Name: Triphosphorylation chimique des oligonucléotides (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-02T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 19 s
Description: Apprenez la triphosphorylation chimique des oligonucléotides pour la biotechnologie et la biologie synthétique. Cette méthode permet de synthétiser des oligonucléotides triphosphorylés de séquence arbitraire, y compris le L-RNA non naturel.

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Les auteurs sont reconnaissants à Greg Springsteen, Natasha Paul, Charles Olea, Jr., Jonathan Sczepanski et Katrina Tjhung pour leurs discussions utiles sur les meilleures pratiques en matière de réactions chimiques de triphosphorylation et à Gerald Joyce pour leurs commentaires utiles. Ce travail a été soutenu par une subvention MCB 2114588 de la National Science Foundation.

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

La procédure de triphosphorylation décrite ici est largement compatible avec la synthèse d’oligonucléotides en utilisant la chimie standard du phosphoramidite. Les phosphoramidites nucléosidiques devraient avoir des groupes protecteurs base-labile compatibles avec une déprotection rapide dans AMA39, y compris les groupes standard β-cyanoéthyle sur le phosphite, et isobutyryl, diméthylformamidyle, acétyle, phénoxyacétyle ou 4-isopropylphénoxyacétyle sur les amines exocycliques des nucléobases. Les groupes ribose 2'-hydroxyle doivent être protégés par des groupes protecteurs du silyle, soit le t-butyldiméthylsilyle (TBDMS), soit le tri-iso-propylsilyloxyméthyl (TOM)40,41. Le groupe pivaloyloxyméthyle base-labile (PivOM) a également été signalé comme étant compatible avec la triphosphorylation chimique30.
Plusieurs méthodes ont été décrites pour la triphosphorylation chimique des oligonucléotidessynthétiques 28,29,30,31,32,33,34,35. Nous avons constaté que la triphosphorylation utilisant le réactif Ludwig-Eckstein37 était l’une des plus accessibles, ne nécessitant aucune synthèse spécialisée de réactifs et aucun équipement spécialisé. Les oligonucléotides 5′-triphosphates préparés par cette méthode ont été couramment utilisés comme substrats pour les ribozymes d’ARN ligase, y compris l’utilisation de triphosphates d’oligonucléotides d’ARN-L enzymatiquement inaccessibles pour obtenir une synthèse et une réplication dépendantes du modèle de cet acide nucléique « image miroir » 14,16,17,18 . La méthode convient également à la préparation de petits ARN de la boucle de tige 5′-triphosphorylés qui sont de puissants activateurs de la réponse immunitaire innée chez les vertébrés 6,7.
Le réactif ludwig-Eckstein, la salicylphosphoochloridite37, est très réactif à l’eau et récupère efficacement toute eau introduite lors de la dissolution du réactif avant le chargement sur la colonne oligonucléotidique. Après ce point, cependant, l’oligonucléotide 5′-phosphitylé réagira préférentiellement avec toute eau introduite dans le système par rapport au pyrophosphate, formant un produit secondaire 5′-H-phosphonate après 28,37,38. Une préparation minutieuse des réactifs de triphosphorylation et de la chambre de réaction de triphosphorylation garantit que ce produit secondaire n’est pas formé. Pour le séchage au solvant, les tamis moléculaires de type 4 Å sont vendus préemballés dans des sacs en téflon compatibles avec la plupart des solvants organiques sous diverses marques par la plupart des sociétés de réactifs de synthèse d’oligonucléotides. Des précautions supplémentaires, telles que la triphosphorylation dans une boîte à gants sous atmosphère anhydre, ne sont généralement pas nécessaires.
La réaction de l’oligonucléotide 5′-phosphitylé avec le TBAP forme un intermédiaire cyclique 5′-trimétaphosphite, qui est ensuite oxydé en 5′-trimétaphosphate cyclique à l’aide d’une solution oxydante de synthèse d’oligonucléotides (iode dans l’eau/pyridine/THF). Il convient de noter que les solutions comburantes commerciales utilisent des quantités variables d’iode et qu’il est essentiel d’utiliser la concentration élevée d’iode de 0,1 M pour assurer une oxydation complète du triphosphate. Le produit cyclique est hydrolysé jusqu’au 5′-triphosphate linéaire final dans la même solution37, et des solutions oxydantes anhydres alternatives doivent être utilisées si une linéarisation avec des nucléophiles autres que l’eau est souhaitée (voir ci-dessous pour les applications)33. Cependant, tout trimétaphosphate cyclique résiduel sera linéarisé lors de la déprotection alcaline ultérieure de l’oligonucléotide. L’hydrolyse du 5′-trimétaphosphate cyclique ne donne que le triphosphate37,46 linéaire plutôt que ramifié.
La déprotection des oligonucléotides n’a généralement pas besoin d’être modifiée pour s’adapter à la triphosphorylation 5′, mais quelques précautions doivent être prises. Le triphosphate est relativement stable à une brève exposition à des conditions alcalines, mais il faut veiller à ne pas exposer le triphosphate à l’AMA plus longtemps que nécessaire. Il faut éviter de protéger les groupes qui nécessitent un traitement plus prolongé dans l’ammoniac ou l’AMA pendant plus de 10 minutes à 65 °C. Des traitements plus doux, tels que 2 h dans l’ammoniac à température ambiante, sont acceptables lorsqu’ils sont compatibles avec d’autres groupes protecteurs au phosphoramidite. Une méthode courante et rapide de déprotection des oligonucléotides d’ARN synthétiques protégés par le silyl utilise du trifluorure de triéthylamine et une température élevée47; cependant, cela doit être évité lors de la préparation de l’ARN 5′-triphosphates, car les conditions acides prolongées accélèrent l’hydrolyse du triphosphate31,32.
Preparative PAGE s’est avéré être la méthode la plus simple et la plus fiable pour la purification post-déprotection des oligonucléotides 5′-triphosphorylés (Figure 3 et Figure 4). Cependant, la CLHP préparative en phase inverse peut également être utilisée pour purifier les produits triphosphorylés. La présence de produits 5′-diphosphate et, dans une moindre mesure, de 5′-monophosphate est systématiquement observée lors de la vérification de la triphosphorylation par spectrométrie de masse. Nous avons observé une fragmentation du 5′-triphosphate au cours de la spectrométrie de masse à partir d’un matériau très pur préparé par synthèse chimique ou transcription, en particulier si l’instrument n’est pas optimisé pour l’analyse des oligonucléotides. Néanmoins, l’analyse RP-LC montre souvent que 10 % à 20 % du produit secondaire 5′-diphosphate est présent dans des oligonucléotides 5′-triphosphorylés plus longs (Figure 4). Les préparations commerciales de pyrophosphate de tributylammonium peuvent être contaminées par jusqu’à 20% de monophosphate, ce qui donnera du 5′-diphosphate comme produit secondaire pendant la triphosphorylation30,31. Une préparation minutieuse de ce réactif en interne peut donner des stocks TBAP beaucoup plus purs31. Cependant, nous avons constaté que les oligonucléotides triphosphorylés à l’aide de sources commerciales de TBAP présentent toujours une réactivité comparable ou supérieure lorsqu’ils sont utilisés comme substrats dans des réactions enzymatiques (Figure 5B), par rapport au matériel préparé par transcription in vitro.
