Cultiver et manipuler génétiquement des nématodes entomopathogènes

Un protocole efficace pour maintenir et amplifier les nématodes entomopathogènes est essentiel pour comprendre la base moléculaire de la pathogénicité des nématodes et l’immunité anti-nématodes de l’hôte. Ce protocole nous permet de produire un grand nombre d’Heterorhabditis bacteriophora symbiotiques et axeniques et de Steinernema carpocapsae IJs en utilisant l’insecte hôte, Galleria mellonella. Commencez par recouvrir la boîte de Pétri d’un morceau de papier filtre et ajoutez environ 10 à 15 larves de Galleria mellonella.

À l’aide d’une pipette, distribuer deux millilitres d’eau contenant environ 25 à 50 juvéniles infectieux pour 10 microlitres de suspension sur les vers de cire. Et conservez la boîte de Petri dans une armoire à température ambiante. Selon l’humidité du papier filtre, ajoutez un à deux millilitres d’eau tous les deux jours.

Les vers de cire infectés par des juvéniles infectieux meurent généralement dans les 48 heures. Préparez les pièges à eau de White environ 10 jours après que les vers de cire ont été infectés par les juvéniles infectieux. Transférez soigneusement les insectes morts sur la partie non trempée du papier filtre.

Utilisez de l’eau du robinet pour remplir la boîte de Petri inférieure et placez un bouchon d’un tube de 15 millilitres comme espaceur pour la ventilation. Utilisez de l’eau du robinet au lieu de l’eau déminéralisée ou désionisée pour éviter l’agrégation des nématodes et assurez-vous que le niveau d’eau dans le piège à eau atteint environ la moitié de la hauteur de la boîte de Pétri. Lorsque l’eau de la petite boîte de Pétri devient trouble à cause des nématodes, utilisez une pipette pour déplacer la nouvelle génération de juvéniles infectieux dans une fiole de culture cellulaire T25 ou T75.

Plus tard, ajoutez de l’eau du robinet jusqu’à 40% de volume ou jusqu’à ce que la densité appropriée soit atteinte. Et stockez la fiole de culture cellulaire horizontalement pour éviter la congestion des nématodes. Transfert répété de juvéniles infectieux dans des flacons de culture cellulaire et ajout d’eau jusqu’à ce que les juvéniles infectieux cessent de sortir des carcasses d’insectes dans environ trois à cinq jours.

À l’aide d’une boucle d’inoculation, grattez plusieurs flocons d’une culture congelée de Photorhabdus temperata Ret16 sur une plaque MacConkey et des stries pour des colonies individuelles. Incuber la plaque pendant deux à trois jours à 28 degrés Celsius. Après l’incubation, inoculer 10 millilitres de bouillon LB avec une colonie sur gélose MacConkey dans un tube de 50 millilitres et incuber la culture pendant la nuit à 28 degrés Celsius dans un incubateur agité.

Après l’incubation, transférer 100 microlitres de culture pendant la nuit d’un tube de 50 millilitres dans un nouveau tube de microcentrifugation, puis laver 100 de la culture pendant la nuit avec 900 microlitres de PBS à force unique par centrifusion, dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre, à 17 900 fois g. Décantez le surnageant. Ensuite, diluez la culture 10 fois dans un PBS à force unique et laissez le tube sur de la glace.

Maintenant, immergez les vers de cire dans une solution à 70% d’éthanol. Après avoir séché les insectes avec une serviette en papier, placez-les dans un tube de 50 millilitres. Placez le tube sur de la glace pendant 20 minutes pour immobiliser les vers de cire.

Utilisez du papier filtre pour couvrir les moitiés supérieure et inférieure d’une boîte de Pétri. Utilisez le couvercle de la boîte de Petri recouvert de papier filtre comme support de base pour l’injection. Humidifiez dans le papier filtre de la boîte de Petri inférieure et transférez-le sur de la glace pour aider les vers de cire injectés à récupérer.

Pipette 50 microlitres de bactéries glacées sur un morceau de Parafilm puis préparer une seringue à aiguille de raffineur de calibre 22 et appuyer doucement sur le piston pour retirer l’air à l’extrémité de l’aiguille. Garder un ver de cire près de l’extrémité postérieure sous le stéréoscope. Injecter une culture bactérienne dans la face dorsale du thorax.

De préférence à la jonction entre deux segments juste en dessous de la cuticule parallèle au ver de cire pour minimiser les dommages internes et faire attention à la façon dont le corps larvaire commence à gonfler. Ensuite, transférez les insectes injectés dans la boîte de Petri de récupération. Et une fois que tous les insectes sont injectés et placés dans la boîte de récupération, placez la boîte de Petri dans l’obscurité.

Les vers de cire succombent deux jours après l’injection et apparaissent rouge brique après environ trois à quatre jours. Cependant, les insectes de couleur brune indiquent une infection bactérienne infructueuse. Sept jours après l’infection, transférez les insectes de la couleur rouge brique caractéristique sur une boîte de Petri recouverte de papier filtre frais et répétez la production de juvéniles infectieux de nématodes symbiotiques.

Pour commencer la stérilisation de surface, recueillir suffisamment de symbiotiques, Heterorhabditis bacteriophora et de juvéniles infectieux axeniques candidats par centrifugation. Pour fabriquer une pastille dans un tube de centrifugeuse de 1,5 millilitre, ajoutez 500 microlitres d’eau de Javel à 5 % à la pastille dans chaque tube de microcentrifugation et inversez le tube. Après une incubation de 10 minutes, centrifuger à 17 900 fois g pendant une minute et retirer le surnageant.

Ensuite, lavez la pastille avec un millilitre d’eau stérile. Centrifugez-le, retirez le surnageant et répétez cette procédure quatre fois de plus. Le graphique montre les résultats de l’évaluation de l’état des nématodes Heterorhabditis bacteriophora qui ont subi une axenisation.

Heterorhabditis bacteriophora de la culture mère portait des cellules symbiotiques Photorhabdus luminescens. Cependant, les nématodes dépourvus de leurs bactéries Associées Photorhabdus luminescens étaient axeniques. Pour maintenir la reproductibilité de votre expérience, striez toujours fraîchement de la culture bactérienne d’une colonie fraîche et retirez la culture pendant la nuit avant qu’elle n’atteigne la face stationnaire.

N’utilisez que le ver de cire Galleria rouge brique pour le piège à eau de White et jetez le reste. Après cette procédure, les nématodes peuvent être utilisés pour étudier l’interaction avec le système immunitaire des insectes. Cette technique ouvre la voie aux chercheurs pour explorer les bases moléculaires du parasitisme des nématodes et de l’immunité anti-nématodes de l’hôte.