Name: Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-01T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: Découvrez l'isolement de lysats protéiques de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales pour l'analyse des phosphoprotéines. Cette méthode préserve l'état de phosphorylation des protéines.

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129S4 souris étaient un cadeau du Dr Philippe Soriano, Icahn School of Medicine à Mount Sinai. Ce travail a été soutenu par des fonds des National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Dental and Craniofacial Research (NIDCR) R01 DE027689 et K02 DE028572 à K.A.F., F31 DE029976 à M.A.R. et F31 DE029364 à B.J.C.D.

<ol><li>Bush, J. O., Jiang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Palatogenesis%3A+morphogenetic+and+molecular+mechanisms+of+secondary+palate+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Palatogenesis: morphogenetic and molecular mechanisms of secondary palate development.</a> Development. 139 (2), 231-243 (2012).</li>
<li>Chai, Y., Ito, Y., Han, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+and+its+functional+significance+in+regulating+the+fate+of+cranial+neural+crest+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Oral+Biology+%26+Medicine%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling and its functional significance in regulating the fate of cranial neural crest cells.</a> Critical Reviews in Oral Biology & Medicine. 14 (2), 78-88 (2003).</li>
<li>Nie, X., Luukko, K., Kettunen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+signalling+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22TheInternational+Journal+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">BMP signalling in craniofacial development.</a> TheInternational Journal of Developmental Biology. 50 (6), 511-521 (2006).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor+tyrosine+kinase+signaling%3A+regulating+neural+crest+development+one+phosphate+at+a+time%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Receptor tyrosine kinase signaling: regulating neural crest development one phosphate at a time.</a> Current Topics in Developmental Biology. 111, 135-182 (2015).</li>
<li>Xavier, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hedgehog+receptor+function+during+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Hedgehog receptor function during craniofacial development.</a> Developmental Biology. 415 (2), 198-215 (2016).</li>
<li>Grimsrud, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP-6+is+an+autocrine+stimulator+of+chondrocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 14 (4), 475-482 (1999).</li>
<li>MacArthur, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-8+isoforms+activate+receptor+splice+forms+that+are+expressed+in+mesenchymal+regions+of+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">FGF-8 isoforms activate receptor splice forms that are expressed in mesenchymal regions of mouse development.</a> Development. 121 (11), 3603-3613 (1995).</li>
<li>Tucker, A. S., Yamada, G., Grigoriou, M., Pachnis, V., Sharpe, P. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fgf-8+determines+rostral-caudal+polarity+in+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Fgf-8 determines rostral-caudal polarity in the first branchial arch.</a> Development. 126 (1), 51-61 (1999).</li>
<li>Trumpp, A., Depew, M. J., Rubenstein, J. L., Bishop, J. M., Martin, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre-mediated+gene+inactivation+demonstrates+that+FGF8+is+required+for+cell+survival+and+patterning+of+the+first+branchial+arch%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Cre-mediated gene inactivation demonstrates that FGF8 is required for cell survival and patterning of the first branchial arch.</a> Genes & Development. 13 (23), 3136-3148 (1999).</li>
<li>Tabler, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fuz+mutant+mice+reveal+shared+mechanisms+between+ciliopathies+and+FGF-related+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Fuz mutant mice reveal shared mechanisms between ciliopathies and FGF-related syndromes.</a> Developmental Cell. 25 (6), 623-635 (2013).</li>
<li>Pakvasa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling%3A+Its+essential+roles+in+bone+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Diseases%22%5BJournal%5D)">Notch signaling: Its essential roles in bone and craniofacial development.</a> Genes & Diseases. 8 (1), 8-24 (2021).</li>
<li>Chai, Y., Bringas, P., Mogharei, A., Shuler, C. F., Slavkin, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGF-A+and+PDGFR-alpha+regulate+tooth+formation+via+autocrine+mechanism+during+mandibular+morphogenesis+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">PDGF-A and PDGFR-alpha regulate tooth formation via autocrine mechanism during mandibular morphogenesis in vitro.</a> Developmental Dynamics. 213 (4), 500-511 (1998).</li>
<li>Morrison-Graham, K., Schatteman, G. C., Bork, T., Bowen-Pope, D. F., Weston, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+PDGF+receptor+mutation+in+the+mouse+%28Patch%29+perturbs+the+development+of+a+non-neuronal+subset+of+neural+crest-derived+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A PDGF receptor mutation in the mouse (Patch) perturbs the development of a non-neuronal subset of neural crest-derived cells.</a> Development. 115 (1), 133-142 (1992).</li>
<li>Orr-Urtreger, A., Lonai, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-derived+growth+factor-A+and+its+receptor+are+expressed+in+separate%2C+but+adjacent+cell+layers+of+the+mouse+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Platelet-derived growth factor-A and its receptor are expressed in separate, but adjacent cell layers of the mouse embryo.</a> Development. 115 (4), 1045-1058 (1992).</li>
<li>Ding, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mouse+Pdgfc+gene%3A+dynamic+expression+in+embryonic+tissues+during+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">The mouse Pdgfc gene: dynamic expression in embryonic tissues during organogenesis.</a> Mechanisms of Development. 96 (2), 209-213 (2000).</li>
<li>Hamilton, T. G., Klinghoffer, R. A., Corrin, P. D., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+divergence+of+platelet-derived+growth+factor+alpha+receptor+signaling+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolutionary divergence of platelet-derived growth factor alpha receptor signaling mechanisms.</a> Molecular and Cellular Biology. 23 (11), 4013-4025 (2003).</li>
<li>He, F., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+role+for+PDGFRalpha+signaling+in+medial+nasal+process+development%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A critical role for PDGFRalpha signaling in medial nasal process development.</a> PLoS Genetics. 9 (9), 1003851(2013).</li>
<li>Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 103 (2), 211-225 (2000).</li>
<li>Lemmon, M. A., Schlessinger, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+signaling+by+receptor+tyrosine+kinases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell signaling by receptor tyrosine kinases.</a> Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).</li>
<li>Kim, W. J., Shin, H. L., Kim, B. S., Kim, H. J., Ryoo, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RUNX2-modifying+enzymes%3A+therapeutic+targets+for+bone+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+%26+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">RUNX2-modifying enzymes: therapeutic targets for bone diseases.</a> Experimental & Molecular Medicine. 52 (8), 1178-1184 (2020).</li>
<li>Firulli, B. A., Firulli, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partially+penetrant+cardiac+neural+crest+defects+in+Hand1+Phosphomutant+mice%3A+Dimer+choice+that+is+not+so+critical%5BTitle%5D)+AND+%22Pediatric+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Partially penetrant cardiac neural crest defects in Hand1 Phosphomutant mice: Dimer choice that is not so critical.</a> Pediatric Cardiology. 40 (7), 1339-1344 (2019).</li>
<li>Choi, Y. H., Choi, H. J., Lee, K. Y., Oh, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt1+regulates+phosphorylation+and+osteogenic+activity+of+Dlx3%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt1 regulates phosphorylation and osteogenic activity of Dlx3.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 425 (4), 800-805 (2012).</li>
