VEB, en raison de l’effet cytopathique évident (ECP) observé dans les cellules infectées.<ol><li>Inoculer 1 x 105 cellules BHK-21 dans chaque puits de plaques de 24 puits. Remplissez chaque puits avec 1 mL de milieu DMEM contenant 10% FBS et 1% P/S. Maintenir les cellules dans 5% CO2 à 37 °C pendant la nuit.</li>
		<li>Faire six (10-6) dilutions successives de 10 fois de surnageant contenant du virus avec un milieu DMEM frais contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S.</li>
		<li>Ajouter 100 μL de diluant de virus dans chaque puits de plaques de 24 puits contenant la monocouche BHK-21. Jeter le diluant du virus après incubation pendant 1 h dans 5 % de CO2 à 37 °C. Ajouter 500 μL de DMEM contenant 1,5 % de méthylcellulose à chaque puits.</li>
		<li>Cellules en culture dans 5 % de CO2 à 37 °C pendant 48 h (l’ECP apparente a été trouvée après 48 h pour le VEB). Fixez les cellules pendant la nuit avec 750 μL de formaldéhyde à 3,7%.</li>
		<li>Colorez-les avec 200 μL de violet cristallin à 2% pendant 15 min. Comptez le nombre de plaques pour calculer le titre viral.</li>
	</ol></li>
	<li>Élevage de moustiques en laboratoire REMARQUE : Moustiques de retour dans un laboratoire de niveau de confinement d’arthropodes 1 (ACL-1).<ol><li>Pour la préparation de l’eau déchlorée, remplissez un seau de 20 L avec de l’eau du robinet et laissez-le reposer pendant 7-8 jours sans lumière. Ne couvrez pas le couvercle.</li>
		<li>Gardez les œufs et les larves d’Ae. aegypti dans une chambre à moustiques dans les conditions suivantes: 28 ± 1 °C avec un cycle lumière/obscurité de 12 h et une humidité relative de 75% ± 5%.</li>
		<li>Maintenir près de 1 000 larves dans un plat peu profond (22 cm x 15 cm x 6 cm) contenant de l’eau déchlorée après l’éclosion des œufs. Nourrissez-les avec près de 1/8 cuillère à café de poudre d’aliment pour souris. Rafraîchissez les aliments tous les jours et changez l’eau tous les 2 jours.</li>
		<li>Une fois que les larves se nymphosent après 5-7 jours, utilisez un compte-gouttes unique pour transférer les pupes dans un gobelet en plastique (7 oz) rempli d’eau déchlorée.</li>
		<li>Mettez cinq tasses contenant des pupes (environ 200 par tasse) dans une cage à mailles (30 cm x 30 cm x 30 cm) et conservez les cages dans l’incubateur à insectes dans les mêmes conditions qu’à l’étape 1.3.2.</li>
		<li>Placez une minuscule éponge contenant une solution de glucose à 8% (m / p) sur chaque cage à mailles pour nourrir les moustiques adultes. Après la levée de l’adulte, sortez les tasses sans nymphes. Gardez les cages grillagées avec environ 1 000 moustiques adultes par cage dans le même incubateur d’insectes.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation à l’infection buccale
<ol><li>Préparez les moustiques femelles à l’infection buccale. Utilisez la machine absorbant les moustiques pour collecter les moustiques âgés de 5 à 8 jours. Anesthésiez-les à -20 °C pendant 1 min et vérifiez si les moustiques sont étourdis. Sinon, anesthésiez-les encore une minute à -20 °C.</li>
	<li>Versez-les rapidement dans les gobelets en plastique (24 oz) à environ 200 moustiques (femelles et mâles) par tasse. Couvrez rapidement chaque tasse avec une moustiquaire bien coupée, suivie d’un couvercle avec un trou (environ 6 cm de diamètre) au milieu.</li>
	<li>Affamez les moustiques pendant 24 heures avant l’infection buccale et préparez un repas de sang infectieux comme suit.</li>
	<li>Dans une enceinte de biosécurité dans des conditions BSL-2, sortir le stock de virus du congélateur à -80 °C et le décongeler sur de la glace. Diluer le stock de virus à une concentration de 2 x 106 UFP/mL avec un milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S. Mélanger la dilution du virus avec un volume égal de sang de cheval défibé. NOTE: Les processus ont été effectués dans une enceinte de biosécurité d’un laboratoire ACL-2.</li>
</ol>3. Effectuer une infection buccale
NOTE: Toutes les étapes ont été effectuées dans un laboratoire ACL-2. Le processus doit être effectué dans la boîte à gants pour empêcher les moustiques de s’échapper.
<ol><li>Effectuez une alimentation artificielle en utilisant le système d’alimentation des moustiques artificiels pendant 1 h.<ol><li>Coupez les membranes de collagène à la taille appropriée (environ 5 cm de diamètre), fixez-les aux réservoirs avec des joints toriques, puis ajoutez le mélange virus-sang (environ 3 mL) aux réservoirs. Utilisez des bouchons en plastique pour sceller les réservoirs et prévenir les fuites. REMARQUE : Ces étapes ont été effectuées dans une enceinte de biosécurité.</li>
		<li>Mettez les gobelets en plastique (24 oz) contenant des moustiques dans la boîte à gants. Vissez les réservoirs scellés sur le chargeur FU1 et placez un réservoir sur une tasse, puis allumez l’unité d’alimentation. Nourrissez les moustiques pendant 1 h</li>
	</ol></li>
	<li>Anesthésier les moustiques au CO2 pendant plusieurs secondes jusqu’à ce qu’ils s’évanouissent. En bref, placez le pistolet pulvérisateur de dioxyde de carbone au milieu du filet à travers le trou de la tasse contenant les moustiques, ouvrez la valeur et permettez à d’énormes quantités de dioxyde de carbone d’être craché pour anesthésier les moustiques.</li>
	<li>Versez-les dans une boîte de Petri placée sur de la glace et couvrez rapidement le couvercle. Choisissez les moustiques femelles engorgées avec des forceps. Pour s’identifier, les mâles ont des antennes plumeuses et les femelles ont des antennes unies. Transférez-les dans de nouveaux gobelets en plastique à 50 moustiques femelles par tasse. REMARQUE: Les moustiques femelles engorgées ont été choisies pour maintenir la consistance car la quantité d’alimentation affecte le contenu viral.</li>
