Name: Caractérisation des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire primaire dans les organes vivants de plantes à l’aide de la microscopie à force atomique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 52 s
Description: Découvrez la caractérisation biomécanique des parois cellulaires primaires dans les organes vivants de jeunes plantes par microscopie à force atomique. Cette méthode permet de mesurer le module d'Young sans fixation ni déshydratation.

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Nous tenons à remercier le Dr Dmitry Suslov (Université d’État de Saint-Pétersbourg, Saint-Pétersbourg, Russie) et le professeur Mira Ponomareva (Institut tatar de recherche scientifique sur l’agriculture, FRC KazSC RAS, Kazan, Russie) pour avoir fourni des semences de maïs et de seigle, respectivement. La méthode présentée a été développée dans le cadre du projet de la Fondation scientifique russe n ° 18-14-00168 attribué à LK. La partie du travail (obtention des résultats présentés) a été réalisée par AP avec le soutien financier de la mission gouvernementale pour le FRC Kazan Scientific Center of RAS.

1. Préparation des échantillons pour les mesures AFM
<ol><li>Matériel végétal: Stériliser les graines de maïs (Zea mays L.) et de seigle (Secale cereale L.) avec une solution de NaOCl à 0,35% pendant 10 min, laver 3x avec de l’eau distillée, puis cultiver en hydroponie dans l’obscurité à 27 °C pendant 4 jours et 2 jours, respectivement. Des racines primaires ont été utilisées pour l’expérience.</li>
	<li>Préparation des solutions et de l’échantillon pour la section des vibratomes<ol><li>Préparer la solution d’agarose pour l’encastrement des racines en dissolvant 3 % (p/p) d’agarose à bas point de fusion dans de l’eau à l’aide d’un four à micro-ondes. NOTE: Toutes les expériences ont été effectuées dans l’eau. Si un tampon ou tout autre type de milieu est nécessaire pour l’étude, il est préférable d’utiliser le même milieu pour la préparation de l’agarose, pendant la section, et dans la cellule liquide de l’AFM pour éviter d’endommager l’échantillon.</li>
		<li>Versez une couche de 4 mm d’agarose à 3% fondu sur le fond de la boîte de Petri (diamètre = 35 mm) et laissez-la refroidir légèrement pour éviter d’endommager l’échantillon par la chaleur.</li>
		<li>Placer trois ou quatre petits morceaux (environ 5 mm de long) de l’organe végétal étudié horizontalement sur l’agarose. REMARQUE : Les échantillons doivent être à moitié immergés, mais pas immergés dans la couche d’agarose. Si l’échantillon n’est pas immergé, il peut sortir de l’agarose pendant la section du vibratome. Si l’échantillon coule au fond, il sera trop près du bord de la section et deviendra gênant pour les étapes ultérieures.</li>
		<li>Lorsqu’un film mince et semi-solide apparaît sur la première couche d’agarose (30-60 s), versez soigneusement une deuxième couche sur le dessus. REMARQUE : La couche inférieure d’agarose ne doit pas se solidifier complètement. Sinon, les deux couches peuvent se séparer l’une de l’autre lors de travaux ultérieurs.</li>
		<li>Une fois l’agarose complètement solidifiée, découpez le bloc contenant le spécimen. Façonnez le bloc en une pyramide tronquée hexagonale pour assurer sa stabilité lors d’une section ultérieure (Figure 1A). Remarque : L’échantillon peut être orienté verticalement ou horizontalement dans ce bloc selon le type de section requis. Lors de la préparation du bloc, laissez 2-3 mm d’agarose autour du spécimen. Dans ce cas, la section de l’échantillon sera retenue par la couche d’agarose à 3%, ce qui facilitera son immobilisation ultérieure (Figure 1B).</li>