<li>Jeong, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Akt+phosphorylates+and+regulates+the+function+of+Dlx5%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Akt phosphorylates and regulates the function of Dlx5.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 409 (4), 681-686 (2011).</li>
<li>Seo, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calmodulin-dependent+kinase+II+regulates+Dlx5+during+osteoblast+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Calmodulin-dependent kinase II regulates Dlx5 during osteoblast differentiation.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 384 (1), 100-104 (2009).</li>
<li>Gou, Y., Zhang, T., Xu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factors+in+craniofacial+development%3A+From+receptor+signaling+to+transcriptional+and+epigenetic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Transcription factors in craniofacial development: From receptor signaling to transcriptional and epigenetic regulation.</a> Current Topics in Developmental Biology. 115, 377-410 (2015).</li>
<li>Schock, E. N., LaBonne, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sorting+sox%3A+Diverse+roles+for+sox+transcription+factors+during+neural+crest+and+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">Sorting sox: Diverse roles for sox transcription factors during neural crest and craniofacial development.</a> Frontiers in Physiology. 11, 606889(2020).</li>
<li>Dennison, B. J. C., Larson, E. D., Fu, R., Mo, J., Fantauzzo, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Srsf3+mediates+alternative+RNA+splicing+downstream+of+PDGFRalpha+signaling+in+the+facial+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Srsf3 mediates alternative RNA splicing downstream of PDGFRalpha signaling in the facial mesenchyme.</a> Development. 148 (14), (2021).</li>
<li>Stamm, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+alternative+splicing+by+reversible+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Regulation of alternative splicing by reversible protein phosphorylation.</a> Journal of Biological Chemistry. 283 (3), 1223-1227 (2008).</li>
<li>Szabo, A., Mayor, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+neural+crest+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of neural crest migration.</a> Annual Review of Genetics. 52, 43-63 (2018).</li>
<li>Kindberg, A. A., Bush, J. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+organization+and+boundary+formation+in+craniofacial+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">Cellular organization and boundary formation in craniofacial development.</a> Genesis. 57 (1), 23271(2019).</li>
<li>Faundes, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Raine+syndrome%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Medical+Genetics%22%5BJournal%5D)">Raine syndrome: an overview.</a> European Journal of Medical Genetics. 57 (9), 536-542 (2014).</li>
<li>Bush, J. O., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ephrin-B1+forward+signaling+regulates+craniofacial+morphogenesis+by+controlling+cell+proliferation+across+Eph-ephrin+boundaries%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">Ephrin-B1 forward signaling regulates craniofacial morphogenesis by controlling cell proliferation across Eph-ephrin boundaries.</a> Genes & Development. 24 (18), 2068-2080 (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+an+immortalized+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Generation of an immortalized mouse embryonic palatal mesenchyme cell line.</a> PLoS One. 12 (6), 0179078(2017).</li>
<li>Goering, J. P., Isai, D. G., Czirok, A., Saadi, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+time-lapse+imaging+of+primary+mouse+embryonic+palatal+mesenchyme+cells+to+analyze+collective+movement+attributes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Isolation and time-lapse imaging of primary mouse embryonic palatal mesenchyme cells to analyze collective movement attributes.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e62151(2021).</li>
<li>JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Cellular+and+Molecular+Biology.+The+Western+Blot%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Education+Database%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. The Western Blot.</a> Science Education Database. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Miller, L. Analyzing gels and western blots with ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/">https://lukemiller.og/index.php/2010/11/analyzing-gels-and-western-blots-with-images-j/</a> (2010).</li>
<li>Fantauzzo, K. A., Soriano, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PI3K-mediated+PDGFRalpha+signaling+regulates+survival+and+proliferation+in+skeletal+development+through+p53-dependent+intracellular+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%26+Development%22%5BJournal%5D)">PI3K-mediated PDGFRalpha signaling regulates survival and proliferation in skeletal development through p53-dependent intracellular pathways.</a> Genes & Development. 28 (9), 1005-1017 (2014).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+alteration+of+protein+phosphorylation+during+postmortem%3A+implication+in+the+study+of+protein+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Rapid alteration of protein phosphorylation during postmortem: implication in the study of protein phosphorylation.</a> Scientific Reports. 5, 15709(2015).</li>
<li>Sharma, S. K., Carew, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+of+phosphatase+inhibitors+during+Western+blotting+enhances+signal+detection+with+phospho-specific+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Inclusion of phosphatase inhibitors during Western blotting enhances signal detection with phospho-specific antibodies.</a> Analytical Biochemistry. 307 (1), 187-189 (2002).</li>
<li>Bass, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+technical+considerations+for+Western+blotting+applications+to+physiological+research%5BTitle%5D)+AND+%22Scandinavian+Journal+of+Medicine+%26+Science+in+Sports%22%5BJournal%5D)">An overview of technical considerations for Western blotting applications to physiological research.</a> Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 27 (1), 4-25 (2017).</li>
<li>Hooper, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systems+biology+of+facial+development%3A+contributions+of+ectoderm+and+mesenchyme%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Systems biology of facial development: contributions of ectoderm and mesenchyme.</a> Developmental Biology. 426 (1), 97-114 (2017).</li>
<li>Childs, C. B., Proper, J. A., Tucker, R. F., Moses, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serum+contains+a+platelet-derived+transforming+growth+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Serum contains a platelet-derived transforming growth factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 79 (17), 5312-5316 (1982).</li>
<li>Swaisgood, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+and+update+of+casein+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Dairy+Science%22%5BJournal%5D)">Review and update of casein chemistry.</a> Journal of Dairy Science. 76 (10), 3054-3061 (1993).</li>
<li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fastest+Western+in+town%3A+a+contemporary+twist+on+the+classic+Western+blot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">The fastest Western in town: a contemporary twist on the classic Western blot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (84), e51149(2014).</li>
<li>Salinovich, O., Montelaro, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+staining+and+peptide+mapping+of+proteins+transferred+to+nitrocellulose+after+separation+by+sodium+dodecylsulfate-polyacrylamide+gel+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible staining and peptide mapping of proteins transferred to nitrocellulose after separation by sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis.</a> Analytical Biochemistry. 156 (2), 341-347 (1986).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ici permet aux chercheurs de sonder les événements critiques de signalisation dépendant de la phosphorylation au cours du développement craniofacial de manière robuste et reproductible. Ce protocole comporte plusieurs étapes essentielles qui garantissent une collecte appropriée des données et une analyse des résultats. Qu’il s’agisse d’isoler des phosphoprotéines des processus faciaux de souris et/ou de cultiver des cellules de mésenchyme palatal, il est impératif de se déplacer rapidement et efficace...

Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Chez la souris, ce processus commence au jour embryonnaire (E) 9,5 avec la formation de la proéminence frontonasale et de paires de processus maxillaires et mandibulaires, chacun contenant des cellules de la crête neurale crânienne post-migratoire. Les processus nasaux latéraux et médiaux proviennent de la proéminence frontonasale avec l’apparition des fosses nasales et finissent par fusionner pour former les narines. De plus, les processus nasaux médiaux et les processus maxillaires fusionnent pour générer la lèvre supérieure. Parallèlement, la palatogenèse est initiée par la formation d’excroissances distinctes - les plateaux palataux secondaires - du côté oral des processus maxillaires à E11.5. Au fil du temps, les étagères palatines se développent vers le bas de chaque côté de la langue, s’élèvent à une position opposée au-dessus de la langue et finissent par fusionner à la ligne médiane pour former un palais continu qui sépare les cavités nasale et buccale par E16.51.
Ces changements morphologiques tout au long du développement craniofacial sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Par exemple, les récepteurs de la membrane cellulaire, tels que les sous-familles de récepteurs β du facteur de croissance transformant (TGF), y compris les récepteurs de protéines morphogénétiques osseuses (BMPR) et diverses familles de récepteurs tyrosine kinase (RTK), sont autophosphorylés lors de la liaison et de l’activation du ligand dans les cellules de la crête neurale crânienne 2,3,4 . De plus, le récepteur transmembranaire couplé à la protéine G Smoothened devient phosphorylé dans les cellules de la crête neurale crânienne et l’ectoderme craniofacial en aval de la liaison du ligand sonic hedgehog (SHH) au récepteur Patched1, ce qui entraîne une accumulation lissée au niveau de la membrane ciliaire et une activation de la voie SHH5. De telles interactions ligand-récepteur peuvent se produire par signalisation autocrine, paracrine et / ou juxtacrine dans des contextes craniofaciaux. Par exemple, BMP6 est connu pour signaler de manière autocrinale lors de la différenciation des chondrocytes6, tandis que le facteur de croissance des fibroblastes (FGF) 8 est exprimé dans l’ectoderme de l’arc pharyngé et se lie aux membres de la famille FGF des RTK exprimés dans le mésenchyme de l’arc pharyngé de manière paracrine pour initier le modelage et l’excroissance des arcs pharyngés7, 8,9,10. En outre, la signalisation Notch est activée dans les chondrocytes et les ostéoblastes pendant le développement du squelette craniofacial par la signalisation juxtacrine lorsque les ligands transmembranaires Delta et / ou Jagged se lient aux récepteurs Transmembranaires Notch sur les cellules voisines, qui sont ensuite clivés et phosphorylés11. Cependant, il existe d’autres paires de ligands et de récepteurs importantes pour le développement craniofacial qui ont la flexibilité de fonctionner à la fois dans la signalisation autocrine et paracrine. À titre d’exemple, au cours de la morphogenèse des dents murines, il a été démontré que le ligand PDGF)-AA du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGF)-AA signale de manière autocririne pour activer le RTK PDGFRα dans l’épithélium12 de l’organe de l’émail. En revanche, dans les processus faciaux murins au milieu de la gestation, les transcriptions codant pour les ligands PDGF-AA et PDGF-CC sont exprimées dans l’ectoderme craniofacial, tandis que le récepteur PDGFRα est exprimé dans le mésenchyme dérivé de la crête neurale crânienne sous-jacente, ce qui entraîne une signalisation paracrine 13,14,15,16,17 . Quel que soit le mécanisme de signalisation, ces événements de phosphorylation des récepteurs entraînent souvent le recrutement de protéines adaptatrices et/ou de molécules de signalisation, qui se phosphorylent fréquemment elles-mêmes pour initier des cascades de kinases intracellulaires telles que la voiemapk(e) de la protéine kinase activée par le mitogène (MAPK) 18,19.
Les effecteurs intracellulaires terminaux de ces cascades peuvent alors phosphoryler un ensemble de substrats, tels que les facteurs de transcription, la liaison à l’ARN, les protéines de matrice cytosquelettique et extracellulaire. Runx220, Hand121, Dlx3/5 22,23,24, Gli1-3 25 et Sox926 font partie des facteurs de transcription phosphorylés dans le contexte du développement craniofacial. Cette modification post-traductionnelle (PTM) peut affecter directement la susceptibilité aux PTM alternatifs, la dimérisation, la stabilité, le clivage et/ou l’affinité de liaison à l’ADN, entre autres activités 20,21,25,26. De plus, la protéine de liaison à l’ARN Srsf3 est phosphorylée dans le contexte du développement craniofacial, ce qui conduit à sa translocation nucléaire27. En général, il a été démontré que la phosphorylation des protéines de liaison à l’ARN affecte leur localisation subcellulaire, les interactions protéine-protéine, la liaison à l’ARN et / ou la spécificité de la séquence28. En outre, la phosphorylation de l’actomyosine peut entraîner des réarrangements cytosquelettiques tout au long du développement craniofacial29,30, et la phosphorylation des protéines de la matrice extracellulaire, telles que les petites glycoprotéines liées à l’azote du ligand liant l’intégrine, contribue à la biominéralisation au cours du développement du squelette31. À travers ce qui précède et de nombreux autres exemples, il est évident qu’il existe de vastes implications pour la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial. En ajoutant un niveau supplémentaire de régulation, la phosphorylation des protéines est encore modulée par les phosphatases, qui contrecarrent les kinases en éliminant les groupes phosphate.
