Name: Techniques moléculaires et immunologiques dans un modèle murin génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Découvrez les techniques de dissection et de traitement d'échantillons pour la recherche sur les tumeurs stromales gastro-intestinales (GIST) chez la souris Kit V558Δ/+. Ce protocole permet d'étudier les immunothérapies dans un modèle immunocompétent.

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Les souris kitV558Δ/+ ont été génétiquement modifiées et partagées par le Dr Peter Besmer10. Ce travail a été soutenu par les subventions R01 CA102613 et T32 CA251063 des NIH.

Toutes les souris ont été hébergées dans des conditions exemptes d’agents pathogènes à l’Université de Pennsylvanie conformément aux directives des NIH et avec l’approbation de l’IACUC de l’Université de Pennsylvanie. L’euthanasie a été effectuée conformément aux procédures opérationnelles normalisées des ressources pour animaux de laboratoire de l’Université de Pennsylvanie.
1. KitV558Δ/+ élevage de souris
<ol><li>Rétrocroisez les souris KitV558Δ/+ plus de 10 fois sur un fond C57BL/6J à l’aide de souris C57BL/6J. Pour ce faire, élevez les souris mâles KitV558Δ/+ avec des souris femelles C57BL/6J dans un rapport de 1:2. REMARQUE: Le génotype homozygote KitV558Δ / V558Δ est létal in utero. Il est possible d’élever des souris femelles KitV558Δ/+ avec des souris mâles C57BL/6J, mais la taille de la portée est environ la moitié de celle observée chez les souris femelles de type sauvage C57BL/6J. De plus, les souris femelles KitV558Δ/+ produisent des portées limitées après l’âge de 4 mois.</li>
	<li>Génotype des chiots à l’âge de 7 à 14 jours par écrêtage des orteils pour confirmer la présence du génotype KitV558Δ/ +. Utilisez l’amorce avant : TCTCCTCCAGAAACCCATGTATGAA; rapporteur 1 : CCTCGACAACCTTCCA; amorce inverse: TTGCGTCGGGTCTATGTAAACAT; et rapporteur 2 : TCTCCTCGACCTTCCA pour le génotypage.</li>
</ol>2. KitV558Δ/+ traitement de la souris
<ol><li>L’âge et le sexe correspondent aux souris KitV558Δ/+ avant le traitement. Utilisez les souris appariées selon l’âge et le sexe dans les cohortes, car les tumeurs des souris femelles KitV558Δ / + sont plus grandes que celles des souris mâles. Traitez les souris âgées de 8 à 12 semaines, moment auquel les tumeurs sont établies (Figure 1).</li>
	<li>Administrer des inhibiteurs de la tyrosine kinase par voie orale ou par injection intrapéritonéale (i.p.); Les tumeurs du KitV558Δ/+ sont sensibles aux inhibiteurs de la tyrosine kinase. Fournir de l’imatinib à une dose de 600 mg/L dans l’eau potable ou des injections intra-atmosphériques de 45 mg/kg deux fois par jour. Mesurer la réduction du poids de la tumeur à l’aide de balances numériques après dissection de la tumeur, comme indiqué à l’étape 3, qui est d’environ 50% à 1 semaine et de 80% à 4 semaines après le traitement par l’imatinib (Figure 2).</li>
</ol>3. KitV558Δ/+ prélèvement d’organes de souris
<ol><li>Euthanasier les souris par narcose au CO2 à un débit de 60% de volume de chambre par min. Laissez les souris dans la chambre pendant au moins 2 minutes après l’arrêt de la respiration, puis effectuez une luxation cervicale pour confirmer la mort.</li>
	<li>Stérilisez tous les instruments, portez des gants tout au long de la procédure et maintenez un champ stérile. Préparez la peau avec de l’éthanol à 70%. Faites une incision verticale médiane de 2 cm à l’aide de ciseaux et entrez dans la cavité abdominale. Lyser brusquement toutes les adhérences intra-abdominales.</li>
	<li>Pour enlever le ganglion lymphatique mésentérique drainant, suivez les étapes décrites ci-dessous.<ol>
<li>Identifiez le caecum et soulevez son mésentère de manière supérieure. Environ à mi-chemin de la base du mésentère du côlon, identifiez le ganglion lymphatique mésentérique et disséquez-le brusquement. Le ganglion lymphatique est blanc cassé et mesure environ 0,5 cm x 0,5 cm.</li>