Une autre utilisation notable de la triphosphorylation oligonucléotidique avec le réactif ludwig-Eckstein tire parti du trimétaphosphite cyclique intermédiaire33. Si l’étape d’oxydation suivante est effectuée avec du peroxyde de t-butyle de 1 M dans les hexanes, qui est souvent utilisé pour l’oxydation des oligonucléotides dans des conditions anhydres, l’oxydation du phosphite se produit sans hydrolyse d’ouverture de cycle, donnant le trimétaphosphate cyclique. Cet intermédiaire peut ensuite être réagi avec des nucléophiles primaires d’amine ou d’alcool pour donner des 5′-triphosphates avec des modifications au γ-phosphate. Ces modifications comprennent l’ajout d’une étiquette lipophile liée par une liaison phosphoramidate, qui facilite la purification rapide spécifique du triphosphate par RP-LC, suivie d’une hydrolyse acide de la balise du triphosphate33. Des modifications fluorescentes à la position γ-phosphate peuvent également être introduites pour être utilisées comme rapporteurs fluorescents en temps réel pour les réactions de ligature catalysées par le ribozyme15,33.

La forme 5′-triphosphorylée de l’ARN est omniprésente en biologie car elle est générée par la transcription de l’ARN dans tous les domaines de la vie et par la réplication de l’ARN au cours du cycle de vie de nombreux virus à ARN. Ces triphosphates servent de substrat pour la formation d’ARNm coiffé de 7-méthylguanylate chez les eucaryotes et, par conséquent, jouent un rôle essentiel dans l’expression des protéines1. En revanche, le triphosphate est retenu dans les bactéries et les virus; ainsi, les ARN 5′-triphosphates sont reconnus par les régulateurs de la réponse immunitaire innée chez les eucaryotes 2,3,4,5,6,7. En dehors de la biologie, une foule de ribozymes d’ARN ligase ont été développés pour utiliser le 5′-triphosphate in vitro8 et modifiés pour une utilisation dans les tests diagnostiques 9,10,11,12,13,14,15. L’un de ces ribozymes peut être utilisé pour la synthèse dépendante du modèle de l’ARN-L, l’énantiomère non biologique « image miroir » de l’ARN D naturel, à partir de petits oligonucléotides d’ARN L 5′-triphosphates 16,17,18. La préparation de routine d’oligonucléotides triphosphorylés de séquence et de composition dorsale variables est essentielle à l’étude de ces systèmes.
La méthode la plus courante et la plus accessible pour préparer l’ARN 5′-triphosphates en laboratoire est la transcription in vitro. Cependant, l’ARN produit par cette méthode est limité dans la séquence et la taille par les exigences du promoteur et du substrat de l’enzyme ARN polymérase. L’ARN polymérase T7 et ses dérivés spécialisés sont les polymérases les plus couramment utilisées à cette fin 19,20,21,22. L’ARN transcrit in vitro préparé avec ces enzymes doit être initié avec une purine 5′-terminale et est fortement biaisé vers les purines dans les 10 premiers nucléotides23,24. De plus, l’incorporation enzymatique de nucléotides modifiés par la base ou l’épine dorsale est au mieux inefficace et plus souvent impossible avec les polymérases naturelles, limitant la possibilité de produire des oligonucléotides 5′-triphosphates composés de tout sauf de l’ARN D naturel. Un autre facteur limitant est que l’ARN généré par transcription in vitro peut contenir une hétérogénéité substantielle de 5′ et 3′ et est produit sous forme de produits extrêmement hétérogènes lorsqu’il est inférieur à20 nt 23,24,25,26,27.
En revanche, la triphosphorylation chimique d’oligonucléotides préparés par synthèse de phosphoramidite en phase solide 28,29,30,31,32,33,34,35 peut être utilisée pour préparer des oligonucléotides 5′-triphosphates de 3-50 nt de long, de n’importe quelle séquence. De plus, une vaste gamme de modifications des acides nucléiques accessibles à la synthèse du phosphoramidite peut être ajoutée aux oligonucléotides avant la 5′-triphosphorylation 14,15,16,17,18,29,36. Beaucoup de ces méthodes utilisent le réactif de phosphitylation salicyl phosphorochloridite, qui a été développé par Ludwig et Eckstein pour la triphosphorylation en phase solution des mononucléosides37. La triphosphorylation des oligonucléotides avec ce réactif est réalisée sur la phase solide par phosphitylation de l’oligonucléotide 5′-hydroxyle, conversion en triphosphate par réaction avec pyrophosphate et oxydation, suivie de procédures standard de clivage de l’oligonucléotide du support solide, de protection et de purification (Figure 1)28.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig01v2.jpg"> Figure 1 : Schéma de triphosphorylation des oligonucléotides synthétiques. Dans la première étape, l’oligonucléotide 5ʹ-hydroxyle est phosphitélé avec SalPCl. Dans l’étape suivante, le phosphite de 5ʹ-salicyle réagit avec tbAP pour former le métaphosphite cyclique, puis dans la troisième étape oxydé pour générer le 5ʹ-trimétaphosphate cyclique dans une solution d’oxydation de synthétiseur ADN/ARN (0,1 M d’iode/pyridine/H2O/THF), qui est rapidement hydrolysé pour obtenir le 5ʹ-triphosphate linéaire dans la même solution28,33, 37. Le clivage alcalin ultérieur du support solide du CPG et la déprotection de l’oligonucléotide dans la MeNH2 aqueuse/ammoniac hydrolyseront tout trimétaphosphate cyclique résiduel sous forme linéaire. Abréviations : SalPCl = phosphorochloridite de salicyle; TBAP = pyrophosphate de tributylammonium; THF = tétrahydrofurane; CPG = verre à pores contrôlés; MeNH2 = méthylamine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Bien que les premiers rapports publiés utilisant cette méthode aient souvent souffert de faibles rendements et de produits secondaires indésirables 28,37,38, un entretien minutieux des conditions anhydres est tout ce qui est nécessaire pour obtenir régulièrement des rendements élevés. Cela peut être réalisé par une préparation minutieuse des réactifs et l’utilisation d’un dispositif de réaction simple assemblé à partir de composants en plastique standard. Ici, nous démontrons les étapes appropriées pour la triphosphorylation chimique des oligonucléotides, y compris la préparation des réactifs, l’assemblage de la chambre de réaction, la réaction de triphosphorylation, et la déprotection et la purification ultérieures des oligonucléotides triphosphorylés. L’utilisation représentative d’oligonucléotides 5′-triphosphorylés comme substrats pour les ribozymes ligase pour la synthèse de produits d’acides nucléiques plus importants avec de l’ARN D naturel et des épines dorsales abiotiques de l’ARN-L est également incluse.

