Name: Immunoétiquetage et comptage des synapses rubanées chez les cochlées de gerbille jeunes adultes et âgées (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-21T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Découvrez l'immunoétiquetage des synapses rubanées dans la cochlée de gerbille pour étudier l'intégrité synaptique liée à l'âge. Cette méthode rapide fournit des données quantitatives précieuses pour la recherche sur la perte auditive.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Les auteurs remercient Lichun Zhang d’avoir aidé à établir la méthode et l’unité de service de microscopie à fluorescence de l’Université Carl von Ossietzky d’Oldenburg pour l’utilisation des installations d’imagerie. Cette recherche a été financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) dans le cadre de la stratégie d’excellence de l’Allemagne -EXC 2177/1.

<ol><li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+and+age-related+hearing+loss%3A+new+perspectives+and+potential+therapies+%5Bversion+1%3B+peer+review%5BTitle%5D)+AND+%22F1000Research%22%5BJournal%5D)">Noise-induced and age-related hearing loss: new perspectives and potential therapies [version 1; peer review.</a> F1000Research. 6 (927), (2017).</li>
<li>Heeringa, A. N., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aging+cochlea%3A+Towards+unraveling+the+functional+contributions+of+strial+dysfunction+and+synaptopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing%22%5BJournal%5D)">The aging cochlea: Towards unraveling the functional contributions of strial dysfunction and synaptopathy.</a> Hearing. 376, 111-124 (2019).</li>
<li>Liberman, L. D., Wang, H., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opposing+gradients+of+ribbon+size+and+AMPA+receptor+expression+underlie+sensitivity+differences+among+cochlear-nerve%2Fhair-cell+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Opposing gradients of ribbon size and AMPA receptor expression underlie sensitivity differences among cochlear-nerve/hair-cell synapses.</a> The Journal of Neuroscience. 31 (3), 801-808 (2011).</li>
<li>Khimich, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hair+cell+synaptic+ribbons+are+essential+for+synchronous+auditory+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Hair cell synaptic ribbons are essential for synchronous auditory signalling.</a> Nature. 434 (7035), 889-894 (2005).</li>
<li>Pangršič, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+requires+otoferlin-dependent+efficient+replenishment+of+synaptic+vesicles+in+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hearing requires otoferlin-dependent efficient replenishment of synaptic vesicles in hair cells.</a> Nature Neuroscience. 13 (7), 869-876 (2010).</li>
<li>Meyer, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+of+synapse+number%2C+structure+and+function+in+the+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tuning of synapse number, structure and function in the cochlea.</a> Nature Neuroscience. 12 (4), 444-453 (2009).</li>
<li>Zhang, L., Engler, S., Koepcke, L., Steenken, F., Koeppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+gradients+of+ribbon+volume+and+AMPA-receptor+patch+volume+in+cochlear+afferent+synapses+on+gerbil+inner+hair+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Concurrent gradients of ribbon volume and AMPA-receptor patch volume in cochlear afferent synapses on gerbil inner hair cells.</a> Hearing Research. 364, 81-89 (2018).</li>
<li>Steenken, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+decline+in+cochlear+ribbon+synapses+and+its+relation+to+different+metrics+of+auditory-nerve+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Age-related decline in cochlear ribbon synapses and its relation to different metrics of auditory-nerve activity.</a> Neurobiology of Aging. 108, 133-145 (2021).</li>
<li>Merchan-Perez, A., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+differences+among+afferent+synapses+on+cochlear+hair+cells%3A+Correlations+with+spontaneous+discharge+rate%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural differences among afferent synapses on cochlear hair cells: Correlations with spontaneous discharge rate.</a> Journal of Comparative Neurology. 371 (2), 208-221 (1996).</li>
<li>Furman, A. C., Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+cochlear+neuropathy+is+selective+for+fibers+with+low+spontaneous+rates%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Noise-induced cochlear neuropathy is selective for fibers with low spontaneous rates.</a> Journal of Neurophysiology. 110 (3), 577-586 (2013).</li>
<li>Gilels, F., Paquette, S. T., Zhang, J., Rahman, I., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutation+of+Foxo3+causes+adult+onset+auditory+neuropathy+and+alters+cochlear+synapse+architecture+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Mutation of Foxo3 causes adult onset auditory neuropathy and alters cochlear synapse architecture in mice.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (47), 18409-18424 (2013).</li>
<li>Yin, Y., Liberman, L. D., Maison, S. F., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Olivocochlear+innervation+maintains+the+normal+modiolar-pillar+and+habenular-cuticular+gradients+in+cochlear+synaptic+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Olivocochlear innervation maintains the normal modiolar-pillar and habenular-cuticular gradients in cochlear synaptic morphology.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 15 (4), 571-583 (2014).</li>
<li>Paquette, S. T., Gilels, F., White, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise+exposure+modulates+cochlear+inner+hair+cell+ribbon+volumes%2C+correlating+with+changes+in+auditory+measures+in+the+FVB%2FnJ+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Noise exposure modulates cochlear inner hair cell ribbon volumes, correlating with changes in auditory measures in the FVB/nJ mouse.</a> Scientific Reports. 6 (1), 25056(2016).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Köppl, C., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volume+gradients+in+inner+hair+cell-auditory+nerve+fiber+pre-+and+postsynaptic+proteins+differ+across+mouse+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Volume gradients in inner hair cell-auditory nerve fiber pre- and postsynaptic proteins differ across mouse strains.</a> Hearing Research. 390, 107933(2020).</li>
<li>Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-neuron+labeling+in+the+cat+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Single-neuron labeling in the cat auditory nerve.</a> Science. 216 (4551), 1239-1241 (1982).</li>
<li>Bourien, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+auditory+nerve+fibers+to+compound+action+potential+of+the+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurophysiology%22%5BJournal%5D)">Contribution of auditory nerve fibers to compound action potential of the auditory nerve.</a> Journal of Neurophysiology. 112 (5), 1025-1039 (2014).</li>
<li>Sergeyenko, Y., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+cochlear+synaptopathy%3A+An+early-onset+contributor+to+auditory+functional+decline%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Age-related cochlear synaptopathy: An early-onset contributor to auditory functional decline.</a> The Journal of Neuroscience. 33 (34), 13686-13694 (2013).</li>