		<li>Divisez le tissu ganglionnaire en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire, au besoin. Pour les suspensions unicellulaires, placer le tissu ganglionnaire lymphatique dans 20 mL de milieu libre sérique (RPMI) et le garder sur la glace.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour isoler le GIST et le caecum, suivez les étapes décrites ci-dessous.<ol>
<li>Le caecum des souris KitV558Δ/+ est principalement remplacé par un GIST. Divisez soigneusement la jonction iléocolique de la base de la tumeur. Pour recueillir le caecum, divisez à nouveau le côlon, à 2 cm proximal de la base de la tumeur.</li>
		<li>Chez 50% à 60% des souris KitV558Δ / + , la tête de la tumeur contient un capuchon de tissu cæcal, qui contient généralement du liquide séreux mais peut rarement contenir du pus (Figure 3). Disséquez brusquement le tissu de la calotte loin du tissu tumoral.</li>
		<li>Divisez le tissu tumoral et / ou le caecum en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire, au besoin. Pour les suspensions unicellulaires, placez le tissu tumoral ou le caecum dans HBSS avec 2% de FCS, assez pour couvrir l’échantillon et le garder sur la glace.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Analyse par transfert Western du tissu GIST
<ol><li>Préparer un tampon de lyse tissulaire contenant 50 mM de TrisHCl (pH 7,5), 150 mM de NaCl, 5 mM d’EDTA, 1 % de détergent non dénaturant, 2 mM Na3VO4, 1 mM pmSF, 10 mM NaF et 20 μl/ml de mélange inhibiteur de protéinase.</li>
	<li>Préparez une solution saline tamponnée 1x Tris avec 1% Tween 20 (TBST) en combinant 1800 mL d’eau désionisée, 2 mL de Tween 20 et 200 mL de solution saline tamponnée Tris (TBS).</li>
	<li>Remettre en suspension le tissu de l’étape 3.4.3 dans un tube FACS dans 5 mL/g de tampon de lyse tissulaire et homogénéiser deux fois avec un homogénéisateur mécanique à 15 000 tr/min pendant 15 s sur glace. Incuber lysat pendant 30 min sur glace.</li>
	<li>Transférer le lysat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Centrifuger à vitesse maximale pendant 20 min à 4 °C. Transférer le surnageant dans un nouveau tube de microcentrifugation.</li>
	<li>Exécuter les lysats sur un gel gradient de 4% à 15%, puis transférer sur une membrane de nitrocellulose, comme décrit aupoint 14.</li>
	<li>Lavez la membrane une fois dans 1x TBS pendant 5 min, puis bloquez la membrane dans du lait à 5% pendant 1 h. Encore une fois, lavez la membrane une fois dans 1x TBS pendant 10 min.</li>
	<li>Incuber la membrane dans un anticorps primaire dilué à 1:1000 dans 5% de BSA à 4 °C pendant la nuit. Laver la membrane 3x en 1x TBST pendant 10 min chacun. Éponger avec un anticorps secondaire dilué à 1:2500 dans du lait à 2,5% pendant 1 h à température ambiante.</li>
	<li>Laver la membrane une fois dans 1x TBS pendant 5 min. Ajoutez suffisamment de substrat HRP pour couvrir la membrane, généralement de 200 à 500 μL, et utilisez un imageur numérique pour détecter et quantifier la chimiluminescence.</li>
</ol>5. Immunohistochimie du tissu GIST
<ol><li>Fixer les tissus de l’étape 3.3.2 ou 3.4.3 dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant la nuit. Conservez les tissus dans 70 % d’EtOH jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour le traitement. Incorporer et découper des blocs d’une épaisseur de 5 μm sur des lames de verre, comme décrit15,16.</li>
	<li>Détection immunohistochimique complète à l’aide d’un kit d’immunodétection de base, comme décrit précédemment17.</li>
</ol>6. Suspension unicellulaire du ganglion lymphatique mésentérique
<ol><li>Versez le milieu RPMI avec un échantillon de ganglions lymphatiques de l’étape 3.3.2 sur un filtre de 100 μm. Déplacez le filtre vers un nouveau ganglion lymphatique conique et écrasez-le de 50 mL avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de 3 mL. Filtre de lavage avec 20 mL de média RPMI.</li>
	<li>Centrifuger le filtrat à 450 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.</li>