	<li>Enveloppez la tasse avec un filet anti-moustique coupé, puis couvrez-la avec un couvercle avec un trou au milieu. Coupez l’éponge en un petit morceau et mettez-la sur la tasse.</li>
	<li>Ajouter une solution de glucose à 8% sur l’éponge à l’aide d’un compte-gouttes jetable en plastique. Conservez les tasses contenant des moustiques femelles dans l’incubateur à 27 °C à 80% d’humidité pendant 10 jours. Remplacez une nouvelle éponge saturée en glucose toutes les 72 h.</li>
</ol>4. Préparation à l’inoculation intrathoracique
<ol><li>Préparez les aiguilles de micro-injection comme suit. Utilisez un PUL-1000 pour fabriquer des aiguilles de micro-injection (Figure 1A) avec les paramètres suivants dans le programme d’extraction d’aiguilles : indice de chaleur = 450, force (g) = 110, distance (mm) = 1,00 et retard (s) = 0.</li>
	<li>Coupez la pointe d’une aiguille tirée à l’aide d’une pince à épiler au microscope à dissection à un grossissement de 16x (figure 1B). Ne rendez pas la pointe trop grande, sinon elle pourrait nuire aux moustiques.</li>
	<li>Préparez les moustiques femelles comme à l’étape 2.1. REMARQUE : Les procédés suivants ont été effectués dans un laboratoire ACL-2.</li>
	<li>Préparer la dilution du virus infectieux comme suit :<ol><li>Sortez le stock de virus du congélateur à -80 °C et décongelez-le sur de la glace. Diluer le virus à une dilution virale de 100 nL contenant 100-500 virus PFU avec un milieu RPMI 1640 contenant 10% FBS et 1% P/S. Conserver la dilution du virus sur la glace.</li>
	</ol></li>
	<li>Remplissez l’aiguille avec de l’huile minérale à l’aide d’une seringue stérile jetable. Fixez l’aiguille dans l’injecteur en suivant les instructions sur la machine.</li>
	<li>Insérez l’aiguille dans un tube contenant la dilution du virus infectieux. Ne cassez pas le bout de l’aiguille. Appuyez sur le bouton FILL pour remplir l’aiguille avec une solution virale. Le volume final de la solution virale dans l’aiguille est d’environ 4,0 μL. Une fois que l’aiguille est remplie du virus, veillez à ne pas la toucher et l’endommager. REMARQUE : Les étapes ont été effectuées dans une enceinte de biosécurité.</li>
</ol>5. Effectuer une injection virale au microscope à dissection
NOTE: Toutes les étapes ont été effectuées dans un laboratoire ACL-2.
<ol><li>Anesthésier les moustiques à -20 °C pendant 1 min. Versez-les dans une boîte de Petri placée sur de la glace et couvrez rapidement le couvercle.</li>
	<li>Choisissez près de 50 moustiques femelles avec une pince à épiler et placez-les sur la plaque de glace. Placez la plaque de glace sous l’injecteur et insérez l’aiguille dans la cavité thoracique du moustique sous le microscope à dissection (Figure 1C).</li>
	<li>Réglez le volume d’injection sur 100 nL et le débit sur 50 nL/s. Appuyez sur le bouton INJECT pour laisser la solution virale s’écouler dans le moustique. Si l’injection réussie se produit, l’abdomen sera légèrement bombé.</li>
	<li>Mettez le moustique infecté dans un nouveau gobelet en plastique (24 oz) placé sur de la glace. Lorsque le nombre de moustiques infectés est suffisant, enveloppez la tasse avec un filet de moustiquaire coupé, puis couvrez-la avec le couvercle.</li>
	<li>Conservez la tasse contenant des moustiques infectieux dans l’incubateur à 27 °C à 80% d’humidité pendant 10 jours. Nourrissez les moustiques comme à l’étape 3.5.</li>
</ol>6. Traitement des moustiques femelles infectées
NOTE: Trois tissus / organes différents ont été disséqués de chaque moustique femelle: l’intestin pour calculer le taux d’infection virale (VIR), la tête pour calculer le taux de propagation du virus (VDR) et la salive pour calculer le taux de transmission du virus (VTR). Le VIR a été défini comme le nombre de moustiques ayant des intestins positifs au virus. Le VDR a été défini comme le nombre de moustiques avec des têtes positives au virus divisé par le nombre de moustiques avec des intestins positifs au virus par 100. La VTR a été définie comme le nombre de moustiques avec une salive virale positive divisé par le nombre de moustiques avec des intestins positifs au virus par 100.
<ol><li>Collecte de la salive des moustiques femelles infectées NOTE: Les processus doivent être effectués dans un laboratoire ACL-2.<ol><li>Anesthésier les moustiques femelles infectées par anesthésie au dioxyde de carbone comme à l’étape 3.2. Versez-les dans une boîte de Petri placée sur de la glace et fermez rapidement le couvercle.</li>
		<li>Placez côte à côte des embouts de pipette de 10 μL remplis d’huile d’immersion sur la boue de caoutchouc.</li>
		<li>Choisissez les moustiques femelles avec une pince à épiler et placez-les sur une plaque de glace. Enlevez leurs pattes et leurs ailes avec une pince à épiler. Placez la partie buccale d’un moustique sur chaque pointe de pipette.</li>
		<li>Recueillir la salive sécrétée dans l’huile par les moustiques pendant les 45-60 prochaines minutes à température ambiante.</li>
		<li>Placer les embouts des pipettes dans des tubes de 1,5 mL contenant 200 μL de milieu diluant viral (milieu RPMI 1640 contenant 10 % de FBS et 1 % de P/S). Les centrifuger à 5 000 x g pendant 5 min à 4 °C pour expulser la salive dans des tubes. Entreposer ces tubes à -80 °C pour déterminer ultérieurement les débits de transmission.</li>
	</ol></li>
	<li>Disséquer les moustiques femelles infectées NOTE: Les processus doivent être effectués dans un laboratoire ACL-2.<ol><li>Utilisez une pince à épiler pour couper la tête des moustiques femelles après la collecte de salive. Placer chaque tête dans un tube individuel contenant 200 μL de milieu RPMI 1640.</li>