<table><tbody><tr><td>0,22 et micro ; m filtre à seringue en polyéthersulfone</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLMP025SS</td><td>Filtre à seringue pour l’élimination des particules de gel de polyacrylamide broyées (Section 5)</td></tr><tr><td>0.22 &micro ; m Filtre à seringue en PTFE</td><td>MilliporeSigma</td><td>SLLG013SL</td><td>Filtre à seringue pour l’élimination de la résine CPG (Section 5)</td></tr><tr><td>Seringues en plastique de 1 mL</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-823-434 (BD 309659)</td><td>Composants de l’appareil de triphosphorylation (sections 2&ndash ; 4)</td></tr><tr><td>1,4-dioxane,</td> solvant de triphosphorylation anhydre <td>MilliporeSigma</td><td>296309</td><td>(sections 2 et 2 ; 4)</td></tr><tr><td>2-Chloro-4H-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one, Salicyl Phosphorochloridite (SalPCl)</td><td>MilliporeSigma</td><td>324124</td><td>réactif de triphosphorylation (sections 2&ndash ; 4)</td></tr><tr><td>Flacons en verre de 30 mL</td><td>MilliporeSigma</td><td>23232</td><td>Flacons pour la préparation de solvants de triphosphorylation et de solution TBAP (section 2)</td></tr><tr><td>Robinet d’arrêt à 3 voies, polycarbonate/polypropylène</td><td>Bio-Rad</td><td>Laboratories 7328103</td><td>Composant de l’appareil de triphosphorylation (sections 2&ndash ; 4)</td></tr> <tr><td>Solution d’acrylamide/bis-acrylamide à 40 %, 19:1</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610144</td><td>Pour PAGE (sections 5 et ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Acétonitrile, anhydre, 100 mL</td><td>Glen Research</td><td>40-4050-50</td><td>Solvant de triphosphorylation (sections 2&ndash ; 4)</td></tr><tr><td>Piège neutralisant l’ammoniac</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ANT100 et ANS121</td><td>Pour une utilisation avec Speedvac DNA130 (section 5)</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610700</td><td>Pour PAGE, catalyseur pour la polymérisation de l’acrylamide (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Ammoniac aqueux, 28 %</td><td>MilliporeSigma</td><td>338818</td><td>Pour la préparation du réactif de déprotection AMA (section 5)</td></tr><tr><td>Méthylamine aqueuse, 40 %</td> <td>TCI America</td><td>TCI-M0137</td><td>Pour la préparation du réactif de déprotection AMA (section 5)</td></tr><tr><td>Synthétiseur automatisé d’oligonucléotides d’ADN/ARN</td><td>PerSeptive Biosystems</td><td>Expedite 8909 Synthétiseur d’ADN/ARN</td><td>tout synthétiseur sur colonne est acceptable (section 1)</td></tr><tr><td>Aimant de capture de billes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12320D</td><td>Pour la capture de billes de streptavidine (section 7)</td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610404</td><td>Pour tampon de charge d’urée PAGE (section 5)</td></tr><tr><td>Pompe à huile pour vide profond</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VLP200-115</td><td>Pour une utilisation avec lyophilisateur (section 5)</td></tr><tr><td>Dessicant de diédirite, 10-20 mesh</td><td>MilliporeSigma</td><td>737828</td><td>Dessiccant pour le stockage de produits chimiques et d’équipements de triphosphorylation (sections 1 et ndash ; 2)</td></tr><tr><td>ARN-D 27.3t polymérase croisée chirale</td><td>préparée en maison18</td><td>5&prime ;-GGUGGUGGAC GUGAUCAUUA CGGAUCACUA ACUCGUCAGU GCAUUGAGAA GGAGAAUAAA AUGCACAUAG GUCGAAAGAC CUUAUACAAG AACUGUAUCA CCGGAGGGCG AGCACCACC-3&prime ;</td><td>Pour les réactions ribozymiques inter-chirales (section 7)</td></tr><tr><td>Supports solides D-RNA CPG, 1 000 & Aring ;, préemballés 1 & micro ; colonnes de synthèse de moles</td><td>Glen Research</td><td>20-3404-41E, 20-3415-41E, 20-3424-41E, 20-3430-41E</td><td>représentatives, pour la synthèse d’oligonucléotides D-RNA (section 1)</td></tr><tr><td>AD-D PHOSPHORAMIDITES PROTÉGÉES PAR TOM</td><td>ChemGenes</td><td>ANP-3201, 3202, 3203, 3205</td><td>représentatives, pour la synthèse d’oligonucléotides D-ARN (section 1)</td></tr><tr><td>Colonnes de synthèse d’expedite vides, 1&micro ; m</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-01</td><td>Colonnes de synthèse à utiliser avec le synthétiseur d’ADN/ARN Expedite (section 1)</td></tr><tr><td>EPPS, N-(2-Hydroxyéthyl)Pipérazine-N&prime ;-(3-propanesulfonique), solide</td><td>MilliporeSigma</td><td>E1894</td><td>Composant tampon de réaction ribozyme (section 6)</td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA), solide</td><td>MilliporeSigma</td><td>EDS</td><td>Chélateur d’ions métalliques divalents à utiliser dans divers tampons ( articles 5 et ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Filtres pour colonnes de synthèse Expedite</td><td>Glen Research</td><td>20-0021-0F</td><td>Filtres de colonne de synthèse de style Expedite, à utiliser avec des colonnes de synthèse vides (section 1)</td></tr><tr><td>Scanner de gel fluorescent/phosphorescent</td><td>Cytiva</td><td>Amersham Typhoon RGB, 29187193</td><td>Pour visualiser la PAGE analytique (sections 6&ndash ; 7)</td></tr> <tr><td>Formamide, désionisé</td><td>VWR Life Science</td><td>97062</td><td>Pour le tampon de chargement de gel de formamide PAGE (sections 6&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Logiciel de quantification d’images de gel</td><td>Cytiva</td><td>ImageQuant TL</td><td>Pour quantifier les images de gel numérisées (section 6)</td></tr><tr><td>Dessiccateur en verre</td><td>MilliporeSigma</td><td>CLS3121150</td><td>Stockage de solvants de triphosphorylation (section 2)</td></tr><tr><td>Supports solides L-RNA CPG, 1 000 ° Aring ;, en vrac</td><td>ChemGenes</td><td>N-4691-10, N-4692-10, N-4693-10, N-4694-10</td><td>Synthèse d’oligonucléotides L-RNA (section 1)</td></tr><tr><td>Modèle de requin-marteau à ARN-L</td><td>préparé dans house18</td><td>5&prime ;-GCGCCUCAUC AGUCGAGCC-3&prime ;</td><td>Pour les réactions ribozymiques inter-chirales (section 7)</td></tr><tr><td>amorce d’ARN-L</td><td>préparée sur place18</td><td>5&prime ;-fluorescéine-GGCUCGA-3&prime ;</td><td>Pour les réactions ribozymiques inter-chirales (section 7)</td></tr><tr><td>ADN-L PHOSPHORAMIDITES PROTÉGÉS PAR TOM</td><td>ChemGenes</td><td>OP ANP-5201, 5202, 5203, 5205</td><td>Synthèse d’oligonucléotides d’ARN-L (section 1)</td></tr><tr><td>Lyophiliseur/lyophilisateur</td><td>VirTis</td><td>Benchtop K</td><td>Pour la concentration des oligonucléotides (section 5)</td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté, solide</td><td>MilliporeSigma</td><td>M2670</td><td>Pour les réactions de ribozyme (sections 6&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>N,N-Diméthylformamide, solvant de</td><td>triphosphorylation</td> anhydre <td>MilliporeSigma</td><td>227056</td> (section 2)</tr><tr><td>Colonne de dessalage NAP-25 (résine Sephadex G-25)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>45000150</td><td>Colonnes de chromatographie d’exclusion stérique jetables à écoulement par gravité contenant de la résine Sephadex G-25 (section 5)</td></tr><tr><td>Aiguille en acier inoxydable non carottage, 20 G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14-815-410</td><td>Aiguilles pour percer les septa en caoutchouc (sections 2&ndash ; 4)</td></tr> <tr><td>Calculateur de coefficient d’extinction des oligonucléotides</td><td>Outil d’analyse d’ADN intégré Outil d’oligo-analyseur</td> Modèle <td></td><td>du voisin le plus proche Calculateur de coefficient d’extinction d’oligonucléotide court 260 nm (section 5)</td></tr> <tr><td>Solution oxydante, 0,1 M d’iode dans le THF/pyridine/l’eau</td><td>ChemGenes</td><td>RN-1456</td><td>Réactif de triphosphorylation (section 4)</td></tr><tr><td>Plaques PAGE</td><td>Timberrock/CBS</td><td>NGP-250-BO et NO</td><td>Pour PAGE (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Alimentation PAGE</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>PowerPac HV 1645056</td><td>Pour PAGE (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Entretoises et peignes PAGE (analytiques)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-0725 et VGC-0714</td><td>Pour PAGE (sections 6&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Entretoises et peignes PAGE (préparatoires)</td><td>Timberrock/CBS</td><td>VGS-3025R et VGC-3001</td><td>Pour PAGE (section 5)</td></tr><tr><td>Support PAGE</td><td>Timberrock/CBS</td><td>ASG-250</td><td>Pour PAGE (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Parafilm M</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>13-374-12 (Bemis PM999)</td><td>Film d’étanchéité à la cire pour appareil de triphosphorylation (sections 2&ndash ; 4)</td></tr><tr><td>Thermocycleur PCR</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>C1000 Touch Thermalcycler</td><td>Pour les réactions ribozymatiques inter-chirales (section 7)</td></tr><tr><td>Colonne de dessalage 10 (résine Sephadex G-10)</td><td>MilliporeSigma</td><td>GE17-0010-01</td><td>Colonnes de chromatographie d’exclusion stérique à écoulement par gravité jetables contenant de la résine Sephadex G-10, pour oligonucléotides < 15 nt (section 5)</td></tr><tr><td>Tamis au phosphore</td><td>Cytiva</td><td>28956480</td><td>Pour la visualisation de l’ARN marqué 32P (section 6)</td></tr><tr><td>Réactifs de synthèse de phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>30-3142-52, 40-4050-53, 40-4012-52, 40-4122-52, 40-4132-52, 40-4060-62</td><td>, pour la synthèse standard de l’ARN/ADN (section 1)</td></tr><tr><td>Tube scellable à vis en polypropylène</td><td>MilliporeSigma</td><td>BR780752</td><td>Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 mL avec bouchon à vis et joint torique en silicone, pour une déprotection AMA sûre ( section 5)</td></tr><tr><td>Pyridine, anhydre</td><td>MilliporeSigma</td><td>270970</td><td>Solvant de triphosphorylation (section 2)</td></tr><tr><td>Chromatographie liquide en phase inverse/spectrométrie de masse à ionisation par électronébulisation (RP-LC/ESI-MS)</td><td>Novatia</td><td>n/a</td><td>Service commercial pour LC/MS spécialisé dans les oligonucléotides (section 5)</td></tr><tr><td>Septa en caoutchouc (ID x OD 7,9 mm x 14 mm), blanc</td><td>MilliporeSigma</td><td>Z564702</td><td>Septa pour la préparation des solvants de triphosphorylation et du TBAP (section 2)</td></tr><tr><td>Ribozyme autoréplicateur E</td><td>préparé en maison14</td><td>5&prime ;-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA UGAGACCGCA ACUUA-3&prime ;</td><td>Pour les réactions ribozymatiques auto-réplicatrices (section 6)</td></tr><tr><td>Substrat autoréplicateur A</td><td>préparé dans la maison14</td><td>5&prime ;-32P-GGAAGUUGUG CUCGAUUGUU ACGUAAGUAA CAGUUUGAAU GGUUGAAGUA U-3&prime ;-OH</td><td>Pour les réactions de ribozyme autoréplicateur (section 6)</td></tr><tr><td>Substrat autoréplicateur B, transcrit</td><td>préparé dans la maison14</td><td>5&prime ;-pppGAGACCGCAA CUUA-3&prime ;</td><td>Pour les réactions ribozymatiques auto-réplicatrices (section 6)</td></tr><tr><td>Petits pièges de séchage, 4 & Aring ;</td><td>tamis moléculaires ChemGenes</td><td>DMT-1975</td><td>Pièges de séchage pour synthétiseurs d’ADN/ARN phosphoramidites et réactifs de triphosphorylation (sections 1&ndash ; 2)</td></tr><tr><td>Chlorure de sodium (NaCl), solide</td><td>MilliporeSigma</td><td>S7653</td><td>Sel à utiliser dans divers tampons (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH), solide</td><td>Sel MilliporeSigma</td><td>S8045</td><td>à utiliser dans divers tampons (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Logiciel d’ajustement de données statistiques</td><td>GraphPad</td><td>Prism</td><td>Pour l’ajustement des données de PAGE analytiques aux modèles cinétiques (section 6)</td></tr><tr><td>Billes magnétiques enrobées de streptavidine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65002</td><td>Pour la capture de l’ARN marqué à la biotine dans les réactions de ribozyme inter-chirale (section 7)</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>MilliporeSigma</td><td>84097</td><td>Pour le tampon de chargement d’urée PAGE (section 5)</td></tr><tr><td>TBE tampon de fonctionnement, 10x</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AAJ62788K3</td><td>pour PAGE (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Fluorure de tétrabutylammonium, solution 1,0 M dans du tétrahydrofurane</td><td>Aldrich</td><td>216143</td><td>Pour éliminer les groupes protecteurs 2&prime ;-silyle (section 5)</td></tr><tr><td>Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610801</td><td>Pour polymériser l’acrylamide pour PAGE (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Tributylamine</td><td>MilliporeSigma</td><td>90781</td><td>Réactif de triphosphorylation (section 2)</td></tr><tr><td>Pyrophosphate de tributylammonium (TBAP)</td><td>MilliporeSigma</td><td>P8533</td><td>Réactif de triphosphorylation (section 2)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>MilliporeSigma</td><td>T6666</td><td>Agent tampon à utiliser dans divers tampons (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>TWEEN20 détergent polysorbate</td><td>MilliporeSigma</td><td>P7949</td><td>Détergent neutre à utiliser avec des billes magnétiques (Section 7)</td></tr><tr><td>Urea</td><td>MilliporeSigma</td><td>U5378</td><td>Pour PAGE et tampon de chargement de gel (sections 5&ndash ; 7)</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre UV-Vis</td><td>ThermoFisher Scientific NanoDrop</td><td>2000, ND2000</td><td>Pour la mesure des concentrations d’oligonucléotides (section 5)</td></tr><tr><td>Centrifugeuse à vide</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Savant Speedvac DNA130-115 Concentrateur sous vide</td><td>Pour l’élimination de l’AMA et du THF (section 5)</td></tr><tr><td>Xylène cyanol</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>1610423</td><td>Pour tampon de chargement d’urée PAGE (section 5)</td></tr></tbody></table>

