Name: Isolement du virus associé aux moustiques à partir de moustiques collectés sur le terrain (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-31T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Apprenez l'isolation de virus associés aux moustiques à partir d'échantillons de terrain en utilisant des lignées cellulaires Aedes albopictus et BHK-21. Cette méthode sécurisée permet d'étudier les arboviroses sans expérimentation animale.

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Ce travail a été soutenu par le projet de plan scientifique et technologique de Wuhan (2018201261638501).

1. Échantillonnage et tri des moustiques
<ol><li>Piègez les moustiques adultes à travers les pièges lumineux MXA-02 ou les pièges à moustiques au dioxyde de carbone sur le terrain.</li>
	<li>Tuez les moustiques collectés en trempant dans de l’azote liquide10,11. Les transporter au laboratoire par le système logistique de la chaîne du froid12. NOTE: La glace sèche était principalement utilisée dans le système logistique de la chaîne du froid.</li>
	<li>(Facultatif) Si les sites d’échantillonnage se trouvaient à proximité du laboratoire, envoyer directement les moustiques vivants dans les pièges à moustiquaires au laboratoire et les euthanasier par congélation à ≤-20 °C pendant 30 min4.</li>
	<li>Faire une identification morphologique des moustiques collectés grâce au manueld’outils 13 pour la classification et l’identification des moustiques. NOTE: Si nécessaire, le codage à barres ADN pourrait être utilisé pour classer et identifier les moustiques14,15.</li>
	<li>En fonction des dates d’échantillonnage et des sites, répartissez-les dans différents bassins, puis stockez-les dans des tubes de 2 à 5 mL.</li>
	<li>Dessinez un tableau pour enregistrer chaque tube avec les espèces de moustiques, le nombre, le code d’échantillonnage, la date et les sites.</li>
	<li>Imprimez les étiquettes avec les codes d’échantillonnage et fixez-les aux tubes.</li>
	<li>Conserver les tubes contenant les échantillons de moustiques à -80 °C jusqu’à une analyse plus approfondie.</li>
</ol>2. Broyage des moustiques
<ol><li>Placer 20 à 50 moustiques dans chaque tube stérile de 2 ml avec des billes de céramique de 3 mm contenant 1,5 ml de milieu du Roswell Park Memorial Institute (RPMI) contenant 2 % de solution de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B. REMARQUE: Gardez les tubes sur de la glace ou sur un plateau d’anice.</li>
	<li>Homogénéiser les moustiques avec un homogénéisateur tissulaire à basse température en broyant pendant 30 s à 70 Hz à 4 °C pendant trois cycles16.</li>
	<li>Centrifuger les mélanges à 15 000 × g pendant 30 min à 4 °C et transférer les surnageants dans de nouveaux tubes.</li>
	<li>Centrifuger à nouveau les surnageants à 15 000 × g pendant 10 min à 4 °C pour éliminer les débris de moustiques12,17. NOTE: Si nécessaire, les surnageants peuvent être filtrés à l’aide de filtres de 0,22 μm.</li>
	<li>Aliquote des surnageants (P0) dans des tubes de stockage à bouchon à vis de 2 mL (200 μL par tube) et les stocker à -80 °C.</li>
</ol>3. Préparation des cellules et du milieu de maintenance de la culture cellulaire
NOTE: La lignée cellulaire de moustique C6/36 (déficiente en ARNi d’Aedes albopictus ) et la lignée cellulaire de vertébrés BHK-21 (rein de bébé hamster) ont été utilisées pour l’amplification et l’isolement du virus.
<ol><li>Inoculer 1 × 106 cellules en C6/36 dans une fiole de 75 cm 2 contenant 10 ml de milieu RPMI additionné de sérum fœtal bovin (FBS) à 10 % et de 1 % de pénicilline/streptomycine (P/S) à 28 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2.</li>
	<li>Inoculer 1 × 106 cellules BHK-21 dans une fiole de 75 cm 2 avec 10 mL de milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco complété par 10 % de FBS et 1 % P/S à 37 °C dans un incubateur humidifié à 5 % de CO2. NOTE: Les cellules ont été passées deux ou trois fois par semaine17,18.</li>
	<li>Ensemencer les cellules cultivées dans une fiole de 75cm2 (cellules C6/36 ou BHK-21) dans les plaques à 24 puits (C6/36 par puits: 1,4 × 105; BHK-21 par puits: 0,8 × 105).</li>
	<li>Placez les plaques à 24 puits à 28 °C ou 37 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Observez les cellules au microscope et confirmez si la confluence cellulaire dans chaque puits est de 80% à 90%.</li>
	<li>Préparer le milieu de maintien de la culture cellulaire (500 mL). NOTE: Pour C6/36, le milieu était RPMI complété par 2% FBS et 2% Penicilline-Streptomycin-Amphotéricine B Solution. Pour BHK-21, le milieu était DMEM complété par 2% FBS et 2% Penicilline-Streptomycin-Amphotéricine B Solution.</li>
</ol>4. Isolement du virus