		<li>Attrapez le thorax avec une pince à épiler, puis l’avant-dernier segment de l’abdomen avec une autre pince à épiler et retirez-le. L’intestin sera retiré. Nettoyez l’intestin arraché de tout tissu et organe errant.</li>
		<li>Laver l’intestin avec du PBS et placer chaque intestin dans un tube individuel contenant 200 μL de milieu RPMI 1640. Conserver ces tubes à -80 °C pour déterminer ensuite le taux d’infection virale et le taux de dissémination.</li>
	</ol></li>
</ol>7. Analyse des données
<ol><li>Extraction d’ARN<ol><li>Broyer les tissus en morceaux à l’aide d’une machine de broyage homogénéiseur de tissus à basse température réglée sur les paramètres suivants: fréquence de fonctionnement = 60 Hz, temps de fonctionnement = 15 s, temps de pause = 10 s, cycles = 2 et température de réglage = 4,0 °C.</li>
		<li>Centrifuger les échantillons à 12 000 x g pendant 10 min à 4 °C. Extraire l’ARN total de chaque échantillon par un système automatisé d’extraction des acides nucléiques en suivant les instructions de l’instrument.</li>
	</ol></li>
	<li>Exécution de la qRT-PCR<ol><li>Utilisez le kit RT-PCR en une étape pour quantifier les copies d’ARN viral à l’aide d’un instrument de PCR quantitative17. Utilisez les amorces suivantes pour la détection du segment F du VEB S : ATGGCATCACCTGGGAAAG et R : TTCCAATGGCAAGTGGATAGAA. Configurer le processus de réaction comme suit: étape 1: 42 °C pendant 5 min, 95 °C pendant 10 s; étape 2: 40 cycles de 95 °C pendant 5 s et de 60 °C pendant 20 s.</li>
		<li>Déterminer la dose virale la plus faible pour l’infection dans les cellules grâce aux dilutions en série de 10 fois inoculées sur les cellules. Utiliser les cellules BHK-21 pour déterminer la dose virale la plus faible de VEB, en utilisant des dilutions jusqu’à 10-7 comme décrit à l’étape 1.2.</li>
		<li>Calculer la valeur Ct de la dose virale la plus faible par qRT-PCR. Utilisez la valeur seuil pour EBIV-positif par qRT-PCR comme < 35. Utilisez l’équation suivante pour calculer les copies de l’EBIV dans chaque échantillon : y = -4,0312x + 3,384 [x = log (les copies de EBIV), y = valeur Ct, R2 = 0,9905]</li>
		<li>Calculez le taux d’infection, le taux de dissémination et le taux de transmission comme suit : Taux d’infection (%) = 100 x (nombre d’intestins de moustiques infectés par le virus / nombre total de moustiques) Taux de dissémination (%) = 100 x (nombre de têtes de moustiques infectées par le virus / nombre d’intestins de moustiques infectés par le virus) Taux de transmission (%) = 100 x (le nombre de salive de moustiques infectés par le virus / le nombre d’intestins de moustiques positifs au virus)</li>
		<li>Analysez les différences dans les variables continues et les différences dans les taux d’infection par les moustiques, les taux de dissémination et les taux de transmission en utilisant l’analyse non paramétrique de Kruskal-Wallis pour des comparaisons multiples et le test exact de Fisher, le cas échéant.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Yu, X., Zhu, Y., Xiao, X., Wang, P., Cheng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+towards+Understanding+the+Mosquito-Borne+Virus+Life+Cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Progress towards Understanding the Mosquito-Borne Virus Life Cycle.</a> Trends in Parasitology. 35 (12), 1009-1017 (2019).</li>
<li>Sukhralia, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+dengue+to+Zika%3A+the+wide+spread+of+mosquito-borne+arboviruses%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Clinical+Microbiology+%26+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">From dengue to Zika: the wide spread of mosquito-borne arboviruses.</a> European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 38 (1), 3-14 (2019).</li>
<li>Kuhn, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taxonomic+update+of+phylum+Negarnaviricota+%28Riboviria%3A+Orthornavirae%29%2C+including+the+large+orders+Bunyavirales+and+Mononegavirales%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Taxonomic update of phylum Negarnaviricota (Riboviria: Orthornavirae), including the large orders Bunyavirales and Mononegavirales.</a> Archives of Virology. 166 (12), 3513-3566 (2021).</li>
<li>Bhatt, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+global+distribution+and+burden+of+dengue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The global distribution and burden of dengue.</a> Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).</li>
<li>Kindhauser, M. K., Allen, T., Frank, V., Santhana, R. S., Dye, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zika%3A+the+origin+and+spread+of+a+mosquito-borne+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Bull+World+Health+Organ%22%5BJournal%5D)">Zika: the origin and spread of a mosquito-borne virus.</a> Bull World Health Organ. 94 (9), 675-686 (2016).</li>
<li>Wei, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+for+DENV-2+Among+Aedes+albopictus+%28Diptera%3A+Culicidae%29+Populations+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Vector Competence for DENV-2 Among Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Populations in China.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 11, (2021).</li>
<li>Morales-Vargas, R. E., Misse, D., Chavez, I. F., Kittayapong, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+for+Dengue-2+Viruses+Isolated+from+Patients+with+Different+Disease+Severity%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">Vector Competence for Dengue-2 Viruses Isolated from Patients with Different Disease Severity.</a> Pathogens. 9 (10), (2020).</li>