<li>Viana, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cochlear+neuropathy+in+human+presbycusis%3A+Confocal+analysis+of+hidden+hearing+loss+in+post-mortem+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">Cochlear neuropathy in human presbycusis: Confocal analysis of hidden hearing loss in post-mortem tissue.</a> Hearing Research. 327, 78-88 (2015).</li>
<li>Batrel, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+potentials+recorded+at+the+round+window+enable+the+detection+of+low+spontaneous+rate+fibers+in+gerbil+auditory+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Mass potentials recorded at the round window enable the detection of low spontaneous rate fibers in gerbil auditory nerve.</a> PLoS ONE. 12 (1), 0169890(2017).</li>
<li>Jeffers, P. W. C., Bourien, J., Diuba, A., Puel, J. -L., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noise-induced+hearing+loss+in+gerbil%3A+Round+window+assays+of+synapse+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Noise-induced hearing loss in gerbil: Round window assays of synapse loss.</a> Frontiers in Cellular Neuroscience. 15, 699978(2021).</li>
<li>Gleich, O., Semmler, P., Strutz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavioral+auditory+thresholds+and+loss+of+ribbon+synapses+at+inner+hair+cells+in+aged+gerbils%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Behavioral auditory thresholds and loss of ribbon synapses at inner hair cells in aged gerbils.</a> Experimental Gerontology. 84, 61-70 (2016).</li>
<li>Cheal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gerbil%3A+A+unique+model+for+research+on+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Aging+Research%22%5BJournal%5D)">The gerbil: A unique model for research on aging.</a> Experimental Aging Research. 12 (1), 3-21 (1986).</li>
<li>Gates, G. A., Mills, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Presbycusis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Lancet%22%5BJournal%5D)">Presbycusis.</a> The Lancet. 366 (9491), 1111-1120 (2005).</li>
<li>Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hearing+sensitivity+of+the+gerbil%2C+Meriones+unguiculatis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+the+Acoustical+Society+of+America%22%5BJournal%5D)">Hearing sensitivity of the gerbil, Meriones unguiculatis.</a> The Journal of the Acoustical Society of America. 59 (5), 1222-1226 (1976).</li>
<li>Müller, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cochlear+place-frequency+map+of+the+adult+and+developing+gerbil%5BTitle%5D)+AND+%22Hearing+Research%22%5BJournal%5D)">The cochlear place-frequency map of the adult and developing gerbil.</a> Hearing Research. 94 (1-2), 148-156 (1996).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Reijntjes, D. O. J., Breitzler, J. L., Persic, D., Pyott, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+the+intact+rodent+organ+of+Corti+for+RNAscope+and+immunolabeling%2C+confocal+microscopy%2C+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of the intact rodent organ of Corti for RNAscope and immunolabeling, confocal microscopy, and quantitative analysis.</a> STAR Protocols. 2 (2), 100544(2021).</li>
<li>Hickman, T. T., Hashimoto, K., Liberman, L. D., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+migration+and+reorganization+after+noise+exposure+suggests+regeneration+in+a+mature+mammalian+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Synaptic migration and reorganization after noise exposure suggests regeneration in a mature mammalian cochlea.</a> Scientific Reports. 10 (1), 19945(2020).</li>
<li>Gray, D. A., Woulfe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipofuscin+and+aging%3A+a+matter+of+toxic+waste%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+Aging+Knowledge+Environment%3A+SAGE+KE%22%5BJournal%5D)">Lipofuscin and aging: a matter of toxic waste.</a> Science of Aging Knowledge Environment: SAGE KE. 2005 (5), 1(2005).</li>
<li>Li, H. -S., Hultcrantz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+degeneration+of+the+organ+of+Corti+in+two+genotypes+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22ORL%3B+Journal+for+Oto-rhino-laryngology+and+Its+Related+Specialties%22%5BJournal%5D)">Age-related degeneration of the organ of Corti in two genotypes of mice.</a> ORL; Journal for Oto-rhino-laryngology and Its Related Specialties. 56 (2), 61-67 (1994).</li>
<li>Kobrina, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+anatomical+and+physiological+markers+of+auditory+system+degeneration+with+behavioral+hearing+assessments+in+a+mouse+%28Mus+musculus%29+model+of+age-related+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiology+of+Aging%22%5BJournal%5D)">Linking anatomical and physiological markers of auditory system degeneration with behavioral hearing assessments in a mouse (Mus musculus) model of age-related hearing loss.</a> Neurobiology of Aging. 96, 87-103 (2020).</li>
<li>Moreno-García, A., Kun, A., Calero, O., Medina, M., Calero, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+the+role+of+lipofuscin+in+age-related+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">An overview of the role of lipofuscin in age-related neurodegeneration.</a> Frontiers in Neuroscience. 12, 464(2018).</li>
<li>Jensen, T., Holten-Rossing, H., Svendsen, I., Jacobsen, C., Vainer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+myocardial+tissue+with+digital+autofluorescence+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology+Informatics%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of myocardial tissue with digital autofluorescence microscopy.</a> Journal of Pathology Informatics. 7, 15(2016).</li>
<li>Kalluri, R., Monges-Hernandez, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+in+the+size+of+inner+hair+cell+ribbons+emerge+before+the+onset+of+hearing+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Association+for+Research+in+Otolaryngology%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients in the size of inner hair cell ribbons emerge before the onset of hearing in rats.</a> Journal of the Association for Research in Otolaryngology. 18 (3), 399-413 (2017).</li>
<li>Wu, P. Z., Liberman, L. D., Bennett, K., de Gruttola, V., O'Malley, J. T., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+neural+degeneration+in+the+human+cochlea%3A+Evidence+for+hidden+hearing+loss+in+the+aging+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary neural degeneration in the human cochlea: Evidence for hidden hearing loss in the aging ear.</a> Neuroscience. 407, 8-20 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Avec la méthode décrite dans ce protocole, il est possible d’immunomarquer les IHC et les structures synaptiques dans les cochlées des gerbilles jeunes adultes et âgées, d’identifier les synapses fonctionnelles présumées par colocalisation d’éléments pré- et postsynaptiques, de les attribuer à des IHC individuels et de quantifier leur nombre, leur volume et leur emplacement. Les anticorps utilisés dans cette approche ont également marqué les cellules ciliées externes (OHC; myoVIIa) et leurs rubans présynaptiques. En outr...