REMARQUE : Toutes les étapes ont été effectuées dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 (BSL-2). L’exigence de niveau de sécurité du laboratoire de biosécurité a été déterminée par l’évaluation des risques de biosécurité basée sur les réglementations de différents pays et régions. Le processus doit être effectué dans une enceinte de biosécurité.
<ol><li>Retirer le milieu de culture cellulaire des plaques de 24 puits et ajouter 100 μL du milieu de maintien de la culture cellulaire et 100 μL du surnageant de l’homogénat de moustiques (P0) à chaque puits.</li>
	<li>Incuber les plaques à 28 °C ou 37 °C pendant 60 min et les agiter doucement toutes les 15 minutes pour éviter le dessèchement cellulaire.</li>
	<li>Retirer le surnageant et rincer chaque puits doucement avec 600 μL de milieu de maintien de culture cellulaire pour éliminer complètement les débris.</li>
	<li>Ajouter 800 μL de milieu de maintien de culture cellulaire à chaque puits et conserver les plaques dans un incubateur humidifié à 5% de CO2 à 28 °C ou 37 °C pendant 7 jours.</li>
	<li>Surveiller quotidiennement l’état cellulaire de chaque puits au microscope15.</li>
	<li>Recueillir les surnageants des cellules (surnageants P1) le 7ème jour et stocker les surnageants à -80 °C.</li>
	<li>Répétez les étapes 4.1-4.6 2x pour obtenir les surnageants P2 et P3. REMARQUE : À l’étape 4.3, le rinçage de chaque puits avec 600 μL de milieu de maintenance de culture cellulaire était facultatif pour les P2 et P3.</li>
	<li>Selon le puits qui montre l’effet cytopathogène (CPE) - les cellules meurent, pyknose et se détachent de la surface; fusion avec des cellules adjacentes pour former une syncytie; ou l’apparition de corps d’inclusion nucléaires ou cytoplasmiques — ajouter 300 à 400 μL du surnageant de ce puits CPE dans chaque puits des nouvelles plaques à 6 puits contenant des cellules (la confluence cellulaire était de 80% à 90%) pour amplifier considérablement les virus.</li>
	<li>Recueillir les surnageants et les aliquotes dans des tubes de stockage à bouchon à vis de 2 mL (500 μL par tube). Conservez-les à -80 °C. NOTE: Après trois générations de passages successifs dans les cellules, les échantillons qui n’ont pas induit de CPE ont été jetés. Si nécessaire, les générations de passage successifs dans les cellules peuvent être augmentées.</li>
</ol>5. Détection des séquences virales par RT-PCR
<ol><li>Extraire l’ARN total de 200 μL du surnageant viral à l’aide d’un mini kit d’ARN viral16. REMARQUE: Ici, un système automatisé d’extraction d’acide nucléique a été utilisé pour extraire l’ARN total en suivant les instructions du fabricant de l’instrument.</li>
	<li>Convertissez l’ARN en ADNc en suivant les instructions du kit RT-PCR à l’aide d’un instrument de PCR.<ol><li>Ajouter 15 μL d’ARN mélangé avec 1 μL d’amorces aléatoires dans le tube de PCR. Placez le tube à 70 °C pendant 5 min, puis placez-le sur la glace pendant 5 min.</li>
		<li>Ajouter 5 μL de tampon 5x et 25 μL de mélange (10 mM de dNTP, 40 U/μL d’inhibiteur de RNase et 200 U/μL DE M-MLV) dans le tube et placer le tube à 42 °C pendant 60 min et à 95 °C pendant 10 min.</li>
		<li>Conserver le tube à -20 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Utilisez un kit de PCR et des amorces universelles (Tableau 1) pour détecter les virus par PCR.<ol><li>Pour les arbovirus, mettre en place le système de réaction PCR (total 30 μL) avec les composants suivants : 3 μL de tampon Taq 10x, 3 μL de dNTP (1mM), 1 μL d’amorce directe (10 μm), 1 μL d’amorce inverse (10 μm), 0,3 μL de Taq (10 U/μL), 19,7 μL deddH2Oet 2 μL d’ADNc.</li>
		<li>Pour la détection des flavivirus, configurer le processus de réaction comme suit: stade 1: 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 52 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s; étape 2: 72 °C pendant 10 min.</li>
		<li>Pour la détection des alphavirus, configurer le processus de réaction comme suit: stade 1: 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 50 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s; étape 2: 72 °C pendant 10 min.</li>
		<li>Pour la détection des bunyavirus, configurer le processus de réaction comme suit: stade 1: 35 cycles de 94 °C pendant 30 s, 50 °C pendant 30 s et 72 °C pendant 30 s; étape 2: 72 °C pendant 10 min.</li>
	</ol></li>
	<li>Détecter les produits d’amplification PCR par électrophorèse sur gel d’agarose à 1% et les envoyer pour analyse de séquençage. NOTE: Si les conditions le permettent, les surnageants peuvent subir une analyse de séquençage de nouvelle génération pour identifier les nouveaux virus et obtenir l’ensemble des séquences du génome viral.</li>
</ol>