	<li>Remettre en suspension la pastille dans 20 mL de 1 % de FBS dans du PBS (tampon de billes) et verser sur un filtre de 40 μm. Recueillir le filtrat cellulaire. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger le filtrat à 450 x g à 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans un tampon de billes à 6 x 107 cellules/mL pour la cytométrie en flux.</li>
</ol>7. Suspension à cellule unique du GIST
<ol><li>Préparer un tampon de collagénase en ajoutant 250 mg de collagénase IV, un comprimé d’inhibiteur de la protéase sans EDTA et 100 μL de DNase I à 50 mL de HBSS. Faire pivoter pendant 10 min à température ambiante jusqu’à dissolution.</li>
	<li>Placez GIST dans un plat stérile et ajoutez 2,5 mL de tampon de collagénase. Mince tumeur en utilisant un scalpel stérile et des ciseaux jusqu’à ce que la tumeur soit en fragments fins. Utilisez une pipette à gros alésage pour aspirer la tumeur et la collagénase dans un tube de 50 mL.</li>
	<li>Incuber dans un incubateur à agitation à 100 tr/min à 37 °C pendant 30 min. Réaction de trempe avec 2 mL de FBS.</li>
	<li>Versez la collagénase avec un échantillon GIST sur un filtre de 100 μm et écrasez la tumeur avec l’extrémité molle d’une seringue en plastique de 3 mL et collectez dans un tube de 50 mL. Filtre de lavage avec 20 mL de HBSS. Centrifuger le filtrat à 450 x g, 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.</li>
	<li>Remettre la pastille dans 20 mL de tampon de billes et verser sur un filtre de 40 μm. Prélever le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifuger le filtrat à 450 x g, 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans un tampon de billes à 6 x 107 cellules/mL pour la cytométrie en flux.</li>
</ol>8. Suspension unicellulaire de caecum
<ol><li>Préparer le tampon de collagénase comme à l’étape 7.1. À l’aide de ciseaux, fendez le caecum longitudinalement pour exposer la muqueuse interne. Couper en sections de 0,5 cm et placer dans un tube de 50 mL avec 5 mL de HBSS avec 2% de FBS. Agiter vigoureusement pendant 30 s, centrifuger à 450 x g pendant 20 s, puis aspirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de HBSS avec 2 mM d’EDTA. Incuber dans un incubateur à agitation à 37 °C à 100 tr/min pendant 15 min. Centrifuger à 450 x g pendant 20 s. Aspirer le surnageant.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de HBSS. Agiter vigoureusement pendant 30 s, centrifuger à 450 x g pendant 20 s, puis aspirer le surnageant. Répétez une fois de plus.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de tampon de collagénase. Incuber dans un incubateur à agitation à 37 °C pendant 30 min à 100 tr/min. Agiter vigoureusement toutes les 10 minutes. Réaction de trempe avec 2 mL de FBS.</li>
	<li>Versez la collagénase avec un échantillon de caecum sur un filtre de 100 μm et écrasez-la avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de 3 mL. Filtre de lavage avec 20 mL de HBSS. Collecter le filtrat.</li>
	<li>Centrifuger le filtrat à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension la pastille dans 20 mL de tampon de billes et verser sur un filtre de 40 μm. Recueillir le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.</li>
	<li>Centrifuger le filtrat à 450 x g pendant 5 min à 4 °C. Aspirer le surnageant. Remettre en suspension dans un tampon de billes à 6 x 107 cellules/mL pour la cytométrie en flux.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Le modèle murin Kit V558Δ/+ est un puissant outil de recherche dans l’analyse moléculaire et immunologique du GIST. Bien que la stratégie de sélection nécessite un seul croisement, l’utilisation de cohortes de souris KitV558Δ / + dans des expériences analysant la réponse tumorale nécessite une reproduction approfondie. Les souris doivent être appariées selon l’âge et le sexe pour assurer des poids tumoraux similaires, et 10% des souris meurent avant l’âge de 8 semaines lorsque les ...