La perte auditive liée à l’âge est l’une des maladies les plus répandues au monde qui touche plus d’un tiers de la population mondiale âgée de 65 ans et plus1. Les causes sous-jacentes sont encore débattues et activement étudiées, mais peuvent inclure la perte des synapses spécialisées reliant les cellules ciliées internes (IHC) aux fibres nerveuses auditives afférentes2. Ces synapses rubanées comprennent une structure présynaptique qui a des vésicules remplies du neurotransmetteur glutamate attaché à elle, ainsi que des récepteurs postsynaptiques α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique acide (AMPA) glutamate 3,4,5. Dans la gerbille, ~ 20 fibres nerveuses auditives afférentes entrent en contact avec un IHC 6,7,8. Les fibres de l’IHC faisant face au modiolus s’opposent aux grands rubans synaptiques, tandis que les fibres se connectant du côté pilier de l’IHC font face à de petits rubans synaptiques (c’est-à-dire chez les chats9, les gerbilles7, les cochons d’Inde10 et les souris 3,11,12,13,14). De plus, chez la gerbille, la taille des rubans présynaptiques et des patchs de glutamate postsynaptique est positivement corrélée 7,14. Les fibres qui s’opposent aux grands rubans du côté modiolaire de l’IHC sont de petit calibre et ont de faibles taux spontanés et des seuils élevés15. Il existe des preuves que les fibres à faible taux spontané sont plus vulnérables à l’exposition au bruit10 et aux médicaments ototoxiques16 que les fibres à faible seuil spontanées élevées, qui sont situées du côté pilier des IHC15.
La perte de synapses rubanées est le premier événement dégénératif de la perte auditive liée à l’âge du neural cochléaire, tandis que la perte de cellules ganglionnaires en spirale et de leurs fibres nerveuses auditives afférentes est à la traîne par rapport à17,18. Les corrélats électrophysiologiques comprennent les enregistrements des réponses auditives du tronc cérébral17 et des potentiels d’actioncomposés 8; cependant, ceux-ci ne reflètent pas les subtilités de la perte de synapses, car les fibres à faible taux spontané ne contribuent pas à ces mesures16. Les mesures électrophysiologiques les plus prometteuses sont l’indice neuronal dérivé du potentiel de masse19 et la réponse temporelle du péristimulus20. Cependant, ceux-ci ne sont fiables que si l’animal n’a pas d’autres pathologies cochléaires, au-delà de la perte de fibres nerveuses auditives, qui affectent l’activité des fibres nerveuses auditives restantes8. De plus, les seuils évalués comportementalement chez la gerbille n’étaient pas corrélés avec les nombres de synapses21. Par conséquent, une quantification fiable des synapses ruban survivantes et, par conséquent, du nombre de fibres nerveuses auditives fonctionnelles n’est possible que par un examen direct du tissu cochléaire.
La gerbille mongole (Meriones unguiculatus) est un modèle animal approprié pour étudier la perte auditive liée à l’âge. Il a une courte durée de vie, a une audition à basse fréquence similaire à celle des humains, est facile à entretenir et présente des similitudes avec les pathologies humaines liées à la perte auditive liée à l’âge 2,22,23,24. Les gerbilles sont considérées comme âgées lorsqu’elles atteignent l’âge de 36 mois, soit vers la fin de leur durée de vie moyennede 22 ans. Il est important de noter qu’une perte de synapses rubans liée à l’âge a été démontrée chez des gerbilles élevées et vieillies dans des environnements calmes 8,21.
Ici, un protocole pour immunomarquer, disséquer et analyser les cochlées de gerbilles d’âges différents, des jeunes adultes aux personnes âgées, est présenté. Des anticorps dirigés contre des composants de la presynapse (CtBP2), des patchs de récepteurs postsynaptiques du glutamate (GluA2) et des IHC (myoVIIa) sont utilisés. Un quencher d’autofluorescence est appliqué qui réduit le fond dans les cochlées vieillies et laisse le signal de fluorescence intact. En outre, une description est donnée de la façon de disséquer la cochlée pour examiner à la fois l’épithélium sensoriel et la stria vascularis. La longueur cochléaire est mesurée pour permettre la sélection d’emplacements cochléaires distincts qui correspondent aux meilleures fréquences spécifiques25. La quantification des nombres synaptiques est réalisée avec le logiciel gratuit ImageJ26. Une quantification supplémentaire des volumes et des emplacements des synapses au sein du HC individuel est effectuée à l’aide d’un logiciel personnalisé écrit en Matlab. Ce logiciel n’est pas mis à la disposition du public, car les auteurs n’ont pas les ressources nécessaires pour fournir une documentation et un support professionnels.