<li>Naslund, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+Mosquito-Borne+Viruses+Linked+to+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus%3A+Global+Status+and+Preventive+Strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Vector-Borne+and+Zoonotic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Emerging Mosquito-Borne Viruses Linked to Aedes aegypti and Aedes albopictus: Global Status and Preventive Strategies.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 21 (10), 731-746 (2021).</li>
<li>Lwande, O. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Globe-Trotting+Aedes+aegypti+and+Aedes+albopictus%3A+Risk+Factors+for+Arbovirus+Pandemics%5BTitle%5D)+AND+%22Vector-Borne+and+Zoonotic+Diseases%22%5BJournal%5D)">Globe-Trotting Aedes aegypti and Aedes albopictus: Risk Factors for Arbovirus Pandemics.</a> Vector-Borne and Zoonotic Diseases. 20 (2), 71-81 (2020).</li>
<li>Liu-Helmersson, J., Brannstrom, A., Sewe, M. O., Semenza, J. C., Rocklov, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimating+Past%2C+Present%2C+and+Future+Trends+in+the+Global+Distribution+and+Abundance+of+the+Arbovirus+Vector+Aedes+aegypti+Under+Climate+Change+Scenarios%5BTitle%5D)+AND+%22Fronters+in+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Estimating Past, Present, and Future Trends in the Global Distribution and Abundance of the Arbovirus Vector Aedes aegypti Under Climate Change Scenarios.</a> Fronters in Public Health. 7, 148(2019).</li>
<li>Cai, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+2021+China+report+of+the+Lancet+Countdown+on+health+and+climate+change%3A+seizing+the+window+of+opportunity%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Public+Health%22%5BJournal%5D)">The 2021 China report of the Lancet Countdown on health and climate change: seizing the window of opportunity.</a> Lancet Public Health. 6 (12), 932-947 (2021).</li>
<li>Chan, K. K., Auguste, A. J., Brewster, C. C., Paulson, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+of+Virginia+mosquitoes+for+Zika+and+Cache+Valley+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Vector competence of Virginia mosquitoes for Zika and Cache Valley viruses.</a> Parasites & Vectors. 13 (1), 188(2020).</li>
<li>Kumar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito+Innate+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Insects%22%5BJournal%5D)">Mosquito Innate Immunity.</a> Insects. 9 (3), (2018).</li>
<li>Franz, A. W., Kantor, A. M., Passarelli, A. L., Clem, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Barriers+to+Arbovirus+Infection+in+Mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Tissue Barriers to Arbovirus Infection in Mosquitoes.</a> Viruses. 7 (7), 3741-3767 (2015).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+Ebinur+Lake+Virus+and+Its+Human+Seroprevalence+at+the+China-Kazakhstan+Border%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of Ebinur Lake Virus and Its Human Seroprevalence at the China-Kazakhstan Border.</a> Frontiers in Microbiology. 10, (2020).</li>
<li>Baer, A., Kehn-Hall, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+Concentration+Determination+Through+Plaque+Assays%3A+Using+Traditional+and+Novel+Overlay+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Jove-Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Viral Concentration Determination Through Plaque Assays: Using Traditional and Novel Overlay Systems.</a> Jove-Journal of Visualized Experiments. (93), e52065(2014).</li>
<li>Xu, M. Y., Liu, S. Q., Deng, C. L., Zhang, Q. Y., Zhang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Zika+virus+by+SYBR+green+one-step+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virological+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of Zika virus by SYBR green one-step real-time RT-PCR.</a> Journal of Virological Methods. 236, 93-97 (2016).</li>
<li>Yang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+and+transcriptional+response+of+Aedes+aegypti+for+Ebinur+Lake+virus%2C+a+newly+mosquito-borne+orthobunyavirus%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Vector competence and transcriptional response of Aedes aegypti for Ebinur Lake virus, a newly mosquito-borne orthobunyavirus.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Britton, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laboratory-acquired+dengue+virus+infection--a+case+report%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Laboratory-acquired dengue virus infection--a case report.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 5 (11), 1324(2011).</li>
<li>Weger-Lucarelli, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+Competence+of+American+Mosquitoes+for+Three+Strains+of+Zika+Virus%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Neglected+Tropical+Diseases%22%5BJournal%5D)">Vector Competence of American Mosquitoes for Three Strains of Zika Virus.</a> PLOS Neglected Tropical Diseases. 10 (10), 0005101(2016).</li>
<li>Elizondo-Quiroga, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vector+competence+of+Aedes+aegypti+and+Culex+quinquefasciatus+from+the+metropolitan+area+of+Guadalajara%2C+Jalisco%2C+Mexico+for+Zika+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+reports%22%5BJournal%5D)">Vector competence of Aedes aegypti and Culex quinquefasciatus from the metropolitan area of Guadalajara, Jalisco, Mexico for Zika virus.</a> Scientific reports. 9 (1), 16955(2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