<ol><li>Xia, H., Wang, Y., Atoni, E., Zhang, B., Yuan, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-associated+viruses+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Mosquito-associated viruses in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 5-20 (2018).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+dataset+of+distribution+and+diversity+of+mosquito-associated+viruses+and+their+mosquito+vectors+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Data%22%5BJournal%5D)">A dataset of distribution and diversity of mosquito-associated viruses and their mosquito vectors in China.</a> Scientific Data. 7 (1), 342(2020).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+discovery+and+global+distribution+of+novel+mosquito-associated+viruses+in+the+last+decade+%282007-2017%29%5BTitle%5D)+AND+%22Reviews+in+Medical+Virology%22%5BJournal%5D)">The discovery and global distribution of novel mosquito-associated viruses in the last decade (2007-2017).</a> Reviews in Medical Virology. 29 (6), 2079(2019).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+metagenomic+profiling+of+viromes+associated+with+four+common+mosquito+species+in+China%5BTitle%5D)+AND+%22Virologica+Sinica%22%5BJournal%5D)">Comparative metagenomic profiling of viromes associated with four common mosquito species in China.</a> Virologica Sinica. 33 (1), 59-66 (2018).</li>
<li>Ong, O. T. W., Skinner, E. B., Johnson, B. J., Old, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-borne+viruses+and+non-human+vertebrates+in+Australia%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Mosquito-borne viruses and non-human vertebrates in Australia: A review.</a> Viruses. 13 (2), 265(2021).</li>
<li>Agboli, E., Leggewie, M., Altinli, M., Schnettler, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-specific+viruses-transmission+and+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Mosquito-specific viruses-transmission and interaction.</a> Viruses. 11 (9), 873(2019).</li>
<li>Halbach, R., Junglen, S., van Rij, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosquito-specific+and+mosquito-borne+viruses%3A+evolution%2C+infection%2C+and+host+defense%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Mosquito-specific and mosquito-borne viruses: evolution, infection, and host defense.</a> Current Opinion in Insect Science. 22, 16-27 (2017).</li>
<li>Bolling, B. G., Olea-Popelka, F. J., Eisen, L., Moore, C. G., Blair, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+dynamics+of+an+insect-specific+flavivirus+in+a+naturally+infected+Culex+pipiens+laboratory+colony+and+effects+of+co-infection+on+vector+competence+for+West+Nile+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Transmission dynamics of an insect-specific flavivirus in a naturally infected Culex pipiens laboratory colony and effects of co-infection on vector competence for West Nile virus.</a> Virology. 427 (2), 90-97 (2012).</li>
<li>Baidaliuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-fusing+agent+virus+reduces+arbovirus+dissemination+in+Aedes+aegypti+mosquitoes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">Cell-fusing agent virus reduces arbovirus dissemination in Aedes aegypti mosquitoes in vivo.</a> Journal of Virology. 93 (18), 00715-00719 (2019).</li>
<li>Atoni, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metagenomic+virome+analysis+of+Culex+mosquitoes+from+Kenya+and+China%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Metagenomic virome analysis of Culex mosquitoes from Kenya and China.</a> Viruses. 10 (1), 30(2018).</li>
<li>Xia, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((First+isolation+and+characterization+of+a+group+C+Banna+virus+%28BAV%29+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Hubei%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">First isolation and characterization of a group C Banna virus (BAV) from Anopheles sinensis mosquitoes in Hubei, China.</a> Viruses. 10 (10), 555(2018).</li>
<li>Shi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stability+of+the+virome+in+lab-+and+field-collected+Aedes+albopictus+mosquitoes+across+different+developmental+stages+and+possible+core+viruses+in+the+publicly+available+virome+data+of+Aedes+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22mSystems%22%5BJournal%5D)">Stability of the virome in lab- and field-collected Aedes albopictus mosquitoes across different developmental stages and possible core viruses in the publicly available virome data of Aedes mosquitoes.</a> mSystems. 5 (5), 00640(2020).</li>
<li>Zhou, M., Chu, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aZhou%2C+M+%22Handbook+for+Classification+and+Identification+of+Main+Vectors%22">Handbook for Classification and Identification of Main Vectors</a>. , Suzhou University Press. (2019).</li>
<li>Wang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+the+main+mosquito+species+in+China+based+on+DNA+barcoding%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Identifying the main mosquito species in China based on DNA barcoding.</a> Plos One. 7 (10), (2012).</li>
<li>Ratnasingham, S., Hebert, P. D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bold%3A+The+Barcode+of+Life+Data+System+%28www.barcodinglife.org%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology+Notes%22%5BJournal%5D)">Bold: The Barcode of Life Data System (www.barcodinglife.org).</a> Molecular Ecology Notes. 7 (3), 355-364 (2007).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+characterization+of+a+new+strain+of+mosquito+Flavivirus+derived+from+Culicoides%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo characterization of a new strain of mosquito Flavivirus derived from Culicoides.</a> Viruses. 14 (6), 1298(2022).</li>
<li>Zhao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+Tanay+virus+isolated+from+Anopheles+sinensis+mosquitoes+in+Yunnan%2C+China%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel Tanay virus isolated from Anopheles sinensis mosquitoes in Yunnan, China.</a> Frontiers in Microbiology. 10, 1963(1963).</li>
<li>Ren, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+novel+reassortment+Tibet+orbivirus+isolated+from+Culicoides+spp.+in+Yunnan%2C+PR+China%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Virology%22%5BJournal%5D)">Characterization of a novel reassortment Tibet orbivirus isolated from Culicoides spp. in Yunnan, PR China.</a> Journal of General Virology. 102 (9), 001645(2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’objectif de cette méthode était d’offrir un moyen pratique d’isoler les virus associés aux moustiques à l’aide de diverses lignées cellulaires. Il est essentiel d’ajouter l’antibiotique-antimycotique (pénicilline-streptomycine-amphotéricine) aux surnageants des homogénats de moustiques pour éviter la contamination par des bactéries ou des champignons. Les moustiques et les surnageants viraux obtenus sur le terrain doivent être réfrigérés à -80 °C pour éviter les cycles répétés de gel-dégel.
...