GIST est le sarcome le plus fréquent chez l’homme avec une incidence d’environ 6 000 cas aux États-Unis d’Amérique1. GIST semble provenir des cellules du stimulateur cardiaque gastro-intestinal appelées cellules interstitielles de Cajal, et est généralement entraîné par une seule mutation dans la tyrosine kinase KIT ou PDGFRA2. La chirurgie est le pilier du traitement de la GIST et peut être curative, mais les patients atteints d’une maladie avancée peuvent être traités avec l’inhibiteur de la tyrosine kinase (ITK), l’imatinib. Depuis son introduction il y a plus de 20 ans, l’imatinib a transformé le paradigme de traitement dans GIST, améliorant la survie dans les maladies avancées de 1 à plus de 5 ans 3,4,5. Malheureusement, l’imatinib est rarement curatif en raison de mutations KIT acquises, de sorte que de nouveaux traitements sont nécessaires pour cette tumeur.
Les modèles murins sont un outil de recherche important dans la recherche de nouvelles thérapies contre le cancer. Plusieurs modèles de xénogreffe sous-cutanée et de xénogreffe dérivés du patient ont été développés et étudiés dans GIST 6,7. Cependant, les souris immunodéficientes ne représentent pas entièrement les GIST humains, car les TIST présentent des profils immunitaires différentiels en fonction de leur mutation oncogène, et la modification du microenvironnement tumoral gastro-intestinal améliore les effets du traitement par TKI 8,9. La souris KitV558Δ/+ a une délétion germinale hétérozygote dans l’exon 11 du Kit, qui code le domaine juxtamembranaire, le site le plus fréquemment muté dans le GIST10 humain. Les souris KitV558Δ / + développent un seul GIST cæcal avec une pénétrance de 100%, et les tumeurs ont une histologie, une signalisation moléculaire, une infiltration immunitaire et une réponse au traitement similaires à celles de la GISThumaine 8,11,12,13. Ici, nous décrivons la sélection, le traitement et l’isolement et le traitement des échantillons chez des souris KitV558Δ / + pour une utilisation dans la recherche moléculaire et immunologique dans GIST.