L’objectif de cette méthode était de fournir une évaluation complète des risques d’un virus transmis par les moustiques en évaluant la compétence des vecteurs par l’alimentation orale et l’inoculation intrathoracique.
Dans l’expérience d’alimentation orale, les moustiques engorgés doivent être choisis et transférés dans un nouveau conteneur, ce qui pose un risque grave pour les opérateurs. La raison en est que tout moustique, y compris les moustiques non infectés, pourrait être une source d’in...

Les virus transmis par les moustiques (MBV), un groupe hétérogène de virus à ARN, peuvent persister chez les moustiques vecteurs et se propager ensuite aux hôtes vertébrés1. Les MBV cliniquement importants sont principalement répartis dans quatre familles de virus, à savoir Flaviviridae, Togaviridae, Reoviridae et Peribunyavividae 2,3. Au cours des dernières décennies, ces virus ont été signalés partout dans le monde, causant des problèmes de santé publique. En tant que l’un des MBV les plus connus, le virus de la dengue (DENV) est devenu l’arbovirus émergent ou ré-émergent le plus répandu dans plus de 100 pays au cours des 20 dernières années4. Depuis la découverte du virus Zika (ZIKV) à l’intérieur des terres, presque tous les pays et territoires tropicaux et subtropicaux du continent ont signalé des infections humaines par le ZIKV5. Afin d’évaluer le risque de transmission du virus, de nombreuses études menées ces dernières années ont porté sur la compétence des moustiques vecteurs pour ces virus 6,7. Par conséquent, il est essentiel de prévenir et de contrôler efficacement les maladies à transmission vectorielle.
Aedes aegypti (Ae. aegypti), l’un des moustiques les plus faciles à élever en laboratoire, est un vecteur important du DENV, du ZIKV, du virus Chikungunya (CHIKV) et du virus de la fièvre jaune (YFV)8. Pendant longtemps, Ae. aegypti n’a été trouvé que sur le continent africain et en Asie du Sud-Est, mais ces dernières années, il a colonisé presque tous les continents9. En outre, l’abondance mondiale d’Ae. aegypti n’a cessé de croître, avec une augmentation estimée à 20% d’ici la fin du siècle10. De 2004 à 2009 en Chine, il y a eu une augmentation évidente de la compétence du vecteur Ae. aegypti pour le DENV en raison des températures quotidiennes plus élevées11. Le statut d’Ae. aegypti en tant que vecteur pathogène a considérablement augmenté en Chine. Par conséquent, pour relever ces défis, il est nécessaire d’étudier la compétence vectorielle des Ae. aegypti pour transmettre des virus.
En tant qu’arthropode hématophage, le moustique femelle perce la peau d’un hôte vertébré et se nourrit du sang. Les moustiques acquièrent parfois des virus auprès d’hôtes infectés par des virus, puis transfèrent les virus à un nouvel hôte. Ainsi, pour déterminer la compétence des vecteurs, les moustiques sont nourris avec une farine de sang artificielle contenant des arbovirus grâce à un système d’alimentation en laboratoire12. Les moustiques individuels sont séparés en têtes, corps et sécrétions de salive plusieurs jours après l’infection. Pour mesurer les taux d’infection, de dissémination et de transmission du virus, les titres de virus ont été détectés par PCR quantitative à transcription inverse (qRT-PCR) ou dosage de plaque. Cependant, tous les moustiques ne développent pas d’infections de l’intestin moyen et la capacité de transférer un virus à l’hôte suivant après l’alimentation par le sang. Il est lié aux barrières physiologiques des moustiques, qui empêchent les agents pathogènes de pénétrer dans le corps et jouent un rôle essentiel dans leur immunité innée13. Les barrières de l’intestin moyen, en particulier la barrière d’infection de l’intestin moyen (MIB) et la barrière de fuite de l’intestin moyen (MEB), influencent si le virus pourrait infecter le vecteur par voie systémique et l’efficacité avec laquelle il se propage. Il entrave l’analyse de l’infection d’autres tissus, tels que les glandes salivaires qui présentent également une infection des glandes salivaires et échappentaux barrières 13,14. Pour mieux caractériser l’infection de l’intestin moyen et des glandes salivaires chez le vecteur, un protocole détaillé pour l’alimentation orale et l’inoculation intrathoracique de l’arbovirus chez Ae. aegypti est présenté ici. Ce protocole pourrait être appliqué à d’autres infections à arbovirus chez divers moustiques vecteurs, tels que l’infection par le DENV et le ZIKV chez Aedes spp., et pourrait s’avérer une procédure pratique.

