Utilisation de la microfluidique et de la microscopie à fluorescence pour étudier la dynamique d’assemblage des filaments et des faisceaux d’actine unique

Nous combinons la microscopie à fluorescence avec la microfluidique pour étudier comment les protéines de liaison à l’actine régulent l’assemblage et le désassemblage des filaments d’actine. Avec la microfluidique, nous sommes en mesure de quantifier les réactions qui se produisent simultanément sur des dizaines de filaments d’actine individuels, tout en contrôlant avec précision les conditions biochimiques et mécaniques. Rappelez-vous que les solutions sont d’abord injectées en parallèle jusqu’à ce qu’elles atteignent la chambre, puis que les filaments sont exposés séquentiellement à chaque solution en modifiant le réglage de la pression.

Pour commencer la préparation du polydiméthylsiloxane, ou PDMS, assemblage de la chambre, préchauffer la plaque chauffante à 100 degrés Celsius. Exposez une chambre PDMS nettoyée et un couvercle en verre glissés dans une boîte de Petri propre à la lumière ultraviolette pendant trois à cinq minutes dans un nettoyant UV profond. Lorsque vous avez terminé, placez la chambre PDMS sur le couvercle de manière à ce que les deux surfaces directement exposées aux UV soient mises en contact.

Pour éliminer les bulles d’air piégées à l’interface de glissement du couvercle PDMS, appuyez doucement sur la surface de la chambre avec un doigt. Appuyez fortement sur les coins et les côtés, en veillant à ce que le plafond de la chambre n’entre pas en contact avec la surface vitrée. Placez la chambre avec le fond en verre face à la plaque chauffante à 100 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, utilisez la chambre immédiatement ou conservez-la dans une boîte de Pétri propre pendant une semaine. Pour rincer le tube d’entrée et de sortie, remplissez un tube de réservoir de 2 millilitres avec 300 microlitres de tampon F, vissez-le sur le support microfluidique et réglez la pression à 300 millibars. Laissez cinq à huit gouttes de tampon F se perdre, puis mettez la pression à zéro et répétez la procédure pour chaque canal.

Ensuite, réglez la pression pour la sortie sur le tube de réservoir de quatre à 50 millibars, une fois qu’une gouttelette sort de la pointe du tube, connectez le tube à la sortie de la chambre PDMS. Lorsque le liquide remplit la chambre et sort de toutes les entrées, réglez la pression de sortie à 20 millibars. Plus tard, réglez la pression du tube du réservoir à 1 à 50 millibars.

Pour éviter d’introduire des bulles d’air, assurez-vous qu’une gouttelette sort du tube et de l’entrée PDMS avant de connecter le tube à l’entrée. Réglez la pression de l’entrée à 30 millibars. Après avoir connecté les entrées deux et trois comme démontré, réglez la pression de toutes les entrées à 20 millibars et la pression de sortie à zéro millibars.

Assurez-vous que les débits dans les entrées sont à peu près égaux. Lorsque vous changez le réservoir, réglez toutes les pressions d’entrée à 12 millibars et la pression de sortie à 5 millibars. Pour injecter rapidement une solution, réglez la pression de l’entrée correspondante à 150 millibars et ajustez la pression dans les autres entrées à environ 100 millibars, de sorte que le débit résultant dans les entrées soit de 500 nanolitres par minute.

Pour changer la solution, remplissez 200 à 300 microlitres de la solution dans un nouveau tube de réservoir et réglez la pression sur le réglage de changement. Ensuite, dévissez le tube de réservoir de l’entrée. Une fois qu’une petite gouttelette s’est formée à l’extrémité du tuyau, vissez le nouveau tube avec la solution fraîche, modifiez le réglage de la pression à haut débit.

Selon la configuration microfluidique et la géométrie de la chambre, attendez trois à cinq minutes que la solution remplisse le tube et atteigne la chambre. Le processus peut être suivi en mesurant l’augmentation de la fluorescence au fil du temps. Pour la fonctionnalisation de surface, changer la solution trois à 200 microlitres de 50 graines de spectrine-actine picomolaire dans un tampon F, et injecter la solution pendant deux minutes avec un débit élevé de trois.

Pour la passivation de surface, changez le tube trois avec 300 microlitres de 5% BSA dans le tampon F, puis injectez pendant cinq minutes à haut débit trois, suivi de cinq minutes à débit moyen trois, avec une pression réduite de sept à huit millibars dans les canaux un et deux pour obtenir un contre-courant de 100 nanolitres par minute. Toute la surface de la chambre sera passivée BSA. Remplacez le tube trois par un tampon F pour rincer le canal pendant cinq minutes à débit élevé trois.

Plus tard, changez les tubes un à trois avec une profiline d’actine micromolaire, une actine micromolaire de 0,15 et un tampon F, respectivement, comme expliqué dans le manuscrit, et injectez des solutions fraîchement préparées en utilisant le préréglage à haut débit pendant trois à quatre minutes. Allumez le microscope et ajustez le temps d’exposition de l’appareil photo à 100 à 200 millisecondes, le laser d’excitation à 10 à 20% de puissance et la fluorescence totale de réflexion interne, ou profondeur TIRF, à 200 à 300 nanomètres pour capturer les images avec un objectif 60X. Ensuite, réglez le réglage de pression sur un débit moyen pendant 10 minutes pour enregistrer la polymérisation du filament au rythme d’une image toutes les 20 secondes, suivi de deux à débit moyen pendant 15 minutes pour le vieillissement du filament.

Capturez la dépolymérisation en mode épifluorescence à une image toutes les cinq secondes, après une à deux images, passez à un flux moyen trois pour enregistrer les filaments dépolymérisés à environ 10 sous-unités par seconde. Pour réinitialiser l’expérience, cassez tous les filaments marqués par fluorescence en les exposant continuellement au laser à la puissance maximale pendant deux minutes. Testez différentes conditions en changeant les solutions une, deux ou trois et en les injectant à haut débit pendant trois à quatre minutes.

Le résultat de l’expérience de polymérisation/dépolymérisation de base est présenté ici. Les kymographes résultants ont été utilisés pour quantifier les taux de polymérisation et de dépolymérisation. Lorsque les filaments d’actine cultivés ont été exposés à une solution de cofiline marquée par fluorescence, les amas de cofiline ont été nucléés et se sont développés vers les extrémités pointues et barbelées.

Lorsque des filaments simples sont exposés à la fascine, ils forment des faisceaux qui semblent plus brillants et ne sont pas parfaitement alignés avec l’écoulement. Il est très important d’éviter d’introduire des bulles d’air dans le système lors du changement de tubes et de faire attention à ne pas vider les tubes du réservoir. Cette technique était essentielle pour appliquer des forces de traction sur des dizaines de filaments simples, examiner la sensibilité mécanique à la formine et à la cofiline et le débranchement ARP2/3.