<table><tbody><tr><td>Albumine Fraction V sans biotine</td><td>Carl Roth</td><td>0163.2</td><td></td></tr><tr><td>anti-CtBP2 (souris monoclonale IgG1)</td><td>BD Biosciences, Eysins</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>anti-GluA2 (souris monoclonale IgG2a)</td><td>Millipore</td><td>MAB39</td><td></td></tr><tr><td>anti-souris (IgG1)-AF 488</td><td>Molecular Probes Inc.</td><td>A21121</td><td></td></tr><tr><td>anti-MyosinVIIa (IgG polyclonal de lapin)</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25e6790</td><td></td></tr><tr><td>Porte-lame & Disjoncteur - Mâchoires plates Outils de</td><td>science fine</td><td>10052-11</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux artériels Bonn - Pointe de boule</td><td>Outils de science fine</td><td>14086-09</td><td></td></tr><tr><td>Epaisseur de lamelle 1.5H, 24 x 60 mm</td><td>Carl Roth</td><td>LH26.1</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgicale jetable</td><td>Henry Schein</td><td>0473</td><td></td></tr><tr><td>âne anti-lapin (IgG)-AF647</td><td>Life Technologies-Sondes moléculaires</td><td>A-31573</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 - Pince fine</td><td>Outils de science fine</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Pince Dumont #5SF</td><td>Outils de science fine</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, absolu 99,8 %</td><td>Fisher Scientific</td><td>12468750</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Carl Roth</td><td>8040.2</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plume Lame Double Edge</td><td>PLANO</td><td>112-9</td><td></td></tr><tr><td>G19 Canule</td><td>Henry Schein</td><td>9003633</td><td></td></tr><tr><td>chèvre anti-souris (IgG2a)-AF568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21134</td><td></td></tr><tr><td>Heparine</td><td>Ratiopharm</td><td>N68542.04</td><td></td></tr><tr><td>Huygens Essentials</td><td>Scientific Volume Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fiji</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Immersol, Huile d’immersion 518F</td><td>Carl Zeiss</td><td>10539438</td><td></td></tr><tr><td>Intrafix Primeline Classic, 150 cm (mit Datamatrix Code auf der Sterilverpackung)</td><td>Braun</td><td>4062957E</td><td></td></tr><tr><td>ISM596D</td><td>Ismatec</td><td></td><td>Pompe péristaltique</td></tr><tr><td>KL 1600 LED</td><td>Schott</td><td>150.600</td><td>Source lumineuse pour stéréomicroscope</td></tr><tr><td>Leica Suite d’applications X</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Système Leica TCS SP8</td><td>Leica Microsystem CMS GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matlab</td><td>The Mathworks Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mayo Ciseaux Carbure de tungston ToghCut</td><td>Fine Science Tools</td><td>14512-17</td><td></td></tr><tr><td>Mini-100 Orbital-Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI-M100</td><td>pour une utilisation en environnement froid</td></tr><tr><td>Narcoren (pentobarbital)</td><td>Boehringer Ingelheim Vetmedica GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse Ni-Ei</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elements</td><td>Nikon Europe B.V.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Carl Roth</td><td>0335.3</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri sans évents</td><td>Avantor VWR</td><td>390-1375</td><td></td></tr><tr><td><fort>Saline tamponnée au phosphate :</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphate disodique</td><td>AppliChem</td><td>A1046</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate monopotassique</td><td>Carl Roth</td><td>3904.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Carl Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434-M</td><td></td></tr><tr><td>Récipients à bouchon à vis</td><td>Sarstedt</td><td>75.562.300</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Carl Roth</td><td>K305.1</td><td></td></tr><tr><td>Student Adson Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>91106-12</td><td></td></tr><tr><td>Student Halsted-Mosquito Hemostat</td><td>Fine Science Tools</td><td>91308-12</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope à adhérence Superfrost</td><td>Epredia</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Triton&nbsp ; X</td><td>Carl Roth</td><td>3051.2</td><td></td></tr><tr><td>TrueBlack Lipofuscin Autofluorescence Quencher</td><td>Biotium</td><td>23007</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Ciseaux à ressort, 3mm</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-00</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Antifade Montage Medium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>0002819000</td><td></td></tr><tr><td>VX 7 Accessoire de parabole pour Vibrax VXR basic</td><td>IKA</td><td>953300</td><td></td></tr><tr><td>Wild TYP 355110 (Stéréomicroscope)</td><td>Wild Heerbrugg</td><td></td><td>n’est plus disponible</td></tr></tbody></table>