<table><tbody><tr><td>Aedes aegypti&nbsp ;</td><td></td><td></td> Système automatisé d’extraction d’acides nucléiques <td>de la souche Rockefeller</td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Cellules NanoMagBio</td><td>S-48</td><td></td></tr><tr><td>BHK-21</td><td>Centre national de ressources sur les virus, Institut de virologie</td><td></td><td></td>de Wuhan</tr><tr><td>Seaux de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellules C6/36&nbsp ;</td><td>Centre national de ressources sur les virus, Institut de virologie</td><td></td><td></td>de Wuhan</tr><tr><td>Pistolet de pulvérisation de dioxyde de carbone.</td><td>wuhan Yihong</td><td>YHDFPCO2</td><td></td></tr><tr><td>Machine centrifuge</td><td>Himac&nbsp ;</td><td>CF16RN</td><td></td></tr><tr><td>CFX96 Touch Système de détection PCR en temps réel&nbsp ;</td><td>Bio-Rad</td><td>CFX96 Touch</td><td></td></tr><tr><td>Ebinur Lake</td><td></td><td></td><td>virus Cu20-XJ</td></tr><tr><td>isolement Formaldéhyde&nbsp ;</td><td>Wuhan Baiqiandu</td><td>B0003</td><td></td></tr><tr><td>Boîte à gants&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Hushi</td><td>10010518</td><td></td></tr><tr><td>Huile d’immersion&nbsp ;</td><td>Cargille</td><td>16908-1</td><td></td></tr><tr><td>Incubateur d’insectes</td><td>Memmert</td><td>HPP750T7</td><td></td></tr><tr><td>Broyeur homogénéisateur de tissus à basse température&nbsp ;</td><td>Servicebio</td><td>KZ-III-F</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction du génome du virus magnétique</td><td>NanoMagBio</td><td>NMG0966-16</td><td></td></tr><tr><td>cages à mailles (30 x 30 x 30 cm)</td><td>Huayu</td><td>HY-35</td><td></td></tr><tr><td>méthylcellulose</td><td>Calbiochem</td><td>17851</td><td></td></tr> souris <tr><td>aliment en poudre&nbsp ;</td><td>BESSN</td><td>BS018</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de microélectrodes</td><td>WPI</td><td>PUL-1000</td><td>PUL-1000&nbsp ; est un extracteur horizontal contrôlé par microprocesseur pour la fabrication de micropipettes ou de microélectrodes en verre utilisé dans l’enregistrement intracellulaire, les études de patch clamp, la microperfusion ou la micro-injection.</td></tr><tr><td>Mailles moustiquaires&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanoject III Injecteur Programmable</td><td>Nanolitre Drummond</td><td>3-000-207</td><td></td></tr><tr><td>One Step TB Vert PrimeScript PLUS RT-PCR Kit&nbsp ;</td><td>Takara</td><td>RR096A</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>C10010500BT</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline/streptomycine</td><td>Gibco</td><td>151140-122</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gobelets en plastique (7 oz)</td>Gobelets en plastique <td>Hubei Duoanduo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(24 oz)&nbsp ;</td><td>Anhui shangji</td><td>PET32-Tub-1</td><td></td></tr><tr><td>Compte-gouttes jetables</td><td>en plastique Biosharp</td><td>BS-XG-O3L-NS</td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur (-80 &deg ; C)</td><td>sanyo</td><td>MDF-U54V</td><td></td></tr><tr><td>Capillaires en verre de remplacement</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>RPMI moyen 1640&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>C11875500BT</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de stockage à bouchon à vis (2 mL )</td><td>biofil</td><td>&nbsp ; </td><td></td>FCT010005</tr><tr><td>Plats peu profonds&nbsp ;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éponge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stérile défibrillé sang de cheval</td><td>Wuhan Pureté Biotechnologie</td><td>CDHXB413</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture T75</td><td>Corning</td><td>430829</td><td></td></tr><tr><td>Le système d’alimentation artificielle contre les moustiques&nbsp ;</td><td>Hemotek</td><td>Hemotek PS6</td><td></td></tr><tr><td>Le microscope de dissection&nbsp ;</td><td>ZEISS°</td><td> stemi508</td><td></td></tr><tr><td>Les plaques</td><td></td><td></td><td></td>de glace</tr><tr><td>La machine à absorber les moustiques&nbsp ;</td><td>Ningbo Bangning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Les pointes de pipette&nbsp ;</td><td>Axygen</td><td>TF</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0.25 %)</td><td>Gicco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Dumont</td><td>0203-5-PO</td><td></td></tr></tbody></table>