triphosphorylation chimique des oligonucléotides

Chemical Triphosphorylation of Oligonucleotides

Le 5′-triphosphate est une modification essentielle de l’acide nucléique que l’on trouve tout au long de la vie et qui est de plus en plus utilisée comme modification fonctionnelle des oligonucléotides en biotechnologie et en biologie synthétique. Les oligonucléotides 5′-triphosphates ont toujours été préparés in vitro par des méthodes enzymatiques. Cependant, ces méthodes sont limitées aux oligonucléotides naturels de l’ARN, ont de fortes préférences de séquence et ont tendance à produire des produits hétérogènes. De nouvelles méthodes de triphosphorylation chimique complètent à la fois le coût réduit de la synthèse automatisée des oligonucléotides par la chimie du phosphoramidite et la gamme variée de modifications des nucléotides maintenant disponibles. Ainsi, la synthèse d’oligonucléotides triphosphates de séquence et de longueur arbitraires, et contenant éventuellement diverses modifications non naturelles, est désormais accessible.
Cet article présente les méthodes et techniques appropriées pour la triphosphorylation chimique des oligonucléotides à l’aide de salicyl phosphorochloridite et de pyrophosphate. Cette méthode utilise des réactifs disponibles dans le commerce, est compatible avec la plupart des oligonucléotides préparés par des méthodes standard de synthèse en phase solide, et peut être complétée en 2 h après la synthèse des oligonucléotides, avant la déprotection et la purification. Deux utilisations d’oligonucléotides chimiquement triphosphorylés comme substrats pour les enzymes d’ARN catalytique sont démontrées, y compris la synthèse d’une version en image miroir du ribozyme à tête de marteau à partir de triphosphates d’ARN L non biologiques.

Les oligonucléotides doivent être synthétisés à l’aide de protocoles standard appropriés aux phosphoramidites et au synthétiseur automatisé ADN/ARN, en laissant l’oligonucléotide produit détaché du support solide dans la colonne de synthèse plastique d’origine, avec le groupe diméthoxytrityle 5ʹ-terminal retiré pour donner le 5ʹ-hydroxyle libre (section 1). Tous les oligonucléotides utilisés dans cette démonstration ont été préparés à l’aide de résine de verre à pores contrôlés (CPG) de 1 000 Å comme support solide et conduits à l’échelle de 0,2 ou 1 μmole. Des exemples représentatifs de colonnes de synthétiseur, de résines, de réactifs et de phosphoramidites sont fournis dans la Table des matériaux. Pour les réactions à plus grande échelle, les volumes et les temps utilisés dans les étapes suivantes peuvent devoir être ajustés.
La réaction de triphosphorylation est menée sur colonne dans une chambre de réaction construite sur mesure (figure 2, section 3) à l’aide de composants standard disponibles dans le commerce énumérés dans la table des matériaux et suit le schéma illustré à la figure 1 (section 4) 28. Il est essentiel que les conditions soient maintenues strictement anhydres pendant la triphosphorylation et que tous les solvants et réactifs soient préparés à l’avance sur des tamis moléculaires et laissés sécher complètement avant utilisation (rubrique 2). La triphosphorylation prend généralement 2 heures pour se produire, et par la suite, la colonne lavée et séchée peut être traitée selon les procédures standard de déprotection et de purification des oligonucléotides (rubrique 5).
Après déprotection, les oligonucléotides triphosphates sont purifiés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) dénaturante, montrant une seule bande de produit majeure par ombrage UV qui peut être excisé et élué du gel. Le produit 5′-triphosphate est facilement séparé des produits secondaires de réaction pour les oligonucléotides courts, comme le montrent les trinucléotides d’ADN 5ʹ-triphosphates, pppAAA et pppCCC, et le trinucléotide D-ARN L 5ʹ-triphosphate pppGAA dans la figure 3A,B. Les produits 5′-hydroxyle et 5′-triphosphate pour les trimères d’ADN AAA et CCC ont été excisés et identifiés par spectrométrie de masse et marqués en conséquence à la figure 3A. Les bandes supplémentaires, telles que visibles pour le trimère d’ADN AAA, ne contiennent généralement pas assez de matière pour récupérer et identifier. La présence de ces bandes, cependant, est en corrélation avec des masses de produits supplémentaires dans les produits de réaction non purifiés (Figure 3C), représentant généralement des produits secondaires de 5′-diphosphate, de monophosphate et de H-phosphonate, comme indiqué ci-dessous.
Après la purification de PAGE, des oligonucléotides plus gros peuvent être élués à l’aide de la méthode de broyage et de trempage42 et de la précipitation ultérieure de l’éthanol. Toutefois, les oligonucléotides de moins de 15 nt ne peuvent pas être précipités efficacement à l’éthanol et nécessitent donc une procédure modifiée pour l’élution du gel (étape 5.11.3). La colonne d’exclusion de la taille jetable indiquée dans le tableau des matériaux n’est évaluée que pour une utilisation avec des oligonucléotides de plus de 10 nt. Cependant, nous avons constaté que des oligonucléotides aussi courts que des trimères peuvent être effectivement dessalés en utilisant le protocole recommandé par le fabricant. Néanmoins, lors du dessalement d’oligonucléotides courts (comme aux étapes 5.6 et 5.11.3), l’éluat de colonne soit collecté en fractions et que les fractions de produit soient identifiées par absorbance à 260 nm à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Une colonne d’exclusion de taille optimisée pour les oligonucléotides plus courts est fournie dans le tableau des matériaux comme choix alternatif. Le rendement final de la synthèse d’oligonucléotides à l’échelle de 1 μmole après purification est de 50 à 300 nmol.