	</ol></li>
	<li>Sectionnement de l’échantillon avec le vibratome<ol><li>Collez le bloc à l’étage de vibratome avec un adhésif cyanoacrylate. Placez la scène dans le vibratome de sorte que l’un des coins de la pyramide fasse face à la lame du vibratome. Versez de l’eau dans le bain de vibratome.</li>
		<li>Réglez les paramètres de sectionnement (épaisseur de section, vitesse de la lame et fréquence de vibration) et coupez l’échantillon. REMARQUE : Utilisez les épaisseurs de section comprises entre 200 et 400 μm. Une section trop mince peut introduire des erreurs dans l’évaluation des propriétés mécaniques, tandis qu’une section trop épaisse est sujette à la rupture. Une vitesse de lame de 1,3 mm·s-1 et une fréquence d’oscillation de 90 Hz ont été utilisées pour les racines de seigle et de maïs.</li>
		<li>À l’aide d’une brosse fine, déplacez la section du bain-marie sur une lame de verre et placez une goutte d’eau sur la section pour l’empêcher de se dessécher. Vérifiez la qualité de la section au microscope optique. REMARQUE : Les sections obliques ne peuvent pas être utilisées pour mesurer le module d’élasticité. Les parois cellulaires doivent être perpendiculaires au plan de section, sinon elles peuvent se plier ou se déformer sous la pointe AFM.</li>
	</ol></li>
	<li>Immobilisation de la section pour les mesures AFM (Figure 1B)<ol><li>Verser une couche d’agarose fondue à 1 % (p/p) (~1 mL) sur le fond du capuchon de la boîte de Petri à l’aide d’une pipette. REMARQUE: Assurez-vous que les côtés du capuchon de la boîte de Petri n’empêchent pas la pointe de s’approcher de l’échantillon. La couche d’agarose doit avoir une épaisseur de 1 mm et couvrir tout le fond du chapeau.</li>
		<li>Une fois que l’agarose à 1 % s’est solidifiée, enlever l’excès d’eau de la section en amenant le papier filtre sur son bord. REMARQUE: Ne touchez pas la section de la plante avec le papier pour éviter d’endommager et de sécher complètement l’échantillon.</li>
		<li>Transférez délicatement la section de la lame au centre du capuchon vaisselle de Petri à l’aide d’un pinceau. À l’aide d’une pipette de 20 μL, ajouter délicatement 1 % d’agarose autour de la section (figure 1B). REMARQUE : L’agarose à 1 % ne doit pas se retrouver sur l’échantillon lui-même. Il ne doit couvrir que les bords de la couche d’agarose à 3% qui retient le spécimen de la plante. L’agarose à 1% devrait former de petites buttes sur les bords de cette couche d’agarose à 3%. De grandes buttes peuvent empêcher le porte-à-faux de s’approcher de l’échantillon.</li>
		<li>Verser l’eau ou toute autre solution à utiliser pour l’AFM dans le bouchon de la boîte de Petri avec la section immobilisée.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Préparation et étalonnage de l’AFM
NOTE: La méthode force-volume de l’AFM génère un tableau spatialement résolu de courbes force-distance obtenues en chaque point de la zone étudiée. Obtenez tous les paramètres du mode force-volume (rigidité en porte-à-faux, IOS, etc.) en mode contact. Des procédures similaires pour les instruments d’autres fabricants ont été décrites précédemment10,20.