infection virale expérimentale chez les moustiques adultes par alimentation orale et micro-injection

Experimental Viral Infection in Adult Mosquitoes by Oral Feeding and Microinjection

Les virus transmis par les moustiques (MBV), qui sont des agents pathogènes infectieux pour les vertébrés, sont propagés par de nombreuses espèces de moustiques, ce qui constitue une grave menace pour la santé publique. Une fois ingérés, les virus doivent surmonter la barrière de l’intestin moyen des moustiques pour atteindre l’hémolymphe, d’où ils pourraient potentiellement se propager aux glandes salivaires. Lorsqu’un moustique pique, ces virus se propagent à de nouveaux hôtes vertébrés. De même, le moustique peut attraper différents virus. En général, seule une infime partie des virus peut pénétrer dans les glandes salivaires par l’intestin. L’efficacité de transmission de ces virus aux glandes est affectée par les deux barrières physiques trouvées chez différentes espèces de moustiques: les barrières de l’intestin moyen et les barrières des glandes salivaires. Ce protocole présente une méthode de détection du virus dans les glandes salivaires d’Aedes aegypti après une infection par voie orale et par injection intrathoracique. De plus, déterminer si les intestins et/ou les glandes salivaires entravent la propagation virale peut aider à évaluer les risques de MBV transmis par Aedes aegypti.

Pour examiner la distribution du VEB chez les moustiques infectés par injection sanguine artificielle (le titre final viral était de 6,4 x 106 UFP/mL) et par injection intrathoracique (la dose virale était de 340 UFP), les ARN viraux dans la salive, la tête et les intestins des moustiques 10 jours après l’infection (dpi) ont été déterminés.
Dans le cas d’Ae. aegypti, le titre du virus de l’EBIV dans les intestins, la tête et la salive des moustiques femelles inocul...

Cette méthodologie, qui comprenait l’alimentation par voie orale et l’infection par injection intrathoracique, pourrait évaluer efficacement l’influence des barrières de l’intestin moyen et / ou des glandes salivaires sur l’infection à arbovirus.

Infection virale expérimentale chez les moustiques adultes par alimentation orale et micro-injection

Mosquito-borne viruses (MBVs), which are infectious pathogens to vertebrates, are spread by many mosquito species, posing a severe threat to public ...

Ce protocole peut déterminer si les intestins et les glandes thyroïdes entravent la propagation virale et peut aider à évaluer les risques de virus transmis par les moustiques transmis par Aedes aegypti. Notre protocole comprenait deux méthodes d’infection, l’alimentation orale et l’injection intrathoracique, qui pouvaient évaluer efficacement la compétence vectorielle de l’arbovirus. Ce protocole pourrait être appliqué à d’autres infections à arbovirus chez divers moustiques vecteurs, tels que le virus de la dengue et l’infection par le virus Zika chez Aedes, et pourrait s’avérer une procédure réalisable.La démonstration de la procédure sera Fei Wang, un assistant de recherche de mon laboratoire. Pour effectuer une alimentation artificielle à l’aide du système d’alimentation artificiel contre les moustiques, coupez les membranes de collagène à la taille appropriée et fixez-les aux réservoirs avec les joints toriques. Ajoutez trois millilitres du mélange virus-sang dans les réservoirs et scellez les réservoirs à l’aide de bouchons en plastique pour éviter les fuites.Mettez les gobelets en plastique contenant des moustiques dans la boîte à gants. Vissez les réservoirs scellés dans l

experimental-viral-infection-adult-mosquitoes-oral-feeding

Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Méthodes d'utilisation des systèmes de transduction alphavirus pour exprimer des reporters fluorescents in vitro et chez les moustiques adultes sont décrits. Cette technique peut être adaptée pour exprimer toute protéine d'intérêt en remplacement ou en complément à un journaliste.