La triphosphorylation peut être confirmée par spectrométrie de masse, où le produit triphosphorylé a une masse +239,94 Da supérieure à l’oligonucléotide 5′-hydroxyle, bien que la présence de matériaux correspondant au 5′-di- et au monophosphate (+159,96 et +79,98 Da, respectivement) soit souvent observée. Un produit secondaire de 5′-H-phosphonate avec une masse de +63,98 Da de la masse de 5′-OH peut également être observé, et des niveaux élevés de ce produit indiquent que les conditions pendant la triphosphorylation n’étaient pas suffisamment anhydres. Avant la purification, les oligonucléotides déprotégés montreront généralement tous ces produits (Figure 3C), tandis que le matériau purifié montrera un pic correspondant au produit 5′-triphosphate avec les 5′-di- et les monophosphates (Figure 3D,E).
La spectrométrie de masse seule ne donnera généralement pas une mesure rigoureuse de la pureté du 5′-triphosphate en raison des taux différentiels d’ionisation et de fragmentation du triphosphate pendant l’ionisation. Pour mesurer la pureté du produit final, la chromatographie liquide en phase inverse et le tandem ESI-MS (RP-LC/ESI-MS) sont recommandés, en particulier pour les oligonucléotides plus longs. L’analyse des ARN-D 5ʹ-triphosphates pppACGAGG et pppGAGACCGCAACUUA par RP-LC/ESI-MS (Figure 4A,B, respectivement) montre une pureté typique du produit final, contenant 20% de 5ʹ-diphosphate car ces deux espèces sont difficiles à séparer lorsqu’elles sont présentes sur des oligonucléotides plus longs.
Les oligonucléotides synthétiques de 5′-triphosphate fonctionnent généralement aussi bien ou mieux que les matériaux préparés enzymatiquement dans les études biochimiques. Dans la section 6, à titre d’exemple, des substrats d’ARN 5′-triphosphate 14 nt préparés synthétiquement ou par transcription in vitro ont été comparés dans une réaction d’auto-réplication catalysée par l’ARN 14,15,43,44,45. Le ribozyme E catalyse l’assemblage des substrats A et B pour produire une nouvelle copie de E dans une réaction autocatalytique capable de croissance exponentielle (Figure 5A). Les composants E et 32composants A marqués P ont été préparés par transcription in vitro, et le substrat B triphosphorylé a été préparé soit synthétiquement, comme décrit ci-dessus, soit par transcription in vitro 14. La progression de la réaction d’auto-réplication a été surveillée en prélevant des échantillons périodiques qui ont été analysés par dénaturation de PAGE et quantifiés à l’aide d’un scanner de gel fluorescent / phosphorescent. Les données résultantes, adaptées à une fonction de croissance logistique, ont révélé que le substrat B transcrit ou synthétique supporte une croissance exponentielle, mais que le B synthétique donne une quantité légèrement supérieure de produit (Figure 5B). Ce résultat peut refléter l’hétérogénéité de composition à l’extrémité 5′ de l’ARN préparé par transcription in vitro 23,24.
La triphosphorylation chimique permet également la synthèse d’oligonucléotides triphosphates qui ne peuvent être préparés biologiquement, que ce soit in vitro ou dans les cellules. Dans la section 7, des oligonucléotides triphosphates non biologiques composés d’ARN-L, l’énantiomère de l’ARN-D naturel, préparés comme dans les sections 1 à 5, ont été utilisés comme substrats pour le ribozyme 27.3t de polymérase « chirale croisée » de l’ARN D (Figure 6A), qui catalyse la polymérisation dirigée par gabarit d’un produit d’ARN L plus long à partir d’oligonucléotides d’ARN L court 5′-triphosphates de manière générale. À titre d’exemple, le ribozyme peut synthétiser une version L-ARN du motif d’auto-clivage de la tête de marteau (Figure 6B)18. Les trinucléotides triphosphates d’ARN L purifiés ont été combinés avec un amorce d’ARN L marqué à la fluorescéine et un gabarit d’ARN-L (figure 6C) et ont réagi avec la ligase chirale croisée. Les échantillons au cours de la réaction ont été analysés par PAGE et imagés à l’aide d’un scanner de gel fluorescent/phosphorescent pour démontrer la synthèse d’une version L-ARN du ribozyme à tête de marteau codée par le gabarit (Figure 6D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig03.jpg"> Figure 3 : Purification des trinucléotides 5ʹ-triphosphates. (A) Analyse PAGE (visualisée par ombrage UV) de la triphosphorylation des trinucléotides d’ADN tri-désoxyadénosine (AAA, bleu) et tri-désoxycytidine (CCC, rouge), intentionnellement surchargés pour visualiser des produits secondaires mineurs. Le produit 5ʹ-triphosphate (ppp) et la matière première du 5ʹ-hydroxyle (OH) ont été excisés et identifiés par MALDI-MS. (B) PAGE préparative de triphosphorylation du trinucléotide GAA de l’ARN-L, avec la bande de produits majeure excisée et identifiée comme le 5ʹ-triphosphate (ppp) par ESI-MS. (C) MALDI-MS de produits de réaction bruts après déprotection et (D) produits purifiés de (A). 5ʹ-triphosphate (ppp; pppAAA attendu 1 119 Da, observé 1 118 Da; pppCCC attendu 1 047 Da, observé 1 046); Le 5ʹ-diphosphate (pp), le 5ʹ-monophosphate (p), le 5ʹ-hydroxyle (OH) et le 5ʹ-H-phosphonate (Hp) sont étiquetés. (E) Spectre de masse déconvolu provenant de l’injection directe d’ESI-MS de produit isolé à base de 5ʹ-triphosphate de (B), avec des pics identifiés marqués (attendu 1 181,6 Da, observé 1 181,0 Da). Des produits à base de 5ʹ-diphosphate (pp) sont également observés, de même que des pics d’ions sodium pour les produits tri- et di-phosphate (+22 Da). Les pics de contaminants courants sont marqués d’un astérisque. Pour faciliter la comparaison, les spectres de masse ont été normalisés à l’intensité la plus élevée mesurée dans chaque spectre et sont rapportés en pourcentage par rapport à cette valeur. Abréviations : PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide; MALDI-MS = désorption/ionisation laser assistée par matrice; ESI-MS = spectrométrie de masse par ionisation par électropulvérisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig04.jpg"> Figure 4 : RP-LC analytique de 6 nt et 14 nt D-ARN oligonucléotides triphosphates. (A) 5ʹ-pppACGAGG-3ʹ et (B) 5ʹ-pppGAGACCGCAACUUA-3ʹ. Tandem ESI-MS a identifié le pic majeur des deux (~70%) comme le 5ʹ-triphosphate (ppp), avec des quantités moindres de 5ʹ-diphosphate (pp). Abréviations : RP-LC = chromatographie liquide en phase inverse ; nt = nucléotides; ESI-MS = spectrométrie de masse par ionisation par électropulvérisation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig05.jpg"> Figure 5 : Comparaison des substrats oligonucléotidiques 5ʹ-triphosphate préparés par synthèse chimique ou transcription in vitro. (A) Le ribozyme E auto-réplicant ligate l’ARN A et l’ARN B 5′-triphosphorylé. (B) Comparaison des réactions d’auto-réplication utilisant 10 μM A et 10 μM B, synthétiques (cercles ouverts) ou transcrits in vitro (cercles remplis). (B) Les données étaient adaptées à l’équation de croissance logistique: [E] = a / (1 + b e-ct), où a est le rendement final, b est le degré de sigmoïdité et c est le taux de croissance exponentiel. Les taux de croissance pour les deux réactions étaient identiques, à 1,14 h-1, tandis que l’étendue finale était 10% plus élevée pour les réactions avec B synthétique. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63877/63877fig06.jpg"> Figure 6 : Polymérisation croisée de l’ARN-L chiral avec un ribozyme. (A) Le ribozyme de la polymérase D-ARN 27,3 t, qui catalyse la ligature de l’ARN-L dépendante du modèle. (B) Le produit L-ARN synthétisé par 27,3 t fait partie d’un motif d’endonucléase à tête de marteau. (C) Polymérisation de l’ARN-L catalysée par 27,3 t à l’aide d’un gabarit d’ARN L biotinylé (brun), d’un amorce d’ARN-L marqué en fin de compte (magenta) et de quatre trinucléotides trinucléotidiques d’ARN-L (cyan), préparés synthétiquement. (D) Analyse PAGE des produits d’extension de (B) à 4 h et 24 h, montrant chaque incorporation de trinucléotides jusqu’au produit pleine longueur (point noir). L’amorce d’ARN-L non réagie est incluse comme marqueur de référence. Abréviations : PAGE = électrophorèse sur gel de polyacrylamide; M = marqueur de référence. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63877/63877fig06large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Les oligonucléotides 5′-triphosphates sont des composants omniprésents dans les voies biologiques essentielles et ont été de plus en plus utilisés dans les applications biotechnologiques. Nous décrivons ici des techniques de synthèse et de purification de routine des oligonucléotides 5′-triphosphates, à partir d’oligonucléotides préparés par des techniques de synthèse automatisées standard.

Triphosphorylation chimique des oligonucléotides

The 5&#8242;-triphosphate is an essential nucleic acid modification found throughout all life and increasingly used as a functional modification of ...

La triphosphorylation est une modification 5'omniprésente de l’ARN en biologie et est de plus en plus utilisée dans les applications biotechnologiques. Le protocole décrit ici permet la triphosphorylation 5' de tout oligonucléotide préparé par synthèse automatisée standard. La triphosphorylation chimique agit sur des oligonucléotides contenant de l’ARN, de l’ADN ou de l’acide nucléique non naturel.Ici, l’ARN L gaucher triphosphorylé, l’énantiomère de l’ARN D biologique, est synthétisé purifié et utilisé dans une réaction ribosome. La triphosphorylation est réalisée après la synthèse automatisée des oligonucléotides et avant la déprotection. Ces étapes ne sont pas montrées ici, mais les chercheurs doivent être familiers avec les méthodes standard pour les deux.Pour commencer, assurez-vous que l’espace de travail pour la phosphorylation dispose d’un collecteur de gaz avec au moins deux lignes et que le barboteur est relié à une source d’argon sec avec une pression réglable car la réaction de triphosphorylation doit être effectuée sous argon. Fixez ensuite une seringue en plastique millilitre aux lignes pour faciliter la connexion à l’appareil de réaction. Ensuite, collectez l’équipement, y compris des seringues en plastique d’un millilitre, un robinet d’arrêt en polypropylène à trois voies, des aiguilles non toniques, des tubes en polypropylène de 1,5 millilitre, une petite spatule métallique et conservez-les dans un récipient scellé ou un dessiccateur avec un dessicant à température ambiante pendant au moins un jour avant utilisation.Sous pression d’argon, retirer 30 millilitres de 1,4-dioxane anhydre d’une bouteille scellée. Transférer dans une bouteille en verre séchée de 30 millilitres et ajouter un piège à séchage. Sceller avec des septa en caoutchouc et stocker dans un dessiccateur avec un dessicant.De même, préparer 30 millilitres de N, N-diméthylformamide, acétonitrile et le mélange de trois parties de dioxane et d’une partie de pyridine en volume. Préparer la solution tbap en mélangeant du pyrophosphate de tributylammonium solide avec du diméthylformamide et de la tributylamine dans une bouteille en verre de 30 millilitres comme décrit dans le manuscrit. Ajoutez trois pièges de dessin.Scellez la bouteille avec un septum en caoutchouc sous argon et bullez avec de l’argon pendant 30 minutes. Après avoir préparé un oligonucléotide avec un 5'hydroxyle libre sur une colonne de synthèse à l’aide d’un synthétiseur ADN/ARN automatisé. Préparez la chambre en retirant le piston d’une seringue sèche d’un millilitre.Coupez le haut de la seringue à l’aide de ciseaux ou d’une lame de rasoir et fixez la seringue à la colonne de synthèse. Sur le dessus de la seringue, fixez le robinet d’arrêt à trois voies et fixez l’entrée latérale du robinet d’arrêt à la source d’argon sec avec le barboteur de sorte que l’entrée supérieure du robinet d’arrêt agisse comme l’orifice d’injection du réactif. Fixez ces opérateurs à un support avec des pinces et scellez tous les joints en amont avec un film d’étanchéité à la cire.Ajustez ensuite le robinet d’arrêt de sorte que l’orifice d’injection soit fermé et que l’appareil soit ouvert à la source d’argon. Fermez le barboteur et laissez l’argon à basse pression s’écouler dans la chambre d’action pendant cinq minutes. Après avoir rouvert le barboteur, fixez une seringue au bas de la colonne de synthèse, qui sera la seringue à déchets.Ensuite, tirez l’argon à travers la colonne à plusieurs reprises à l’aide de la seringue à déchets, puis reconnectez la seringue avec le piston enfoncé complètement. Pour ajouter un réactif ou un solvant, fixez une aiguille à la source d’argon sec et insérez-la dans le septum du réactif ou de la bouteille de solvant, en prenant soin de ne pas immerger l’aiguille dans le contenu de la bouteille. Ensuite, assemblez une seringue sèche avec une aiguille et insérez-la dans le septum du réactif ou du flacon de solvant sans l’immerger dans le contenu du flacon.Ensuite, remplissez la seringue d’argon, retirez l’aiguille du septum et expulsez l’argon. Après avoir rempli la seringue d’argon et expulsé une fois de plus, remplissez la seringue avec le volume requis de solvant ou de réactif sous pression d’argon. Ajustez le robinet d’arrêt pour que la source d’argon soit fermée et que le port d’injection soit ouvert.Une fois que l’arrêt de l’appareil est réglé rapidement, retirez la seringue et l’aiguille remplies du flacon source, essuyez tout solvant collé sur le côté ou à l’extrémité de l’aiguille, puis