Purification et contrôle de qualité de complexes de septine recombinante pour reconstitution sans cellules

Ce protocole permet de purifier des complexes septiniques de haute qualité, ce qui est essentiel pour étudier les nombreux rôles des septines dans la cellule. Le principal avantage de cette approche est la synthèse d’une procédure simple pour purifier la septine de haute qualité à l’aide de plasmides Addgene. Les septines sont difficiles à étudier dans les cellules en raison de leurs nombreuses interactions.

La reconstitution du soufre nous aide à démêler cette complexité en les étudiant dans un système simple. Nous recommandons de faire la purification en une seule journée pour éviter la dégradation. D’après notre expérience, cela augmentera la durée de vie et la qualité de la protéine.

Pour commencer, cultivez la culture bactérienne transformée à 37 degrés Celsius dans un incubateur à agitateur jusqu’à ce que la densité optique à une longueur d’onde de 600 nanomètres atteigne deux à trois pour les septines non marquées, ou 0,6 à 0,8 pour les septines marquées msfGFP ou mEGFP. Après incubation, induire l’expression de la protéine en ajoutant IPTG à une concentration finale de 0,5 millimolaire et incuber les cellules exprimant des hétéro-oligomères de septine non marqués à 37 degrés Celsius pendant trois heures, ou les cellules exprimant msfGFP marquées hétéro-oligomères à 17 degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, pelletez les cellules à 4 000 fois G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius.

Jeter le surnageant et dissoudre la pastille dans 100 millilitres de tampon de lyse pour lyser les cellules. Ensuite, utilisez un sonicateur de pointe à 30% d’amplitude pour sonifier la cellule. Clarifier le lysat cellulaire en centrifugeant à 20 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius et économiser le surnageant.

Vous pouvez éventuellement prélever un échantillon pour dénaturer l’électrophorèse comme décrit dans le manuscrit. Pour la chromatographie d’affinité des septines marquées His, équilibrez une colonne de chromatographie à haute performance en sépharose de nickel préemballée avec tous les tampons requis. Chargez le surnageant clarifié jusqu’à la colonne et démarrez le système de chromatographie.

Éluez ensuite les complexes septine avec un tampon d’élution HisTrap à 50% à un débit d’un millilitre par minute. Pour obtenir une concentration d’imidazole de 250 millimolaires, prélever des fractions de 0,5 millilitre. Surveillez maintenant l’absorbance optique de l’éluat à 280 nanomètres avec un système de chromatographie liquide protéique rapide et choisissez les fractions contenant des complexes septines.

Pour la chromatographie d’affinité des protéines marquées Strep-II, équilibrer une colonne de chromatographie à haute performance de sépharose StrepTactin préemballée avec tampon septine. Chargez la septine contenant les fractions récupérées de la colonne de nickel à raison d’un millilitre par minute et démarrez le système de chromatographie. Ensuite, lavez la protéine liée et éluez les complexes septiniques avec un tampon d’élution 100% StrepTrap à un débit d’un millilitre par minute.

Pour obtenir une concentration de 2,5 millimolaires de desthiobiotine, prélever des fractions de 0,5 millilitre. Choisissez les fractions contenant des complexes de septine comme indiqué par l’absorbance optique de l’éluat à 280 nanomètres surveillée en ligne avec un système de chromatographie liquide protéique rapide. Après avoir retiré la desthiobiotine par dialyse aliquote les complexes protéiques dans la taille aliquote désirée, congeler l’aliquote et la stocker à moins 80 degrés Celsius.

Pour la microscopie à diffusion interférométrique, lavez les lames de verre numéro 1,5 en les sonicant dans un nettoyeur à ultrasons pendant cinq minutes chacune dans de l’eau, de l’isopropanol et de nouveau dans de l’eau désionisée. Sécher deux lames de verre avec un léger jet d’azote gazeux. Ensuite, placez une goutte de sept microlitres de solution de Poly-L-Lysine à 0,01% au centre de l’une des lames et placez le centre de l’autre lame sur la goutte Poly-L-Lysine, en orientant les deux lames orthogonalement pour faciliter la séparation.

Après avoir incubé pendant 30 secondes, lavez la lame en l’immergeant une fois dans un bécher contenant de l’eau désionisée et en appliquant directement un jet d’eau deux fois. Séchez-les avec un flux d’azote gazeux et ces lames peuvent être stockées pendant environ six semaines à température ambiante dans des conditions sèches. Avant l’expérience, coupez un morceau de deux par deux, trois par deux ou trois par trois joints et collez-les sur la partie traitée par Poly-L-Lysine d’une lame de verre, en évitant que la lame de verre et les joints entrent en contact avec toute surface sale en plaçant la lame sur un tissu d’essuie-glace léger.