Ces événements de phosphorylation aux niveaux du récepteur et de la molécule effectrice sont essentiels pour la propagation des voies de signalisation et entraînent finalement des changements dans l’expression des gènes dans le noyau, entraînant des activités cellulaires spécifiques, telles que la migration, la prolifération, la survie et la différenciation, qui entraînent une formation correcte du visage des mammifères. Compte tenu de la spécificité contextuelle des interactions protéiques avec les kinases et les phosphatases, des changements qui en résultent dans les PTM et de leurs effets sur l’activité cellulaire, il est essentiel que ces paramètres soient étudiés dans un cadre physiologiquement pertinent pour acquérir une compréhension complète de la contribution des événements de phosphorylation au développement craniofacial. Ici, des exemples de deux contextes dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines et, par conséquent, l’activation des voies de signalisation au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymes palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5 - à la fois primaires32 et immortalisées33 . À E11.5, les processus maxillaires sont en train de fusionner avec les processus nasaux latéraux et médiaux1, représentant ainsi un point temporel critique pendant le développement craniofacial de la souris. En outre, les processus maxillaires et les cellules dérivées des plateaux palataux ont été choisis ici parce que ces dernières structures sont des dérivés de la première, offrant ainsi aux chercheurs la possibilité d’interroger la phosphorylation des protéines in vivo et in vitro dans des contextes connexes. Cependant, ce protocole est également applicable aux processus faciaux alternatifs et aux points temporels de développement.
Un problème critique dans l’étude des protéines phosphorylées est qu’elles sont facilement déphosphorylées lors de l’isolement des protéines par des phosphatases environnementales abondantes. Pour surmonter cette barrière, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des protéines phosphorylées sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des protéines phosphorylées. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses voies de signalisation actives au cours du développement craniofacial.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bloc pour mini bain sec</td><td>Research Products International Corp</td><td>400783</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie ChemiDoc XRS+ avec logiciel Image Lab</td><td>Bio-Rad</td><td>1708265</td><td>imageur de chimiluminescence</td></tr><tr><td>CO2, incubateur</td><td>VWR</td><td>10810-902</td><td></td></tr><tr><td> panneau, 11 x 13 po</td><td>Fisher Scientific</td><td>09 002 12</td><td></td></tr><tr><td>Cellule d’électrophorèse, 4 gels, pour mini-gels préfabriqués avec mini module trans-blot</td><td>Bio-Rad</td><td>1658030</td> Four d’hybridation Fisher Scientific UVP95003001 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse 5415 D avec rotor F45-24-11 (Eppendorf)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Z604062</td><td></td></tr><tr><td>Mini bain sec</td><td>Produits de recherche International Corp</td><td>400780</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur orbital</td><td>VWR</td><td>89032-092</td><td></td></tr><tr><td>PH-mètre</td><td>VWR</td><td>89231-662</td><td></td></tr><tr><td>Alimentation pour SDS-PAGE</td><td>Bio-Rad</td><td>1645050</td><td></td></tr><tr><td>Bac à glace rectangulaire, maxi 9 L</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-093</td><td></td></tr><tr><td>Stemi 508 Stéréomicroscope avec support K LAB, LED éclairage annulaire</td><td>Zeiss</td><td>4350649020000000</td><td>microscope de dissection</td></tr><tr><td>Timer</td><td>VWR</td><td>62344-641</td><td></td></tr><tr><td>Revolver à tube</td><td>Fisher Scientific</td><td>11 676 341</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur vortex</td><td>Fisher Scientific</td><td>02 215 414</td><td></td></tr><tr><td>Bain-marie</td><td>VWR</td><td>89501-472</td><td></td></tr><tr><td>Boîte à transfert western</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9358182</td><td></td></tr><tr><td> MatériauxBoîtes de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>culture cellulaire, 6 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-565-95</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de culture cellulaire, 12 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>Élévateurs de cellules</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-100-240</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD USP50</td><td></td></tr><tr><td>Tubes coniques, polypropylène, 50 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-539-13</td><td></td></tr><tr><td>Pince fine Dumont #5</td><td>Outils de science fine</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Cuillère à embryon</td><td>Outils de science fine</td><td>10370-17</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, 0,5 mL</td><td>VWR</td><td>89000-010</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation, 1,5 mL</td><td>VWR</td><td>20170-038</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur, 5,75"</td><td>Fisher Pipette Scientific</td><td>13-678-6A</td><td></td></tr><tr><td>Pasteur, 9"</td><td>VWR</td><td>14672-380</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, 10 cm</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-757-100D</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri, 35 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875711YZ</td><td></td></tr><tr><td>Sachets, transparents, doublure en polyéthylène</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-25B</td><td></td></tr><tr><td>Membrane PVDF</td><td>Fisher </td><td>Scientific IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Pince Semken</td><td>Fine Science Tools</td><td>11008-13</td><td></td></tr><tr><td>Petite poire en latex, 2 mL</td><td>VWR</td><td>82024-554</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux</td><td>Fine Science Tools</td><td>14002-12</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à seringue, 25 mm, 0.2 &mu ; taille des pores</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-740-108</td><td></td></tr><tr><td>Seringue avec embout Luer, 10 mL</td><td>VWR</td><td>BD309604</td><td></td></tr><tr><td>Pipette de