insérez l’aiguille dans le port d’injection. Après avoir expulsé un réactif dans l’anti-chambre des opérateurs, retirez l’aiguille et fermez l’orifice d’injection tout en rouvrant l’appareil à la source d’argon. Aspirez doucement le liquide de l’anti-chambre tout au long de la colonne de synthèse à l’aide de la seringue à déchets afin que tout le liquide soit maintenant maintenu dans la seringue à déchets.Maintenant, repoussez lentement la solution dans la colonne de synthèse, en vous assurant qu’aucune bulle de gaz n’est dans la colonne. Pour mélanger ou agiter, tirez doucement la solution de haut en bas sur la colonne avec la seringue à déchets. Pour retirer un réactif ou un solvant de la colonne, tirez lentement la solution dans la seringue à déchets.Une fois que la majeure partie de la solution est passée dans la seringue à déchets, tirez l’argon pour rincer le solvant restant de la colonne. Ensuite, retirez le film d’étanchéité à la cire autour du joint de la seringue à déchets. Retirez ensuite la seringue et jetez la solution de déchets.Ensuite, remplacez la seringue usagée par une nouvelle seringue sèche et refermez le joint. Après avoir assemblé l’appareil de triphosphorylation, commencez la réaction de triphosphorylation en ajoutant 200 microlitres de dioxane de pyridine à l’anti-chambre, comme démontré précédemment. Mais ne tirez pas encore l’échantillon sur la colonne de synthèse.Après avoir dissous le SalPCl dans le dioxane comme décrit dans le manuscrit, ajoutez-le à l’anti-chambre et chargé sur la colonne de synthèse à l’aide d’une seringue sèche. Ensuite, laissez-le réagir pendant 15 minutes, puis retirez et jetez la solution de SalPCl à l’aide d’une seringue à déchets comme démontré précédemment. Immédiatement après avoir retiré la solution salPCl, ajouter 250 microlitres de solution TBAP à l’anti-chambre et chargé sur la colonne de synthèse.Laissez-le réagir 20 minutes avec agitation et jetez comme décrit précédemment. Ensuite, lavez la colonne avec 0,5 millilitre de N, N-diméthylformamide, puis 0,5 millilitre d’acétonitrile, en retirant le solvant après chaque addition. Après avoir ajouté une solution comburante, l’avoir retirée et avoir lavé à nouveau la colonne avec de l’acétonitrile en utilisant la même procédure que celle indiquée, démonter l’appareil et laver la colonne avec cinq millilitres d’acétonitrile.Ensuite, séchez la colonne. Coupez l’oligonucléotide triphosphorylé du support solide et déprotégez-le à l’aide de protocoles standard décrits dans le manuscrit. Ensuite, dissoudre l’oligonucléotide déshydraté déprotégé dans un tampon de charge d’urée, chauffé à 80 degrés Celsius, puis charger sur un gel de polyacrylamide et fonctionner pendant une à deux heures à 25 à 35 watts.À la fin de l’électrophorèse sur gel, après avoir retiré la plaque de gel, démontez-la et enveloppez le gel dans un film de polychlorure de vinyle. Ensuite, identifiez les bandes de produits en ombrage arrière avec une lumière UV de 254 nanomètres et éliminez la bande de produit principale à l’aide d’une lame de rasoir. Écrasez le gel excisé en l’extrudant à travers une seringue en plastique ou mécaniquement.Pour les oligonucléotides de moins de 15 nucléotides, éluez dans trois fois le volume de gel de l’eau libre de nucléase pendant au moins 12 heures avec agitation ou agitation. Ensuite, retirez les morceaux de gel solides en faisant passer la solution à travers une seringue équipée d’un filtre de 0,2 micromètre et concentrez-la par lyophilisation. Après la concentration, éliminer les sels résiduels et les saluts à l’aide d’une colonne d’exclusion de taille jetable et concentrer par lyophilisation comme démontré précédemment.Après avoir préparé 10 microlitres d’une solution d’ARN contenant du ribozyme de polymérase et un gabarit d’amorce d’ARN-L et des trinucléotides triphosphates tels que décrits dans le manuscrit, recuites-les en les chauffant à 90 degrés Celsius pendant une minute et en les refroidissant à 23 degrés Celsius à 0,2 degré Celsius par seconde dans un thermocycleur PCR. Après avoir incubé la solution d’ARN à 17 degrés Celsius, arrêtez la réaction en ajoutant 10 microlitres de deux fois la concentration du tampon de départ au fur et à mesure que la réaction se poursuit, prenez 10 aliquotes de microlitres et éteignez avec cinq microlitres d’EDTA 0,5 molaire à pH 8 et traitez chaque échantillon pour isoler l’ARN comme décrit dans le manuscrit. Dissoudre l’ARN précipité dans 10 microlitres de tampon de chargement de gel formalisé et préparer un apprêt marqué à l’extrémité non réagie comme décrit dans le texte.Une fois les échantillons préparés, chauffer à 80 degrés Celsius. Chargez cinq microlitres de l’échantillon dans chaque puits et faites fonctionner le gel à 40 watts pendant environ 40 minutes. Après avoir retiré la plaque de gel du support, scannez à l’aide d’un scanner de gel fluorescent ou phosphorescent pour visualiser les produits d’extension de l’ARN L chiral croisé.Après la purification du gel, l’ombrage uv révèle la présence de 5'triphosphate en tant que produit majeur unique, comme indiqué pour les trimères d’ADN AAA et CCC et le trimère d’ARN L GAA. Le produit secondaire 5'hydroxyle est souvent visible comme une bande de migration plus lente, qui a été isolée et identifiée par spectrométrie de masse pour les trimères d’ADN. Des bandes supplémentaires pendant la purification du gel sont en corrélation avec les produits secondaires 5'diphosphate, monophosphate et H-phosphonate en spectrométrie de masse des produits de réaction non purifiés.Les produits 5'triphosphate présentent un pic massique primaire correspondant au 5'triphosphate ainsi qu’aux masses 5'di et monophosphate. Des trinucléotides d’ARN-L chimiquement liés au triphosphate ont été utilisés avec un amorce d’ARN-L et un modèle d’ARN-L dans une réaction de polymérisation de l’ARN analysée par PAGE et imagée à l’aide d’un scanner de gel fluorescent. Le produit étendu marqué par des cercles noirs a démontré la synthèse d’une version L-ARN du ribozyme à tête de marteau codée par le gabarit.L’exposition à l’eau pendant la triphosphorylation réduira le rendement. Suivez les étapes de préparation des réactifs secs et d’assemblage minutieux de l’appareil de réaction. Déplacez lentement les fluides à travers l’appareil pour éviter la rupture des joints.La triphosphorylation chimique est essentielle à la préparation de triphosphates oligonucléotidiques non biologiques, y compris l’ARN gaucher. Cela a permis la synthèse croisée du ribozyme chiral des versions d’image miroir des molécules d’ARN trouvées en biologie.

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