Maintenant, appuyez sur les joints avec une pointe de pipette pour les coller avec le plastique protecteur présent sur les joints. Ensuite, réchauffez le tampon septine à température ambiante. Décongelez les protéines en main et conservez-les sur la glace par la suite.

Ensuite, placez la lame avec des joints sur le système de photométrie de masse commercial contenant 19 microlitres de tampon septine et concentrez le microscope à l’aide de l’option autofocus. Refocus avec les nouveaux paramètres, en utilisant l’option autofocus. Pour créer un dossier de projet, cliquez sur Fichier suivi de Nouveau projet, puis pour charger un dossier de projet pour stocker des données, cliquez sur Fichier suivi de Charger le projet.

Ensuite, pipeter un microlitre d’échantillon à 19 microlitres de goutte tampon de septum. Mélangez et, pendant le mélange, évitez de toucher quoi que ce soit pour empêcher le mouvement de la lame. Enregistrez ensuite une vidéo de 6 000 images en cliquant sur Enregistrer.

Analysez les vidéos à l’aide du logiciel du fabricant pour obtenir la distribution de la masse protéique. Si les pics de différentes tailles d’hétéro-oligomères de septine se chevauchent trop ou si trop d’événements sont détectés, diminuez la concentration finale de septine et mesurez à nouveau. Et lorsque le nombre suffisant de molécules individuelles n’est pas mesuré, augmentez la concentration de septine et mesurez à nouveau.

Pour l’analyse de la septine, préparer le 5X darkSPB et un mélange de septine composé à 100% de septine foncée à une concentration six fois supérieure à la concentration finale souhaitée dans le tampon septine et un dithiothréitol millimolaire. Puis polymériser la septine en mélangeant de l’eau, 20%5X darkSPB et 16,67%septine mélange, dans cet ordre spécifique, et incuber pendant 30 minutes à température ambiante. Ajouter trois à cinq microlitres d’échantillon à une grille de microscopie électronique à décharge luminescente et incuber pendant une minute.

Maintenant, lavez la grille deux fois en ajoutant une goutte de tampon darkSPB et absorbez le liquide avec un papier filtre. Laver une fois avec de l’eau et incuber pendant 30 secondes avec de l’acétate d’uranyle à 2%. Ensuite, épongez la tache et séchez l’échantillon à l’air pendant quelques minutes.

Ensuite, imagez les faisceaux de septine à 120 kilovolts et les grossissements entre 5 000X et 60 000X avec une défocalisation d’un à deux micromètres. Les chromatogrammes HisTrap et StrepTrap ont montré que la fraction combinée allait du début du pic d’élution jusqu’à ce que l’absorbance se stabilise à environ 250 millilitres et 50 millilitres respectivement. Les bandes septines ont montré des intensités similaires dans l’électrophorèse sur gel dénaturant, ce qui suggère que les septines sont intactes.

En électrophorèse native, on a observé la bande majeure correspondant aux hétéro-oligomères intacts et une bande mineure correspondant aux trimors ou tétramères. Le poids moléculaire apparent des complexes marqués msfGFP est impossible à distinguer de celui des complexes non marqués. La photométrie de masse a détecté des octamères et des hexamères intacts de septines.

Un pic supplémentaire à 241 kilodaltons a indiqué la présence de deux protéines d’arachide, DSep1 et mEGFP-DSep2. Les images de microscopie électronique à transmission de complexes septiniques ont montré des bâtonnets d’hexamères et d’octamères. Les étiquettes msfGFP sont visibles sous forme de densités floues aux deux extrémités de septine humaine septine 2 msfGFP octamers_9i1.

De petits amas de protéines peuvent être observés dans le champ peu profond de la FRBR. La microscopie confocale a révélé de grands amas de structures filamenteuses flottantes. La microscopie électronique à transmission a montré de petits et grands faisceaux de septines correspondant aux amas observés par microscopie à fluorescence interne totale et microscopie confocale.

Nous recommandons de travailler sur la glace en tout temps pendant les purifications et d’ajouter des réactifs frais que nous spécifions dans le protocole. Nous nous intéressons aux interactions des septines dans le contexte de la cytokinèse. Nous avons reconstitué la septine avec des membranes modernes d’actine et de microtubules pour les étudier avec la microscopie et plusieurs tests biophysiques.

Nous utilisons les septines purifiées pour étudier comment les septines interagissent avec les filaments d’actine, les microtubules et les lipides. Et nous utilisons également les septines purifiées pour construire des cellules synthétiques où les septines facilitent la division cellulaire.