Caractérisation viscoélastique rapide du mucus des voies respiratoires à l’aide d’un rhéomètre de paillasse

Les maladies muco-obstructives sont caractérisées par une viscosité anormale du mucus des voies respiratoires. Le protocole montre comment utiliser la rhéologie pour quantifier la viscosité du mucus et analyser les données pour tester les traitements ciblant le mucus. La rhéologie du mucus fournit des biomarqueurs quantitatifs spécifiques.

L’utilisation d’un dispositif de paillasse simplifie considérablement la logistique de la mesure de ces biomarqueurs dans des échantillons cliniques tels que des échantillons d’expectorations humaines. L’utilisation de la rhéologie du mucus comme outil de diagnostic des maladies obstructives reste un défi. Un nombre croissant de preuves montre une forte corrélation entre les propriétés rhéologiques, l’inflammation et l’infection bactérienne.

Le mucus est toujours présent à l’interface du corps où il lubrifie et joue un rôle protecteur. La rhéologie du mucus peut être appliquée à d’autres systèmes comme les voies gastro-intestinales et génitales. Pour obtenir des mesures précises, une manipulation et un placement corrects de l’échantillon sont essentiels.

Une démonstration visuelle peut améliorer la précision de ce test. Kendall Shaffer, technicienne de recherche du laboratoire de l’air, fera la démonstration de cette procédure. Commencez par trier les expectorations ou le mucus des voies respiratoires collectés dans des gobelets stériles.

Dans le cas des expectorations, retirer l’excès de salive de l’échantillon immédiatement après le prélèvement. Placez les échantillons sur de la glace pour le transport. Limitez le temps de transport à moins de quatre heures.

Analysez les échantillons au moment du prélèvement. Homogénéiser le mucus en piquant doucement de haut en bas trois à cinq fois avec une pipette à déplacement positif. Ou pipette directement dans les tubes de microcentrifugation.

Conservez les échantillons à 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient traités. Aliquoter les échantillons à stocker dans des volumes supérieurs ou égaux à 500 microlitres afin d’assurer un volume suffisant pour les expériences. Avant de faire la citation, pipeter directement les expectorations ou le mucus frais et congelés ou homogénéiser les spécimens.

Réparez les aliquotes requises pour les mesures et les traitements répétés. Incuber les aliquotes à tester à 37 degrés Celsius pendant au moins cinq minutes avant la mesure. Pour tester les agents pharmacologiques, utilisez des concentrations élevées de solutions mères pour éviter la dilution de l’échantillon.

Ajouter entre 1 % et 10 % de volume du réactif souhaité directement sur l’échantillon. Assurez-vous qu’aucune goutte du composé ne reste sur le côté du tube. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant la durée requise, pour permettre une réaction chimique.

Mélanger l’échantillon de mucus et le réactif en faisant glisser le fond du tube de microcentrifugation toutes les deux minutes pour permettre une pénétration progressive du réactif dans l’échantillon de mucus sans compromettre le réseau de mucine. Lorsque vous comparez plusieurs réactifs médicamenteux, assurez-vous que le temps d’incubation est similaire. Allumez la machine et initialisez le logiciel.

Sélectionnez une nouvelle mesure. Entrez le numéro d’identification de l’échantillon sous ID de mesure et le nom de l’opérateur sous Opérateur pour continuer. Entrez des informations ou des commentaires supplémentaires sous Commentaires.

Sélectionnez un jeu de géométrie et inspectez soigneusement les grandes et petites plaques pour vous assurer que les plaques sont propres et en parfait état. Insérez fermement la grande plaque sur la chaire inférieure. Insérez doucement la petite plaque sur la chaire supérieure et verrouillez la plaque en la tournant légèrement jusqu’à entendre un clic, ce qui indique que la plaque est correctement serrée.

Notez que l’oscillation libre de la plaque supérieure est normale. Attendez que la température atteigne la valeur cible de 37 degrés Celsius. Lancez ensuite l’étalonnage automatique, à l’invite du logiciel.

À l’aide d’une pipette à déplacement positif, pipettez lentement entre 250 et 500 microlitres de l’échantillon au centre de la grande plaque inférieure. Une fois déposés sur la plaque, les échantillons visqueux adopteront une forme de dôme, tandis que les échantillons très élastiques peuvent nécessiter une séparation physique. Abaissez la tête de mesure transportant la petite plaque via le logiciel et observez l’échantillon.

S’il est correctement chargé sur la plaque inférieure, l’échantillon entrera en contact et sera centré entre les deux plaques. Pour vous assurer que l’échantillon comble l’espace, utilisez la fonction d’écart réduit jusqu’à ce que l’échantillon ne soit plus en forme de biconcave ou aligné avec le bord de la plaque. La fonction d’écart réduit abaisse l’arête de mesure par incréments de 0,1 millimètre et est limitée à 7 incréments.

S’il reste un espace après les 7 incréments, cliquez sur Rétablir l’installation pour revenir à la position initiale et ajuster la position et le volume de l’échantillon. Si l’écart est excessivement réduit, retirez l’excès d’échantillon avec une spatule par un mouvement circulaire le long du bord de la plaque supérieure. Coupez doucement l’excès d’échantillon pour éviter les contraintes de cisaillement.

Abaissez le couvercle de protection pour éviter toute projection accidentelle de fluides contaminés pendant l’oscillation. Pour lancer la mesure, cliquez sur Démarrer l’analyse. Un cycle entier prendra de quatre à sept minutes.

Évitez de parler fort et de toucher l’appareil ou le banc pendant toute la durée du cycle. Un environnement calme est crucial pendant les deux premières minutes. Une fois le cycle terminé, cliquez sur Suivant pour augmenter la tête de mesure et générer le rapport d’analyse de l’échantillon.

Une fois que la tête de mesure est complètement rétractée, soulevez le couvercle de protection. Jetez l’échantillon et retirez soigneusement les plaques. Nettoyez et désinfectez les assiettes à l’eau tiède et au savon.

Les caractéristiques viscoélastiques de huit mégadaltons peO ont été mesurées à cinq concentrations et directement comparées entre le rhéomètre de paillasse évalué et un rhéomètre en vrac traditionnel. Contrairement aux solutions peO, le mucus asthmatique de statut représente un comportement dominé par l’élastique solide à faible tension et comporte un croisement à forte tension. En outre, les mesures de triples effectuées dans une solution de PEO à 1,5 % et un échantillon de mucus de dosage clinique ont confirmé que les caractéristiques viscoélastiques linéaires étaient hautement reproductibles pour les valeurs obtenues à partir de l’échantillon biologique.

Des changements ont été mesurés dans les propriétés viscoélastiques du mucus après un traitement par un agent mucolytique. Les effets du TCEP sur la viscoélasticité du mucus ont été testés en milieu clinique à l’aide du rhéomètre de paillasse. Le traitement mucolytique a donné un échantillon plus fluide avec une diminution du module complexe de 4,6 fois, un module élastique de 5,1 fois, un module visqueux de 1,9 fois, une déformation croisée de 3,3 fois et une contrainte d’élasticité croisée de 5,7 fois, et une augmentation du rapport d’amortissement de 2,8 fois.

La mesure de la viscoélasticité du mucus des voies respiratoires dans un environnement clinique au rythme rapide peut aider à adapter le traitement des patients au cas par cas, ainsi qu’à fournir un protocole normalisé pour tester de nouveaux composés pharmacologiques. Cette technique est actuellement utilisée pour examiner les effets des modulateurs CFTR très efficaces sur les expectorations de la fibrose kystique et pour tester la puissance de divers médicaments visant à modifier les propriétés du mucus.