immunoétiquetage et comptage des synapses rubanées chez les cochlées de gerbille jeunes adultes et âgées

Immunolabeling and Counting Ribbon Synapses in Young Adult and Aged Gerbil Cochleae

La perte de synapses ruban reliant les cellules ciliées internes et les fibres nerveuses auditives afférentes est supposée être l’une des causes de la perte auditive liée à l’âge. La méthode la plus courante pour détecter la perte de synapses rubanées est l’immunomarquage, car elle permet un échantillonnage quantitatif à partir de plusieurs emplacements tonotopiques dans une cochlée individuelle. Cependant, les structures d’intérêt sont enfouies profondément à l’intérieur de la cochlée osseuse. Les gerbilles sont utilisées comme modèle animal pour la perte auditive liée à l’âge. Ici, les protocoles de routine pour la fixation, l’immunomarquage des montures entières cochléaires de gerbille, l’imagerie confocale et la quantification du nombre et des volumes de synapses du ruban sont décrits. En outre, les défis particuliers associés à l’obtention de bons matériaux auprès de personnes vieillissantes précieuses sont mis en évidence. 
Les gerbilles sont euthanasiées et perfusées cardiovasculairement, ou leurs bulles tympaniques sont soigneusement disséquées hors du crâne. Les cochlées sont ouvertes à l’apex et à la base et directement transférées au fixateur. Quelle que soit la méthode initiale, les cochlées sont postfixées puis décalcifiées. Le tissu est ensuite marqué avec des anticorps primaires contre les structures pré- et postsynaptiques et les cellules ciliées. Ensuite, les cochlées sont incubées avec des anticorps secondaires marqués par fluorescence qui sont spécifiques contre leurs anticorps primaires respectifs. Les cochlées des gerbilles âgées sont ensuite traitées avec un quencher à autofluorescence pour réduire la fluorescence de fond généralement importante des tissus des animaux plus âgés. 
Enfin, les cochlées sont disséquées en 6 à 11 segments. Toute la longueur cochléaire est reconstruite de manière à ce que des emplacements cochléaires spécifiques puissent être déterminés de manière fiable entre les individus. Les piles d’images confocales, acquises séquentiellement, aident à visualiser les cellules ciliées et les synapses aux endroits choisis. Les piles confocales sont déconvolvées et les synapses sont soit comptées manuellement à l’aide d’ImageJ, soit une quantification plus étendue des structures synaptiques est effectuée avec des procédures d’analyse d’images écrites sur mesure dans Matlab.

