Techniques moléculaires et immunologiques dans un modèle murin génétiquement modifié de tumeur stromale gastro-intestinale

Notre protocole décrit la reproduction, l’entretien, la dissection et le traitement des échantillons du seul modèle de souris immunocompétent, GIST, actuellement utilisé. Nous espérons que les futurs chercheurs seront en mesure d’utiliser ce modèle murin afin de poursuivre la recherche translationnelle dans GIST. Les thérapies traditionnelles dans GIST impliquent une thérapie moléculaire ciblée avec des inhibiteurs de la tyrosine kinase.

Ce modèle permet aux chercheurs de tester des immunothérapies dans le GIST. Pour commencer, stérilisez tous les instruments, portez des gants tout au long de la procédure et maintenez un champ stérile. Préparez la zone d’incision avec de l’éthanol à 70%.

À l’aide de ciseaux, faites une incision verticale médiane de deux centimètres et entrez dans la cavité abdominale. Lyser brusquement toutes les adhérences intra-abdominales. Pour enlever le ganglion lymphatique mésentérique drainant, identifiez le caecum et soulevez son mésentère de manière supérieure.

Environ à mi-chemin de la base du mésentère du côlon, identifiez le ganglion lymphatique mésentérique et disséquez-le brusquement. Au besoin, divisez le tissu ganglionnaire en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire. Placer le tissu ganglionnaire dans 20 millilitres de milieu RPMI pour les suspensions unicellulaires et garder sur la glace.

Le caecum est principalement remplacé par un GIST chez les souris Kit558. Pour isoler le GIST et le caecum, divisez soigneusement la jonction iléocolique de la base de la tumeur. Ensuite, divisez à nouveau le caecum, deux centimètres distaux à la base de la tumeur.

Chez 50 à 60% des souris Kit558, la tête de la tumeur contient un capuchon de tissu cæcal, qui contient généralement du liquide séreux, mais peut rarement contenir du pus. Disséquez brusquement le tissu de la calotte loin du tissu tumoral. Divisez le tissu tumoral et le caecum en tiers pour l’isolement des protéines, l’histologie et la suspension unicellulaire.

Pour les suspensions unicellulaires, placez le tissu tumoral ou le caecum dans HBSS avec 2% FCS, assez pour couvrir l’échantillon et le garder sur la glace. Versez le milieu RPMI avec l’échantillon de ganglions lymphatiques sur un filtre de 100 micromètres. Déplacez le filtre vers un nouveau conique de 50 millilitres et écrasez le ganglion lymphatique avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de trois millilitres.

Filtre de lavage avec 20 millilitres de média RPMI. Centrifugez les échantillons et aspirez le surnageant. Remettez en suspension la pastille dans 20 millilitres de tampon de billes et versez sur un filtre de 40 micromètres.

Recueillir le filtrat cellulaire. Compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugez les échantillons et jetez le surnageant.

Ensuite, remettez en suspension dans un tampon de billes pour la cytométrie en flux. Préparez un tampon de collagénase comme décrit dans le manuscrit textuel. Placez GIST dans un plat stérile et ajoutez 2,5 millilitres de tampon de collagénase.

À l’aide d’un scalpel stérile et de ciseaux, hachez la tumeur jusqu’à ce qu’elle soit en fragments fins. Utilisez une pipette de gros calibre pour aspirer la tumeur et la collagénase dans un tube de 50 millilitres. Incubez-le à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 100 rotations par minute, puis éteignez la réaction avec deux millilitres de FBS.

Versez la collagénase avec un échantillon GIST sur un filtre de 100 micromètres et écrasez la tumeur avec l’extrémité molle d’une seringue en plastique de trois millilitres et collectez dans un tube de 50 millilitres. Filtre de lavage avec 20 millilitres de HBSS. Centrifuger le filtrat à 450 RCF pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, puis éliminer le surnageant.

Remettre la pastille dans 20 millilitres de tampon de billes et verser sur un filtre de 40 micromètres Recueillir le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre. Centrifugez et aspirez le surnageant, puis remettez-le en suspension dans un tampon de billes pour la cytométrie en flux. À l’aide de ciseaux, fendez le caecum longitudinalement pour exposer la muqueuse interne.

Coupez-le en sections de 0,5 centimètre et placez-le dans un tube de 50 millilitres avec cinq millilitres de HBSS et 2% de FBS. Agiter vigoureusement pendant 30 secondes et centrifuger à 450 RCF pendant 20 secondes. Ensuite, jetez le surnageant.

Ajouter cinq à 20 millilitres de HBSS avec de l’EDTA de deux millimolaires. Incubez-le à 37 degrés Celsius à 100 rotations par minute pendant 15 minutes. Centrifuger et jeter le surnageant, puis remettre la pastille en suspension dans cinq à 20 millilitres de HBSS.

Agiter vigoureusement le mélange pendant 30 secondes, puis centrifuger à 450 FCR pendant 20 secondes et jeter le surnageant. Répétez ce processus une fois de plus. Remettez la pastille dans cinq millilitres de tampon de collagénase, puis incuvrez-la à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes à 100 rotations par minute.

Agiter vigoureusement toutes les 10 minutes et éteindre la réaction avec deux millilitres de FBS. Versez la collagénase avec un échantillon de cæcum sur un filtre de 100 micromètres et écrasez-la avec l’extrémité souple d’une seringue en plastique de trois millilitres. Lavez le filtre avec 20 millilitres de HBSS et collectez le filtrat.

Centrifuger et jeter le surnageant. Remettez en suspension la pastille dans 20 millilitres de tampon de billes et versez sur un filtre de 40 micromètres. Recueillir le filtrat et compter les cellules à l’aide d’un hémocytomètre.

Répétez le processus de centrifugation une fois de plus et remettez en suspension la pastille dans un tampon de billes pour la cytométrie en flux. Les souris Kit558 avaient une durée de vie moyenne de huit mois en raison d’une occlusion intestinale progressive. Les tumeurs des souris Kit558 ont exprimé des marqueurs canoniques de GIST, y compris la tyrosine kinase KIT, le canal transmembranaire Dog1 et le facteur de transcription ETV1.

Les tumeurs ont été étudiées pour des changements dans la voie de signalisation KIT tels que les marqueurs en aval ERK et AKT ou le microenvironnement immunitaire, qui imitait étroitement le GIST humain. L’IRM ou la tomodensitométrie a été utilisée pour suivre le volume tumoral en tant que mesure précise de la réponse tumorale. Disséquer la tumeur loin de la jonction iléocolique et loin du capuchon cæcal est important pour capturer le poids réel de la tumeur et l’analyse immunitaire et moléculaire.

Au sein du GIST, ce modèle a permis d’étudier le microenvironnement tumoral, ainsi que les immunothérapies.