Système Alphavirus Transducing: des outils de visualisation des infections dans les moustiques vecteurs

Source : Liu, X., et al. Un test oral bactérien avec des moustiques traités aux antibiotiques. J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre l’appauvrissement du microbiote intestin naturel chez les moustiques à l’aide d’une solution contenant des antibiotiques en saccharose. Cela est suivi d’une recolonisation contrôlée avec une suspension bactérienne délivrée via un système d’alimentation membranaire afin d’établir une population bactérienne définie dans l’intestin du moustique.

Établissement d’une population bactérienne intestinale définie chez les moustiques adultes

Dans cette vidéo, nous décrivons une procédure permettant d’effectuer une nano-injection d’un virus à ARN simple brin de sens positif chez des mouches drosophiles mâles adultes, puis d’étudier les réponses antivirales initiées en raison de l’infection. L’analyse de l’amplification en chaîne par polymérase identifie la régulation positive de gènes spécifiques chez les mouches infectées qui indiquent l’activation des voies de réponse immunitaire, y compris l’interférence ARN et la signalisation...

Nano-injection virale intrathoracique pour étudier les interactions hôte-virus chez les mouches adultes

Nous décrivons un modèle murin de paludisme cérébral expérimental et montrons comment la pathologie inflammatoire et microvasculaire peut être suivie in vivo à l’aide de l’imagerie par résonance magnétique.

Le suivi in vivo du développement de l&#39;œdème et de la pathologie microvasculaire dans un modèle de paludisme cérébral expérimental utilisant l&#39;imagerie par résonance magnétique

Nous rapportons en utilisant une artificiel intronic petit RNA expression stratégie à élaborer un recombinant non défectueux densovirus (AaeDV) Aedes aegypti in vivo système de livraison. Une procédure détaillée pour la construction, emballage et l’analyse quantitative des vecteurs rAaeDV aussi bien en ce qui concerne l’infection larvaire est décrite.

Utilisation d’un moustique Recombinant Densovirus comme un vecteur de livraison de gène pour l’analyse fonctionnelle des gènes chez les larves de moustiques

Pour un contrôle efficace des moustiques, la charge de la transmission du virus, la connaissance du potentiel vecteur de moustiques respectifs est particulièrement intéressant. Nous décrivons la salivation forcée comme une méthode pour analyser la compétence vectorielle d’Aedes albopictus et trois différents taxons de Culex pour la transmission du virus Zika.

Forcé de Salivation comme une méthode pour analyser la compétence vectorielle de moustiques

Ce protocole décrit une méthode de microinjection que nous avons normalisé et utilisé depuis plusieurs années à livrer des quantités d’acides nucléiques spécifiques directement à l’hémolymphe des moustiques et des mouches domestiques. Ce protocole se traduit par la mortalité injection minime et permet des mesures de dose en corrélation de la fécondité.

DsRNA reproductible Microinjection et bioessais sur la ponte chez les moustiques et les mouches domestiques

Le protocole présenté peut déterminer la compétence vectorielle des populations de moustiques Aedes aegypti pour un virus donné, tel que Zika, dans un contexte de confinement.

Analyses de compétence vectorielle sur les moustiques Aedes aegypti utilisant le virus Zika

Cet article présente un protocole pour étudier l’effet des bactéries intestinales des moustiques individuelles, y compris l’isolement et l’identification des microbes cultivables midgut moustique, l’épuisement antibiotique des bactéries intestinales des moustiques, et réintroduire une espèce spécifique de bactéries.

Un test d’alimentation orale bactérienne avec des moustiques traités aux antibiotiques

L’objectif de ce protocole est de livrer des repas de sang artificiels et d’origine animale aux moustiques Aedes aegypti par l’intermédiaire d’une mangeoire à membrane artificielle et de quantifier avec précision le volume de repas ingérés.

Alimentation et quantification du sang d’origine animale et des repas artificiels chez les moustiques Aedes aegypti

L’administration orale d’ARNd produit par des bactéries, une méthode d’administration de l’interférence ARN (ARNi) couramment utilisée chez Caenorhabditis elegans, a été appliquée avec succès ici aux moustiques adultes. Notre méthode permet des études robustes de génétique inverse et des études de vecteurs bloquant la transmission sans l’utilisation de l’injection.

Administration efficace d’interférence ARN orale (ARNi) aux moustiques anophèles gambiens adultes

Découvrez l'infection virale expérimentale chez les moustiques adultes par alimentation orale et micro-injection. Cette méthode évalue la compétence vectorielle d'Aedes aegypti pour les arbovirus.

Infection virale expérimentale chez les moustiques adultes par alimentation orale et micro-injection

Explorer plus de vidéos