Les cochlées ont été soit récoltées après perfusion cardiovasculaire avec fixateur de l’animal entier, soit rapidement disséquées après euthanasie de l’animal et fixées par immersion. Avec cette dernière méthode, les IHC sont restés en place pendant la dissection, alors que, en cas de perfusion infructueuse et donc de tissu insuffisamment fixé, l’épithélium sensoriel était souvent détruit. Notez que les auteurs ont rencontré des cas où la fixation des cochlées après perfusion transcardique était insuffisante alors que la...

Un protocole pour le traitement des cochlées de gerbilles jeunes adultes et âgées par immunomarquage des structures synaptiques afférentes et des cellules ciliées, extinction de l’autofluorescence dans les tissus âgés, dissection et estimation de la longueur des cochlées et quantification des synapses dans des piles d’images obtenues par imagerie confocale est présenté.

Immunoétiquetage et comptage des synapses rubanées chez les cochlées de gerbille jeunes adultes et âgées

The loss of ribbon synapses connecting inner hair cells and afferent auditory nerve fibers is assumed to be one cause of age-related hearing loss. The ...

Ce protocole permet d’évaluer l’intégrité synaptique dans la cochlée de la gerbille de tous âges. Ceci est important pour la recherche fondamentale sur les problèmes auditifs, en particulier ceux dus au vieillissement. Le protocole est relativement rapide et fournit des données quantitatives à plusieurs endroits le long de la cochlée.En outre, il aborde un problème spécifique de vieillissement des tissus en utilisant un quencher d’autofluorescence. La dégénérescence des synapses est le premier signe de perte de fonction dans la cochlée. La quantification est un outil important dans la recherche visant à développer des outils de diagnostic non invasifs pour la synaptopathie.La dissection cochléaire est la partie la plus cruciale qui nécessite de la pratique, il est donc préférable de commencer par des cochli non expérimentaux. Commencez par enlever les bulles. Coupez l’os avec des ciseaux ou craquez l’os avec une pince et retirez-le avec une pince pour atteindre la cochlée.Enlevez les canaux malleus, incus et semi-circulaires. Retirez soigneusement l’os recouvrant l’apex de la cochlée et grattez l’os cochléaire avec une pince pour faire de petits trous à l’apex et dans le virage basal ou percez soigneusement des trous aux deux endroits. Transférez immédiatement les bulles dans au moins 50 millilitres de fixateur froid.Pour couper le cochli en deux, placez un morceau de lame de rasoir plus long que la longueur enroulée de la cochlée dans un support de lame. Ensuite, placez la cochlée dans une boîte de Petri sous un stéréomicroscope. Coupez l’excès de tissu avec une lame de rasoir ou avec de fins ciseaux.Maintenez la cochlée en place avec une pince fine et coupez-la en deux le long du modiolus. Préparez une solution à 5% du quencher d’autofluorescence en le mélangeant avec de l’éthanol à 70%. Placez le cochli dans cette solution et incubez-le pendant une minute à température ambiante sur un agitateur, puis lavez trois fois avec un millilitre de PBS pendant cinq minutes.Pour la dissection de la cochlée, collectez deux pinces fines, des pinces super fines, des vannas, des ciseaux à ressort, un porte-lame, une lame de rasoir et remplissez la boîte de Petri en polystyrol et son couvercle avec du PBS. Casser des morceaux de la lame de rasoir pour obtenir une surface de coupe de deux à quatre millimètres. Coupez la cochlée en deux comme indiqué dans la section pour la préparation des tissus.Fixez soigneusement la moitié cochléaire avec la pince de manière à ce que le bord coupé soit tourné vers le haut. Utilisez de fins ciseaux à ressort pour couper l’os de la cochlée au-dessus de l’hélicotréma recouvrant l’apex. Ensuite, utilisez des ciseaux pour isoler le tour apical en coupant à travers le modiolus et le nerf auditif et scala vestibuli.Faites deux coupures de chaque côté de l’os cochléaire ci-dessus, ou si la stria vascularis n’est pas nécessaire pour une évaluation plus approfondie, directement à travers la stria vascularis du virage moyen. Utilisez la lame de rasoir pour séparer les pièces cochléaires. Alternativement, couper entre l’organe de Corti et la stria vascularis.Laissez la stria vascularis reliée au ligament spiralé et retirez l’os décalcifié à l’aide d’une pince. Ensuite, transférez les morceaux cochléaires dans un couvercle de boîte de Petri rempli de PBS. Enlevez l’excès de tissu sur le pilier et les côtés modiolaires de sorte que l’ensemble des supports repose plus tard sur la glissière aussi plat que possible.Les gros morceaux cochléaires, en particulier ceux provenant du tour basal, doivent être coupés en deux morceaux. Retirez soigneusement la membrane tectoriale avec une pince ultra-fine. Placez les pièces cochléaires sur