Les moustiques sont un groupe d’arthropodes vecteurs pathogènes importants. Il existe environ 3 500 espèces de moustiques dans la famille Culicidae 1,2. Le développement de technologies de séquençage à haut débit a conduit à la découverte de nombreuses séquences nouvelles ressemblant à des virus chez des moustiques de différentes parties du monde3. En général, ces virus associés aux moustiques peuvent être classés en deux groupes principaux : les MBV et les MSV.
Les MBV sont un groupe de virus divers qui sont les agents responsables de nombreuses maladies humaines ou animales, telles que le virus de la fièvre jaune (YFV), le virus de la dengue (DENV), le virus de l’encéphalite japonaise (JEV), le virus du Nil occidental (WNV) et le virus de la fièvre de la vallée du Rift (RVFV)4. Ils ont gravement menacé la santé publique en provoquant une morbidité et une mortalité graves chez les humains et les animaux à travers le monde. Les MBV entretiennent naturellement un cycle de vie entre divers hôtes par transmission d’un moustique infecté à un hôte naïf, ainsi que d’un hôte infecté par le virus et à un moustique nourricier5. Par conséquent, ces virus peuvent infecter à la fois les lignées cellulaires de moustiques et les lignées cellulaires de vertébrés en laboratoire1.
Les VHS, qui comprennent le virus Yichang (YCN), le flavivirus Culex (CxFV) et le virus Chaoyang (CHAOV), sont un sous-groupe de virus spécifiques aux insectes 1,6,7. Au cours des dernières années, il y a eu une augmentation de la découverte de nouveaux VHS, et certains de ces VHS ont eu un impact sur la transmission des MBV. Par exemple, le CxFV, qui peut être une infection persistante chez Culex pipiens, pourrait supprimer la réplication du VNO à un stade précoce8. Un autre flavivirus spécifique à un insecte, le virus de l’agent de fusion cellulaire (CFAV), inhibe la propagation du DENV et du virus Zika (ZIKV) chez les moustiques Aedes aegypti 9. Ainsi, ce protocole est une approche utile pour isoler les virus associés aux moustiques et peut aider à poursuivre la recherche sur la distribution des agents pathogènes liés aux moustiques et le contrôle des maladies transmises par les moustiques.