<table><tbody><tr><td>Filtre 100 microns</td><td>EMSCO</td><td>1194-2360</td><td></td></tr><tr><td>1x tampon de lyse RBC</td><td>Life Technologies</td><td>00-4333-57</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de 3 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific/BD Biosciences</td><td>14823435</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash ; 15 % Mini-PROTEAN TGX Gels de protéines préfabriquées, 10 puits, 30 & micro ; l</td><td>Bio-Rad</td><td>4561083</td><td></td></tr><tr><td>4 % Paraformaldéhyde Solution</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AAJ19943K2</td><td></td></tr><tr><td>40 microns Filtre</td><td>EMSCO</td><td>1194-2340</td><td></td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6546</td><td></td></tr><tr><td>Filtre 70 microns</td><td>EMSCO</td><td>1194-2350</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps AKT (C67E7)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4691</td><td></td></tr><tr><td>souris C57BL/6J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Collagenase IV</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5138</td><td></td></tr><tr><td>Mini inhibiteur de protéase sans edta complet</td><td>Thomas Scientific</td><td>C852A34</td><td></td></tr><tr><td>Countess II Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpels jetables</td><td>Thermo Fisher Scientific/Exel International</td><td>14-840-00</td><td></td></tr><tr><td>Dnase I</td><td>Thomas Scientific</td><td>C756V81</td><td></td></tr><tr><td>Dog1 anticorps</td><td>abcam</td><td>ab64085</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps ERK (p44/42)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9102</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thomas Scientific</td><td>C788U23</td><td></td></tr><tr><td>FIJI software</td><td>FIJI</td><td></td><td>https://imagej.net/software/fiji</td></tr><tr><td>Fisherbrand 850 Homogénéisateur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-340-169</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Centre cellulaire</td><td></td><td></td>de l’Université de Pennsylvanie</tr><tr><td>Mésylate d’imatinib</td><td>Selleck Chemicals</td><td>S1026</td><td></td></tr><tr><td>KIT anticorps (D13A2)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>3074</td><td></td></tr><tr><td>KitV558&Delta ;/+ Génotypage</td><td>Transnetyx</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation (1,5 ml)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’immunodétection souris sur souris, Basic</td><td>Vector Laboratories</td><td>BMK-2202</td><td></td></tr><tr><td>Membrane de nitrocellulose, prédécoupée, 0,45 & micro ; m</td><td>Rio-Rad</td><td>1620145</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>NC9121673</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P 40 Substitut</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps p-AKT (S473)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps p-ERK (p44/42)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9101</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps p-KIT (Y719)</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>3391</td><td></td></tr><tr><td>PMSF Inhibiteur de protéase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>36978</td><td></td></tr><tr><td>Proeinase K</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP170050</td><td></td></tr><tr><td>Tubes d’essai de polystyrène à fond rond (FACS)</td><td>Falcon/Thermo Fisher Scientific</td><td>14-959-2A</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluorure de sodium (NaF)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td>201154</tr><tr><td>Orthovanadate de sodium (Na3VO4)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6508</td><td></td></tr><tr><td>SuperSignal West Dura Substrat de durée prolongée</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>34076</td><td></td></tr><tr><td>Tampon TBS (10x)</td><td>University of Pennsylvania Cell Center</td><td></td><td></td>Boîte de</tr><tr><td>culture tissulaire (100mm2)</td><td>Thermo Fisher Scientific/Falcon</td><td>08-772E</td><td></td></tr><tr><td>TrisHCL</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1757500</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Rio-Rad</td><td>1706531</td><td></td></tr><tr><td> Plate-forme vivaCT 80</td><td>Scanco medical</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