une glissière dans une goutte de support de montage, en veillant à ce que l’organe de Corti soit tourné vers le haut.Déplacez la pièce cochléaire dans le plan sagittal et recherchez l’invagination du limbe spiralé à proximité des cellules ciliées internes. Cette invagination du limbe spiralé peut être vue plus clairement dans les pièces cochléaires moyennes et basales. Transférez toute la cochlée et toute la stria vascularis sur la lame du microscope en répétant ces étapes.Couvrez la glissière et ajoutez du vernis à ongles noir sur les bords pour sceller. Sécher dans l’obscurité et les stocker à quatre degrés Celsius. Ouvrez une copie des piles déconvolved dans le logiciel ImageJ chargé avec le plugin BioVoxxel.Divisez les couches en cliquant sur Image, puis sur Couleur, puis sur Fractionner les couches. Fusionnez-les en cliquant sur Image, puis sur Couleur, puis sur Fusionner les couches pour attribuer différentes couleurs. Convertissez l’image en pile RVB en cliquant sur Image, puis allez dans Couleur et cliquez sur Pile en RVB.Ajustez la luminosité et le contraste en cliquant sur Image, Réglage, puis Luminosité/Contraste. Utilisez l’auto ou le curseur pour vous assurer que les structures pré-et post-synaptiques et les étiquettes internes des cellules ciliées sont distinctes de l’arrière-plan. Étiquetez cinq cellules ciliées internes avec l’outil texte en cliquant sur l’emplacement souhaité dans la pile.Ensuite, accédez à Analyser, puis Outils, puis sélectionnez Gestionnaire de retour sur investissement. Cochez les étiquettes des cases à cocher pour étiqueter les points avec un numéro. Zoomez sur la cellule ciliée interne d’intérêt.Faites un clic droit sur l’outil de pointage pour choisir le mode Multipoint. Faites défiler la dimension Z et comptez les synapses fonctionnelles du ruban, qui sont identifiées par un ruban pré-synaptique en juxtaposition à un patch de glutamate post-synaptique. Après avoir sélectionné toutes les structures d’intérêt, cliquez sur Ajouter le gestionnaire de retour sur investissement, puis cliquez sur le nom arbitraire et choisissez Renommer.Avec l’outil manuel, ajustez l’image pour afficher complètement la cellule ciliée interne suivante. Passez de l’outil Multipoint à l’outil Point pour éviter d’ajouter plus de ponctuation aux données précédemment stockées. Cliquez sur une structure d’intérêt dans la cellule ciliée interne suivante et passez à l’outil Multipoint.Continuez à ajouter la synapse du ruban fonctionnel dans le gestionnaire de retour sur investissement jusqu’à ce que toutes les cellules ciliées internes soient évaluées. Cliquez sur un ensemble de données dans le gestionnaire de retour sur investissement, puis sur Mesure. Attendez qu’une nouvelle fenêtre apparaisse qui répertorie les points de données mesurés et cliquez sur Fichier et Enregistrer sous pour enregistrer cette liste en tant que feuille de calcul.Enregistrez l’image en activant Afficher tout dans le Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Aplatir pour ajouter définitivement les étiquettes de points à la pile et cliquez sur Accepter pour fermer en enregistrant les modifications. Les projections de la pile Z de la cochlée d’une jeune gerbille âgée de 10 mois montrent que les cellules ciliées internes marquées à la myosine 7A soulignées ici par des lignes pointillées blanches contrastaient fortement avec l’arrière-plan.Les rubans pré-synaptiques ont été étiquetés avec deux anti-CtBP2 en vert, tandis que les patchs de glutamate post-synaptiques ont été étiquetés avec anti-GluA2 en rouge. La cochlée d’une vieille gerbille âgée de 38 mois a été traitée avec le quencher d’autofluorescence et a montré des cellules ciliées internes distinctes avec des structures pré et post-synaptiques clairement visibles. Pour tester la stabilité de l’immunomarquage, le même morceau de cochlée de la jeune gerbille a été imagé après trois mois et 29 mois et demi.Malgré le rapport signal/bruit réduit, les synapses fonctionnelles étaient distinctes et quantifiables. Même si une coupe échoue, montez le morceau de tissu restant pour estimer plus tard la longueur cochléaire complète avec le plus de précision. Les données de ce protocole sont particulièrement précieuses si elles sont précédées de tests auditifs électrophysiologiques ou psychophysiques, puis corrélées individuellement avec eux.

immunolabeling-counting-ribbon-synapses-young-adult-aged-gerbil

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

Nous démontrons l'utilisation du pistolet à gènes à introduire des colorants fluorescents, tels que DII, en neurones dans des tranches de cerveau de rongeurs et des primates non humains d'âges différents. Dans ce cas particulier, nous utilisons des souris adultes (3-6 mois) et adultes singes cynomologus (9-15 ans). Cette technique, décrite initialement par le laboratoire du Dr Lichtman...