transfert</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-22</td><td></td></tr><tr><td>Levier d’ouverture de la cassette Western blot</td><td>Bio-Rad</td><td>4560000</td><td></td></tr><tr><td>Papier de chromatographie Whatmann 3MM chr</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-714-5</td><td></td></tr><tr><td> Réactifs </forts></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-15 % Gels de protéines préfabriquées, 10 puits, 30 & micro ; L</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>&beta ;-glycérophosphate hydrate de sel disodique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G5422-25G</td><td>concentration de stock 1 M</td></tr><tr><td>&beta ;-mercaptoéthanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine, fraction V, testée contre les chocs thermiques</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>AC403140050</tr><tr><td>Cocktail complet de mini-inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11836153001</td><td>concentration en stock 25x</td></tr><tr><td>DC kit de dosage des protéines II</td><td>Bio-Rad</td><td>500-0112</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, haute teneur en glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>E7, anticorps primaire monoclonal bêta-tubuline de souris, concentré 0,1 mL</td><td>Études de développement Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1:1 000</td></tr><tr><td>Substrat de transfert western ECL</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI32106</td><td>faible plage de picogrammes</td></tr><tr><td>Substrat de transfert western ECL</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-302B</td><td>à faible plage de femtogramme</td></tr><tr><td>Tampon d’électrophorèse, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610772</td><td>concentration de stock 10x</td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof, 1 gallon</td><td>Decon Laboratories, Inc.</td><td>2705HC</td><td>EtOH</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique, sel Di Na dihydrique. (Powd. cristallin/Électrophore.)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP120-500</td><td>EDTA</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin, caractérisé, origine américaine, 500 mL</td><td>HyClone</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol (certifié ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>G33-4</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps secondaire conjugué HRP, chèvre anti-souris</td><td>IgG Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>115-035-146</td><td>1:20 000</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire conjugué HRP, chèvre anti-lapin IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-003</td><td>1:20 000</td></tr><tr><td>Solution d’acide chlorhydrique, 6N (certifié)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SA56-500</td><td>HCl</td></tr><tr><td>Igepal Ca - 630 détergent non ionique</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN19859650</td><td>Nonidet P-40</td></tr><tr><td>Isopropanol (HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451-1</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Gibco</td><td>25030081</td><td>concentration de stock 200 mM</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td></td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorps primaire</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9102S</td><td>1:1 000 ; anti-Erk1/2</td></tr><tr><td>PDGF-BB ligand recombinant, rat</td><td>Fisher Scientific</td><td>520BB050</td><td></td></tr><tr><td>Récepteur PDGF &bêta ; anticorps primaire</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>3169S</td><td>1:1 000</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>concentration de stock 100 U/mL, 100 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de fluorure de phénylméthanesulfonyle, 99 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC215740100</td><td>PMSF ; concentration de stock 100 mM</td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) anticorps primaire</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>9101S</td><td>1:1 000, anti-phospho-Erk1/2</td></tr><tr><td>Récepteur phospho-PDGF et alpha ; /Récepteur PDGF &bêta ; anticorps primaire</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>3170S</td><td>1:1 000</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium (cristaux blancs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td>KCl</td></tr><tr><td>Phosphate de potassium monobasique (cristaux blancs)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-500</td><td>KH2PO4</td></tr><tr><td>SDS solution, 10 %</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (cristallin/biologique, certifié)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S671-3</td><td>NaCl</td></tr><tr><td>Fluorure de sodium (poudre/certifié ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S299-100</td><td>NaF ; aliquote à usage unique ; concentration de la matière 1 M</td></tr><tr><td>Orthovanadate de sodium, 99 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC205330500</td><td>Na3VO4 ; concentration de la matière 100 mM</td></tr><tr><td>Phosphate dibasique de sodium anhydre (granulaire ou en poudre/certifié ACS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>Na2HPO4</td></tr><tr><td>Culture tissulaire PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de transfert, 5 L</td><td>Bio-Rad</td><td>1610771</td> concentration de stock <td>10x</td></tr><tr><td>base Tris (cristaux blancs ou poudre cristalline/biologie moléculaire)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine</td><td>BioWorld</td><td>21560033</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur de poids moléculaire par transfert Western</td><td>Bio-Rad</td><td>1610374</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software</td><td>National Institutes of Health</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Animals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Female 129S4</td><td></td> <td>souris</td><td>don du Dr Philippe Soriano, École de médecine Icahn au Mont Sinaï</td></tr></tbody></table>

isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines

Isolation of Whole Cell Protein Lysates from Mouse Facial Processes and Cultured Palatal Mesenchyme Cells for Phosphoprotein Analysis

Le développement craniofacial des mammifères est un processus morphologique complexe au cours duquel plusieurs populations cellulaires se coordonnent pour générer le squelette frontonasal. Ces changements morphologiques sont initiés et maintenus par diverses interactions de signalisation, qui incluent souvent la phosphorylation des protéines par les kinases. Ici, deux exemples de contextes physiologiquement pertinents dans lesquels étudier la phosphorylation des protéines au cours du développement craniofacial des mammifères sont fournis: les processus faciaux de souris, en particulier les processus maxillaires E11.5, et les cellules mésenchymates palatales embryonnaires de souris cultivées dérivées de plateaux palataux secondaires E13.5. Pour surmonter la barrière commune de la déphosphorylation lors de l’isolement des protéines, les adaptations et les modifications apportées aux méthodes de laboratoire standard qui permettent l’isolement des phosphoprotéines sont discutées. De plus, des pratiques exemplaires sont fournies pour l’analyse et la quantification appropriées des phosphoprotéines après le transfert western des lysats de protéines de cellules entières. Ces techniques, en particulier en combinaison avec des inhibiteurs pharmacologiques et / ou des modèles génétiques murins, peuvent être utilisées pour mieux comprendre la dynamique et les rôles de diverses phosphoprotéines actives au cours du développement craniofacial.