techniques moléculaires et immunologiques dans un modèle murin génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale

Molecular and Immunologic Techniques in a Genetically Engineered Mouse Model of Gastrointestinal Stromal Tumor

La tumeur stromale gastro-intestinale (GIST) est le sarcome humain le plus courant et est généralement entraînée par une seule mutation du récepteur KIT. Parmi les types de tumeurs, de nombreux modèles murins ont été développés afin d’étudier la prochaine génération de thérapies contre le cancer. Cependant, dans GIST, la plupart des études in vivo utilisent des modèles murins de xénogreffe qui ont des limites inhérentes. Ici, nous décrivons un modèle murin immunocompétent et génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale hébergeant une mutation KitV558Δ / +. Dans ce modèle, le KIT mutant, l’oncogène responsable de la plupart des TIST, est entraîné par son promoteur endogène conduisant à un GIST qui imite l’apparence histologique et l’infiltrat immunitaire observés dans les GIST humains. En outre, ce modèle a été utilisé avec succès pour étudier à la fois des thérapies moléculaires et immunitaires ciblées. Nous décrivons ici l’élevage et l’entretien d’une colonie de souris KitV558Δ/+ . De plus, cet article détaille le traitement et l’approvisionnement du GIST, du ganglion lymphatique mésentérique drainant et du caecum adjacent chez les souris kitV558Δ/+ , ainsi que la préparation des échantillons pour les analyses moléculaires et immunologiques.