Étiquetage DiOLISTIC des neurones à partir de rongeurs et non-humains tranches de cerveau des primates

Ce protocole de détails comment quantifier le numéro de synapses neuronales dans la culture à la fois dissociées et dans les sections du cerveau en utilisant l'immunocytochimie. En utilisant des anticorps spécifiques du compartiment, nous appelons les terminaux présynaptiques ainsi que des sites de spécialisation post-synaptiques. Nous définissons les synapses comme des points de colocalisation entre les signaux générés par ces marqueurs.

Synapses Quantifier: un dosage à base d&#39;immunocytochimie Quantifier Nombre Synapse

Whole-cell patch-clamp enregistrements de dendrites auditives fibres nerveuses au niveau des synapses du ruban des cellules ciliées internes de la cochlée de mammifère.

Enregistrements postsynaptiques au dendrites afférentes Contacter cochléaires cellules ciliées internes: Communiqué multivésiculaires surveillance à une synapse ruban

Cette vidéo présente une méthode d’évaluation des synapses de ruban dans des régions spécifiques de la cochlée de souris. Il utilise des techniques d’immunomarquage et d’imagerie confocale pour identifier les synapses fonctionnelles dans différentes régions de fréquence à chaque tour cochléaire.

Évaluation des synapses en ruban dans des régions de fréquence spécifiques de la cochlée de souris

La localisation et la distribution des protéines fournissent des informations importantes pour la compréhension de leurs fonctions cellulaires. La résolution spatiale supérieure de la microscopie électronique (EM) peut être utilisé pour déterminer la localisation subcellulaire d'un antigène donné à la suite immunohistochimie. Pour les tissus du système nerveux central (SNC), la préservation de l'intégrité structurelle tout en maintenant antigénicité a été particulièrement difficile en EM études.

Étiquetage immunologique post-enrobage des protéines synaptiques dans l&#39;hippocampe cultures Slice

Cet article vidéo illustre un protocole complet permettant de détecter et de quantifier tous les stades de la neurogenèse de l’hippocampe adulte au sein d’une même section de tissu. Nous avons élaboré une méthode pour surmonter les limites de l’immunofluorescence multiple indirecte qui surviennent lorsque des anticorps appropriés de différentes espèces hôtes ne sont pas disponibles.

Immunohistochimie et d&#39;étiquetage multiple avec des anticorps de l&#39;espèce hôte mêmes pour l&#39;étude des adultes hippocampe neurogenèse

Nous présentons une méthode pour isoler l'organe de Corti adulte que trois tours intactes cochléaires (APEX, milieu, et de la base). Nous démontrons également une procédure pour immunocoloration avec des anticorps marqués par fluorescence. Ensemble, ces techniques permettent l'étude des cellules ciliées, cellules de soutien, et d'autres types de cellules trouvées dans la cochlée.

Mont entiers Dissection et immunofluorescence de la cochlée de souris adultes

Les neurones sensoriels olfactifs expriment une grande variété de molécules de tri d'axones pour établir des circuits neuronaux appropriés. Ce protocole décrit une méthode de coloration immunohistochimique pour visualiser les expressions combinatoires des molécules de tri d'axones aux extrémités axonaires des neurones sensoriels olfactifs.

Immunomarquage quadruple de l&#39;ampoule olfactive pour la visualisation des codes d&#39;identité moléculaire des axes sensoriels olfactifs

Ce manuscrit décrit un protocole expérimental pour évaluer les caractéristiques morphologiques et l'état fonctionnel des synapses de ruban chez les souris normales. Le modèle actuel convient également aux modèles à synaptopathie cochléaire induits par le bruit et liés à l'âge. Les résultats corrélatifs des études précédentes de souris sont également discutés.

Évaluation morphologique et fonctionnelle des synapses de ruban aux régions spécifiques de fréquence de la Cochlea de souris

Cet article présente une méthode modifiée de préparation de surface cochléaire qui exige la décalcification et l'utilisation d'un adhésif de cellules et de tissu pour adhérer aux morceaux d'épithélium cochléaire aux feuillets ronds de couverture de 10 mm pour l'immunohistochimie dans les cochléées adultes de souris.

Préparation de surface cochléaire dans la souris adulte

Un microscope à feuille de lumière a été développé pour imager et numériser la cochlée entière.

Imagerie de la cochlée vieillissante avec la microscopie à fluorescence à feuille de lumière

Découvrez l'immunoétiquetage des synapses rubanées dans la cochlée de gerbille pour étudier l'intégrité synaptique liée à l'âge. Cette méthode rapide fournit des données quantitatives précieuses pour la recherche sur la perte auditive.

Immunoétiquetage et comptage des synapses rubanées chez les cochlées de gerbille jeunes adultes et âgées

Explorer plus de vidéos