Lorsque l’on tente de caractériser la phosphorylation de protéines isolées à partir de processus faciaux de souris et/ou de cellules de mésenchyme palatales cultivées, les résultats représentatifs révéleront idéalement une bande distincte et reproductible après un transfert western avec un anticorps anti-phosphoprotéine qui se situe à la hauteur ou près de la hauteur de la bande protéique totale correspondante (Figure 3 ). Cependant, si une phosphorylation étendue de la protéine se produit, ...

Le protocole présente une méthode pour isoler les lysats de protéines de cellules entières des processus faciaux d’embryons de souris disséqués ou de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires de souris cultivées et effectuer un transfert occidental ultérieur pour évaluer les niveaux de protéines phosphorylées.

Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines

Mammalian craniofacial development is a complex morphological process during which multiple cell populations coordinate to generate the frontonasal ...

Ce protocole peut être utilisé pour mieux comprendre la dynamique et les rôles des phosphoprotéines actives au cours du développement craniofacial des mammifères. Ce protocole surmonte la barrière commune de la déphosphorylation lors de l’isolement des protéines à partir de deux contextes physiologiquement pertinents, les processus faciaux de souris et les cellules de mésenchyme palatale embryonnaire de souris cultivées. Il est impératif d’agir rapidement tout en gardant tous les réactifs et matériaux sur la glace et d’utiliser des inhibiteurs de phosphatase dans tous les tampons de lyse pour maintenir l’intégrité des protéines phosphorylées.Pour commencer, posez le corps de la souris sur une planche de dissection avec le côté ventral tourné vers le haut et vaporisez l’abdomen de la souris avec de l’éthanol à 70%. Ouvrez ensuite la cavité abdominale en pinçant et en soulevant la peau antérieure à l’ouverture vaginale avec une pince Semken droite. Ensuite, coupez la peau soulevée en couches sous-jacentes avec des ciseaux chirurgicaux à lame droite à un angle de 45 degrés de chaque côté pour générer une forme en V qui s’étend à chaque surface latérale à peu près à mi-chemin entre les quatre membres et les membres postérieurs.À l’aide de la pince Semken, saisissez l’une des cornes utérines et coupez sous l’oviducte et au-dessus du col de l’utérus avec des ciseaux chirurgicaux. Pour permettre l’élimination complète de la corne utérine, coupez le mésomètre, puis transférez la corne utérine disséquée à 10 millilitres de PBS histologique dans une boîte de Petri de 10 centimètres. De même, retirez la deuxième corne utérine du côté opposé de la cavité abdominale.Ensuite, placez la boîte de Petri de 10 centimètres contenant les deux cornes utérines sur de la glace. Sous un stéréomicroscope disséquant, disséquez soigneusement chaque embryon des cornes utérines avec une pince fine Dumont 5. Ensuite, retirez lentement le myomètre, la décidua et le chorion.Ensuite, déchirez et retirez l’amnion relativement transparent entourant l’embryon et coupez le cordon ombilical reliant l’embryon au placenta. Ensuite, transférez chaque embryon disséqué à 2,5 millilitres de PBS histologique dans un puits individuel d’une plaque de culture cellulaire de 12 puits sur glace à l’aide d’un tuyau de transfert en plastique coupé. Préparez trois boîtes de Petri de 10 centimètres contenant 10 millilitres de PBS histologique et conservez-les sur de la glace pour les utiliser en rotation entre les embryons.Ensuite, transférez un embryon d’un puits individuel de la plaque de culture cellulaire de 12 puits à l’une des boîtes de Petri de 10 centimètres avec l’histologie PBS sur glace à l’aide d’une pipette de transfert en plastique coupée. Sous le microscope à dissection, séparez chaque processus maxillaire du visage à l’aide de la pince fine en faisant d’abord une coupe sur le côté antérieur d’un processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus nasal latéral dans le processus maxillaire. Ensuite, coupez la face postérieure du processus maxillaire le long de l’indentation naturelle séparant le processus maxillaire et le processus mandibulaire.Ensuite, séparez complètement le processus maxillaire en faisant une coupe verticale des côtés antérieur à postérieur du processus maxillaire du côté oculaire du processus maxillaire où les indentations naturelles référencées ci-dessus se terminent. À l’aide d’une pipette Pasteur de neuf pouces avec une petite ampoule en latex de deux millilitres, transférez la paire disséquée de processus maxillaires dans une petite gouttelette d’environ 30 microlitres de PBS histologique dans une boîte de Petri étiquetée de 35 millimètres sur de la glace. Transférez ensuite la paire de tissus maxillaires dans un tube de microcentrifugation marqué de 1,5 millilitre sur de la glace à l’aide de la pipette Pasteur, minimisant ainsi le transfert de PBS histologique.De plus, retirez tout excès de PBS histologique dans le tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec la pipette Pasteur. Ajouter 0,1 millilitre de tampon de lyse NP40 glacé avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase ajoutés immédiatement avant utilisation sur glace. Puis pipette de haut en bas 10 fois avec un PIPETMAN de 200 microlitres.Ensuite, vortexez pendant 10 secondes, puis pipetez de haut en bas 10 fois avec un PIPETMAN de 200 microlitres, tout en évitant la génération de bulles. Incuber à quatre degrés Celsius pendant deux heures tout en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 millilitre ou de deux millilitres avec un revolver à tube. Ensuite, centrifugez les échantillons à 13 500 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et collectez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur glace avec un PIPETMAN de 200 millilitres.Tout d’abord, aspirez le milieu des cellules de mésenchyme palatal embryonnaire de souris à l’aide d’une pipette Pasteur de 5,75 pouces fixée à un système de vide. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS de culture tissulaire glacé et inclinez la plaque sur le côté lors du dernier lavage pour vous assurer que tout le PBS de culture tissulaire est aspiré. Ensuite, ajoutez un tampon de lyse NP40 glacé avec des inhibiteurs de protéase et de phosphatase ajoutés immédiatement avant l’utilisation sur la glace pour lyser les cellules.Incuber la plaque sur de la glace pendant cinq minutes avec une rotation d’environ toutes les minutes pour assurer une couverture complète de la plaque. Ensuite, grattez les cellules de la plaque à l’aide d’un élévateur de cellules pré-refroidi et transférez la suspension cellulaire dans un tube de microcentrifuge pré-refroidi de 1,5 millilitre sur de la glace. Ensuite, incuber la suspension cellulaire à quatre degrés Celsius pendant 30 minutes tout en tournant bout à bout à l’aide d’une palette de 1,5 millilitre ou de deux millilitres avec un revolver à tube.Ensuite, centrifugez les échantillons à 13 500 x g pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius et collectez le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre sur glace avec un PIPETMAN de 200 millilitres. L’analyse par transfert western de lysats de cellules entières provenant de cellules palatines embryonnaires immortalisées de souris après stimulation par ligand PDFG-B de 2 à 15 minutes a révélé des bandes reproductibles distinctes pour les phosphoprotéines qui courent à la hauteur ou près de la hauteur de la bande protéique totale correspondante. Une augmentation de l’intensité de la bande des phosphoprotéines a été observée lors du traitement avec un facteur de croissance par rapport à celles des cellules non traitées, tandis que les intensités totales de la bande protéique étaient relativement égales entre les échantillons.Ce protocole peut être utilisé pour sonder comment les perturbations et la phosphorylation influencent directement la signalisation intercellulaire, l’expression des gènes et l’activité cellulaire dans des contextes craniofaciaux.