Le modèle murin Kit V558Δ/+ permet d’étudier des traitements dans un modèle murin immunocompétent. Les souris kitV558Δ/+ ont une durée de vie moyenne de 8 mois en raison d’une occlusion intestinale progressive (Figure 4). Les tumeurs des souris KitV558Δ/+ expriment des marqueurs canoniques de GIST, y compris la tyrosine kinase KIT et le canal transmembranaire DOG1 (<strong class="xf...

L’objectif de ce manuscrit est de décrire le modèle de souris KitV558Δ/+ et les techniques de dissection et de traitement réussis des spécimens de souris.

Techniques moléculaires et immunologiques dans un modèle murin génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale

Gastrointestinal stromal tumor (GIST) is the most common human sarcoma and is typically driven by a single mutation in the KIT receptor. Across tumor ...

Notre protocole décrit la reproduction, l’entretien, la dissection et le traitement des échantillons du seul modèle de souris immunocompétent, GIST, actuellement utilisé. Nous espérons que les futurs chercheurs seront en mesure d’utiliser ce modèle murin afin de poursuivre la recherche translationnelle dans GIST. Les thérapies traditionnelles dans GIST impliquent une thérapie moléculaire ciblée avec des inhibiteurs de la tyrosine kinase.Ce modèle permet aux chercheurs de tester des immunothérapies dans le GIST. Pour commencer, stérilisez tous les instruments, portez des gants tout au long de la procédure et maintenez un champ stérile. Préparez la zone d’incision avec de l’éthanol à 70%.À l’aide de ciseaux, faites une incision verticale médiane de deux centimètres et entrez dans la cavité abdominale. Lyser brusquement toutes les adhérences intra-abdominales. Pour enlever le ganglion lymphatique mésentérique drainant, identifiez le caecum et soulevez son mésentère de manière supérieure.Environ à mi-chemin de la base du mésentère du côlon, identifiez le ganglion lymphatique mésentérique et disséquez-le brusquement. Au besoin, divisez le tissu ganglionnaire en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire. Placer le tissu ganglionnaire dans 20 millilitres de milieu RPMI pour les suspensions unicellulaires et garder sur la glace.Le caecum est principalement remplacé par un GIST chez les souris Kit558. Pour isoler le GIST et le caecum, divisez soigneusement la jonction iléocolique de la base de la tumeur. Ensuite, divisez à nouveau le caecum, deux centimètres distaux à la base de la tumeur.Chez 50 à 60% des souris Kit558, la tête de la tumeur contient un capuchon de tissu cæcal, qui contient généralement du liquide séreux, mais peut rarement contenir du pus. Disséquez brusquement le tissu de la calotte loin du tissu tumoral. Divisez le tissu tumoral et le caecum en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire.Pour les suspensions unicellulaires, placez le tissu tumoral ou le caecum dans HBSS avec 2% FCS, assez pour couvrir l’échantillon et le garder sur la glace. Versez le milieu RPMI avec l’échantillon de ganglions lymphatiques sur un filtre de 100 micromètres. Déplacez le filtre vers un nouveau conique de 50 millilitres et écrasez le ganglion lymphatique avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de trois millilitres.Filtre de lavage avec 20 millilitres de média RPMI. Centrifugez les échantillons et aspirez le surnageant. Remettez en suspension la pastille dans 20 millilitres de tampon de billes et versez sur un filtre de 40 micromètres.Recueillir le filtrat cellulaire. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugez les échantillons et jetez le surnageant.Ensuite, remettez en suspension dans un tampon de billes pour la cytométrie en flux. Préparez un tampon de collagénase comme décrit dans le manuscrit textuel. Placez GIST dans un plat stérile et ajoutez 2,5 millilitres de tampon de collagénase.À l’aide d’un scalpel stérile et de ciseaux, hachez la tumeur jusqu’à ce qu’elle soit en fragments fins. Utilisez une pipette de gros calibre pour aspirer la tumeur et la collagénase dans un tube de 50 millilitres. Incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 100 rotations par minute, puis éteignez la réaction avec deux millilitres de FBS.Versez la collagénase avec un échantillon GIST sur un filtre de 100 micromètres et écrasez la tumeur avec l’extrémité molle d’une seringue en plastique de trois millilitres et collectez dans un tube de 50 millilitres. Filtre de lavage avec 20 millilitres de HBSS. Centrifuger le filtrat à 450 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis éliminer le surnageant.Remettre la pastille dans 20 millilitres de tampon de billes et verser sur un filtre de 40 micromètres Recueillir le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugez et aspirez le surnageant, puis remettez-le en suspension dans un tampon de billes pour la cytométrie en flux. À l’aide de ciseaux, fendez le caecum longitudinalement pour exposer la muqueuse interne.Coupez-le en sections de 0,5 centimètre et placez-le dans un tube de 50 millilitres avec cinq millilitres de HBSS et 2% de FBS. Agiter vigoureusement pendant 30 secondes et centrifuger à 450 RCF pendant 20 secondes. Ensuite, jetez le surnageant.Ajouter cinq à 20 millilitres de HBSS avec de l’EDTA de deux millimolaires. Incubez-le à 37 degrés Celsius à 100 rotations par minute pendant 15 minutes. Centrifuger et jeter le surnageant, puis remettre la pastille en suspension dans cinq à 20 millilitres de HBSS.Agiter vigoureusement le mélange pendant 30 secondes, puis centrifuger à 450 FCR pendant 20 secondes et jeter le surnageant. Répétez ce processus une fois de plus. Remettez la pastille dans cinq millilitres de tampon de collagénase, puis incuvrez-la à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 100 rotations par minute.Agiter vigoureusement toutes les 10 minutes et éteindre la réaction avec deux millilitres de FBS. Versez la collagénase avec un échantillon de cæcum sur un filtre de 100 micromètres et écrasez-la avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de trois millilitres. Lavez le filtre avec 20 millilitres de HBSS et collectez le filtrat.Centrifuger et jeter le surnageant. Remettez en suspension la pastille dans 20 millilitres de tampon de billes et versez sur un filtre de 40 micromètres. Recueillir le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.Répétez le processus de centrifugation une fois de plus et remettez en suspension la pastille dans un tampon de billes pour la cytométrie en flux. Les souris Kit558 avaient une durée de vie moyenne de huit mois en raison d’une occlusion intestinale progressive. Les tumeurs des souris Kit558 ont exprimé des marqueurs canoniques de GIST, y compris la tyrosine kinase KIT, le canal transmembranaire Dog1 et le facteur de transcription ETV1.Les tumeurs ont été étudiées pour des changements dans la voie de signalisation KIT tels que les marqueurs en aval ERK et AKT ou le microenvironnement immunitaire, qui imitait étroitement le GIST humain. L’IRM ou la tomodensitométrie a été utilisée pour suivre le volume tumoral en tant que mesure précise de la réponse tumorale. Disséquer la tumeur loin de la jonction iléocolique et loin du capuchon cæcal est important pour capturer le poids réel de la tumeur et l’analyse immunitaire et moléculaire.Au sein du GIST, ce modèle a permis d’étudier le microenvironnement tumoral, ainsi que les immunothérapies.

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