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; Filtre à membrane m</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RB</td><td>Films polymères avec des indices de pores spécifiques. Pour éliminer les débris cellulaires et les bactéries.</td></tr><tr><td>Plaques à 24 puits</td><td>CORNING</td><td>3524</td><td>Récipients pour cellule</td></tr><tr><td>75 cm2 flacons</td><td>CORNING</td><td>430641</td><td>Récipients pour cellule</td></tr><tr><td>un tube stérile de 2 mL avec des billes</td><td></td><td></td><td></td>en céramique de 3 mm</tr><tr><td>Antibiotique-antimycosique</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>Antibiotique en milieu pour prévenir la contamination par des bactéries et des champignons</td></tr><tr><td>Acide nucléique automatisé système d’extraction</td><td>NanoMagBio</td><td>S-48</td><td></td></tr><tr><td>BHK-21</td><td>cellules Centre national de ressources sur les virus, Institut de virologie de Wuhan Centre national de ressources sur les</td><td></td><td></td></tr><tr>virus<td>C6/36</td>, <td>Institut de virologie</td><td></td><td></td>de Wuhan</tr><tr><td>Machine centrifuge</td><td>Himac</td><td>CF16RN</td><td>Instrument pour la centrifugation d’échantillons de moustiques</td></tr><tr><td>CO2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s milieu essentiel minimal (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td>milieu pour lignées cellulaires de vertébrés</td></tr><tr>Isolement du virus <td></td><td></td> du<td>lac Ebinur</td><td>Cu20-XJ</td></tr><tr><td>Sérum bovin à la feta (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td> Fournir une nutrition aux cellules</td></tr><tr><td>homogénéisateur de tissus à haute vitesse et à basse température</td><td>servicebio</td><td>KZ-III-F</td><td>Instrument de broyage</td></tr><tr><td>incubateur (28 &deg ; C)</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td>Instrument pour</td></tr> incubateur de culture cellulaire <tr><td>(37 &deg ; C)</td><td>Panasonic</td><td>MCO-18AC</td><td>Instrument pour la culture cellulaire</td></tr><tr><td>Tube</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCR pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15410-122</td><td>Antibiotique dans le milieu pour prévenir la contamination par les bactéries</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine-Amphotéricine B Solution</td><td>Gibco</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Réfrigérateur (-80 &deg ; C)</td><td>milieu sanyo</td><td>MDF-U54V</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI)</td><td>Milieu C11875500BT Gibco</td><td></td><td>pour lignées cellulaires de mosiquto</td></tr><tr><td>Tubes de stockage à bouchon à vis (2 mL)</td><td>biofil</td><td>&nbsp ; </td><td></td>FCT010005</tr><tr><td>pilons stériles</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y004</td><td>Consommables pour le broyage</td></tr><tr><td>TGrinder OSE-Y30 broyeur électrique de tissus</td><td>Tiangen</td><td>OSE-Y30</td><td>Instrument pour le broyage</td></tr><tr><td>Le microscope de dissection</td><td>ZEISS</td><td>stemi508</td><td></td></tr><tr><td>les pièges à lumière MXA-02</td><td>Maxttrac</td><td></td><td></td></tr><tr><td>La machine</td> <td>à absorber les moustiquesNingbo Bangning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Les pointes de pipette</td><td>Axygen</td><td>TF</td><td></td></tr><tr><td>The QIAamp mini kit d’ARN viral</td><td>QIAGEN</td><td>52906</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>Dumont</td><td>0203-5-PO</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement du virus associé aux moustiques à partir de moustiques collectés sur le terrain