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Research

Recherche

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Isolement et coloration des kératinocytes de peau de souris pour l'analyse spécifique de cycle cellulaire de l'expression cellulaire de protéine par cytométrie de masse

Nous présentons un protocole d’isolement et de culture de cellules mésenchymateuses palatales embryonnaires primaires de souris pour l’imagerie en accéléré de la croissance bidimensionnelle (2D) et des tests de réparation des plaies. Nous fournissons également la méthodologie d’analyse des données d’imagerie time-lapse afin de déterminer la formation de flux cellulaire et la motilité directionnelle.

Isolement et imagerie en accéléré de cellules de mésenchyme palatales embryonnaires primaires de souris pour analyser les attributs de mouvement collectif

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de kératinocytes oraux dérivés du palais de souris adulte. Une méthode d’évaluation utilisant l’immunocoloration est également rapportée.

Isolement et culture de kératinocytes oraux primaires du palais de souris adulte

Ce protocole présente deux techniques pour isoler les compartiments subcellulaires des photorécepteurs de bâtonnets murins pour l’analyse des protéines. La première méthode utilise de la rétine vivante et du papier filtre de cellulose pour séparer les segments extérieurs des tiges, tandis que la seconde utilise de la rétine lyophilisée et du ruban adhésif pour décoller les couches internes et externes des segments.

Deux méthodes de peeling pour l’isolement des compartiments des cellules photoréceptrices dans la rétine de la souris pour l’analyse des protéines

Le présent protocole décrit la préparation des échantillons et l’analyse des données pour quantifier la phosphorylation des protéines à l’aide d’un test amélioré d’extraction à molécule unique (SiMPull).

Un test de traction optimisé à molécule unique pour la quantification de la phosphorylation des protéines

Nous présentons ici un protocole pour l’enrichissement des phosphoprotéines phosphatases endogènes et de leurs protéines en interaction à partir de cellules et de tissus et leur identification et quantification par spectrométrie de masse protéomique.

Une approche basée sur la spectrométrie de masse pour identifier les phosphoprotéines phosphatases et leurs interacteurs

Découvrez l'isolement de lysats protéiques de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales pour l'analyse des phosphoprotéines. Cette méthode préserve l'état de phosphorylation des protéines.

Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines (Vidéo) | JoVE Journal

Isolement des lysats de protéines de cellules entières à partir de processus faciaux de souris et de cellules de mésenchyme palatales cultivées pour l’analyse des phosphoprotéines

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