Mosquito-Associated Virus Isolation from Field-Collected Mosquitoes

Grâce à la vaste application des technologies de séquençage, de nombreuses nouvelles séquences virales ont été découvertes chez les arthropodes, y compris les moustiques. Les deux principales catégories de ces nouveaux virus associés aux moustiques sont les « virus transmis par les moustiques » et les « virus spécifiques aux moustiques (MSV) ». Ces nouveaux virus pourraient être pathogènes à la fois pour les vertébrés et les moustiques, ou ils pourraient simplement être symbiotiques avec les moustiques. Les virus d’entité sont essentiels pour confirmer les caractéristiques biologiques de ces virus. Ainsi, un protocole détaillé a été décrit ici pour l’isolement et l’amplification du virus à partir de moustiques collectés sur le terrain. Tout d’abord, les échantillons de moustiques ont été préparés en tant que surnageants d’homogénats de moustiques. Après une centrifugation à deux reprises, les surnageants ont ensuite été inoculés dans la lignée cellulaire de moustiques C6/36 ou la lignée cellulaire de vertébrés BHK-21 pour l’amplification du virus. Après 7 jours, les surnageants ont été collectés en tant que surnageants P1 et stockés à -80 °C. Ensuite, les surnageants P1 ont été passés deux fois de plus dans les cellules C6/36 ou BHK-21 pendant que l’état de la cellule était vérifié quotidiennement. Lorsque l’effet cytopathogène (ECP) sur les cellules a été découvert, ces surnageants ont été recueillis et utilisés pour identifier les virus. Ce protocole sert de base à la recherche future sur les virus associés aux moustiques, y compris les MBV et les MSV.

Après inoculation avec les surnageants des homogénats de moustiques (P0), les cellules C6/36 présentaient un large espace intercellulaire, et des cellules exfoliées ont été observées à 120 h (Figure 1A) par rapport aux cellules non inoculées (témoin) en même temps (Figure 1B). Après incubation des cellules BHK-21 avec les surnageants P3, une CPE visible a été observée dans les cellules BHK-21 à 48 h (Figure 1C) contrairement aux cel...

De nombreuses nouvelles séquences pseudo-virales ont été trouvées chez les moustiques en raison de l’utilisation intensive des technologies de séquençage. Nous fournissons une procédure efficace pour isoler et amplifier les virus à l’aide de lignées cellulaires de vertébrés et de moustiques, qui pourrait servir de base à de futures études sur les virus associés aux moustiques, y compris les virus transmis par les moustiques et les virus spécifiques aux moustiques.

Isolement du virus associé aux moustiques à partir de moustiques collectés sur le terrain

With the broad application of sequencing technologies, many novel virus-like sequences have been discovered in arthropods, including mosquitoes. The two ...

Ce protocole est une approche utile pour isoler les virus associés aux moustiques et peut aider à poursuivre la recherche sur la distribution des agents pathogènes liés aux moustiques et le contrôle des maladies transmises par les moustiques. L’utilisation de lignes minces pour isoler les virus dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 est plus sûre et plus efficace. Contrairement à d’autres procédures d’isolement du virus, telles que l’inoculation rouge à cycle avec un liquide variable, cette technique ne nécessite pas d’expérimentation animale ou d’évaluation éthique.La contamination par les échantillons et les cellules prélevées pendant l’incubation peut conduire à l’échec de l’expérience. Par conséquent, il est nécessaire d’ajouter 2% de pénicilline-streptomycine-amphotéricine dans le milieu pour éviter la contamination. Commencez par ajouter des billes de céramique de trois millimètres, 1,5 millilitre de milieu RPMI complété par une solution à 2% de pénicilline-streptomycine-amphotéricine B dans un tube stérile de deux millilitres placé sur de la glace, puis transférez-y 50 moustiques.Ensuite, homogénéisez les moustiques avec un homogénéisateur de tissus à basse température en broyant pendant 30 secondes à 70 hertz et 4 degrés Celsius pendant 3 cycles. Centrifuger l’homogénat à 15 000 G pendant 30 minutes à 4 degrés Celsius et transférer les surnageants dans les nouveaux tubes. Pour éliminer complètement les débris de moustiques, centrifuger à nouveau le surnageant à 15 000 G pendant 10 minutes à 4 degrés Celsius.Aliquote les 200 microlitres de surnageant P0 dans un tube de stockage à bouchon à vis de deux millilitres et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Pour l’amplification du virus, utilisez la lignée cellulaire de moustiques déficiente en ARNi d’Aedes albopictus C6/36 et une lignée cellulaire de vertébrés, un rein de bébé hamster ou BHK-21 provenant d’une fiole carrée de 75 centimètres et ensemencez-les séparément dans 24 plaques de puits. Placez la plaque de 24 puits ensemencée pendant la nuit à 28 ou 37 degrés Celsius.Le lendemain, observez les cellules au microscope pour confirmer une confluence de 80 à 90% dans chaque puits. Préparez 500 millilitres du milieu de maintien de la culture cellulaire complété par des antibiotiques. Retirez le milieu de culture cellulaire des plaques de 24 puits et ajoutez 100 microlitres du milieu de maintenance de culture cellulaire à chaque puits.Inoculez ensuite les cellules avec 100 microlitres du surnageant de l’homogénat de moustique ou P0. Incuber les plaques à 28 ou 37 degrés Celsius pendant 60 minutes et agiter doucement les plaques toutes les 15 minutes pour éviter le dessèchement des cellules. Une fois cela fait, retirez le surnageant et rincez chaque puits avec 600 microlitres de milieu de maintien de culture cellulaire pour éliminer complètement les débris. Ensuite, ajoutez 800 microlitres de milieu de maintenance de culture cellulaire à chaque puits avant de placer les plaques dans un incubateur humidifié à 5% de dioxyde de carbone à 28 ou 37 degrés Celsius pendant 7 jours.Surveiller quotidiennement l’état des cellules de chaque puits au microscope. Le septième jour, collectez le surnageant des cellules connues sous le nom de P1 et stockez-le à moins 80 degrés Celsius. Répétez la procédure pour recueillir les surnageants viraux P2 et P3.En raison de l’effet cytopathogène, ou CPE, les cellules de certains puits meurent et se détachent de la surface. Pour amplifier considérablement les virus, prélevez 300 à 400 microlitres du surnageant dans des puits présentant l’effet CPE et transférez-le dans une nouvelle plaque à six puits ayant une confluence cellulaire de 80 à 90% de cellules de culture. Enfin, collectez et transférez 500 microlitres du surnageant des puits de la plaque de six puits vers des tubes de stockage à bouchon à vis de deux millilitres avant de les stocker à moins 80 degrés Celsius.L’inoculation des cellules C6/36 avec les homogénats de moustiques P0 a montré un large espace intercellulaire dans les cellules exfoliées 120 heures après l’infection par rapport aux cellules non inoculées ou témoins. L’incubation des cellules BHK21 avec les surnageants viraux P3 a démontré une ECP visible 48 heures après l’infection, montrant la mort de la cellule et le décollement de la surface contrairement aux cellules témoins. Des amorces universelles disponibles dans le commerce ou Flavivirus, Alphavirus et Bunyavirus ont été utilisés pour générer les produits PCR pour le surnageant viral.Un produit PCR pour le Bunyavirus, le virus du lac Ebinur, a été défini comme témoin positif. Les interdictions d’amplification par PCR dans les couloirs appartenant aux Bunyavirus et le contrôle positif ont mis en évidence la possibilité de la présence de Bunyavirus dans les surnageants. Pour améliorer le taux de réussite de l’isolement du virus, maintenez une température basse pendant le transport, l’isolement et le broyage des échantillons.Ajoutez des antibiotiques lors de l’homogénéisation des moustiques et de la culture elle-même. Et manipulez la culture rapidement pendant l’incubation et l’enlèvement du milieu de culture. En plus de cette procédure, la solution de broyage peut être injectée dans un embryon de rat ou de poulet à vélo.Cependant, la procédure d’affirmation soulèvera des préoccupations éthiques et augmentera le coût de l’expérience.

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