<ol><li>Sélectionnez le type de porte-à-faux approprié. NOTE: La rigidité en porte-à-faux doit être comparable à la rigidité de l’échantillon21. Un porte-à-faux beaucoup plus rigide que l’échantillon ne déviera pas beaucoup, tandis qu’un porte-à-faux trop mou ne déformera pas suffisamment l’échantillon. Une fréquence de résonance typique devrait être suffisante pour faire basculer le porte-à-faux dans le liquide (c.-à-d. être d’au moins quelques dizaines de kHz). La surface de contact doit être petite par rapport à la taille de la paroi cellulaire puisque l’échantillon étudié dans les calculs de module de Young est supposé être un demi-espace infini. Les porte-à-faux suivants ont été utilisés pour les racines de seigle et de maïs: des porte-à-faux pointus avec une fréquence de résonance typique de 60 kHz, une constante de ressort moyenne de 1,5 N·m-1 et un rayon d’apex de 10 nm, ou des porte-à-faux sphériques avec une fréquence de résonance typique de 75 kHz, une constante de ressort moyenne de 2,8 N·m-1, et un rayon d’apex de 150 nm.</li>
	<li>Allumez l’appareil AFM et le logiciel associé (Table des matériaux). Montez le porte-à-faux sur le support de pointe de la cellule liquide. Placez une goutte de liquide sur l’embout pour éviter la formation de bulles d’air sur l’embout tout en l’immergeant dans le liquide. REMARQUE: En cas de formation de bulles, le liquide peut être retiré avec une lingette de précision, puis une nouvelle goutte peut être placée.</li>
	<li>Montez le porte-pointe sur la tête de numérisation.</li>
	<li>Placez un échantillon dur (lame de verre frais) dans un capuchon de boîte de Pétri. Versez-y le liquide, en veillant à ce qu’il couvre la lame. Placez la tête de balayage sur la scène et soulevez l’échantillon de sorte que le liquide recouvre le porte-à-faux.</li>
	<li>Choisissez l’onglet Têtes dans le menu déroulant Outils . Assurez-vous que la tête de balayage de la cellule liquide est sélectionnée.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Visée pour ouvrir la fenêtre Visée laser. Cliquez sur le bouton Appareil photo pour ouvrir la fenêtre Microscope optique. Positionnez le laser à l’extrémité du porte-à-faux, en utilisant les vis sur la tête AFM et la fenêtre du microscope optique pour l’orientation.</li>
	<li>Choisissez le mode Semi-contact dans le menu déroulant de la fenêtre principale du programme.</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Résonance et choisissez le type de porte-à-faux utilisé dans le menu Sondes . Cliquez sur le bouton Auto pour déterminer la fréquence de résonance. REMARQUE: Si le porte-à-faux utilisé n’est pas répertorié, ouvrez Outils > Probe Passport. Créez un nouveau fichier, entrez les paramètres cantilever et enregistrez-le. Ensuite, choisissez-le dans le menu déroulant Sondes .</li>
	<li>Choisissez le mode Contact dans le menu déroulant de la fenêtre principale du programme.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton N_Force Cal pour ouvrir la fenêtre d’étalonnage en porte-à-faux. Choisissez le porte-à-faux utilisé et cliquez sur le bouton Sweep , puis sur le bouton Spect Meas pour déterminer la constante de ressort en porte-à-faux à l’aide de la procédure de réglage thermique. Fermez la fenêtre.</li>
	<li>Définissez le point de consigne sur 1 nA. Ouvrez l’onglet Approche et cliquez sur le bouton Atterrissage pour vous approcher de l’échantillon.</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Analyse . Réglez la fréquence de balayage sur 0,5 Hz. Cliquez sur le bouton Zone et définissez la taille de numérisation sur 10 μm x 10 μm et le point de numérisation sur 256 x 256. Cliquez sur le bouton Exécuter et scannez environ 20 lignes pour vérifier qu’il n’y a pas de contamination sur le verre. Cliquez sur le bouton Arrêter pour terminer l’analyse sans perdre de données.</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Courbes . Définissez les paramètres de rétraction et d’approche à 500 nm et -100 nm, respectivement.</li>
	<li>Choisissez le dernier balayage dans le menu déroulant Sélectionnez Image pour observer la surface.</li>
	<li>Trouvez une zone propre sur le verre et indiquez le point où la courbe force-déformation doit être prise, puis cliquez sur le bouton Exécuter pour obtenir la courbe. Enregistrez trois à cinq courbes de force à différents endroits sur le scan.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Données pour ouvrir la fenêtre d’analyse et sélectionnez le cadre avec la courbe force-déformation.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Pair Markers et indiquez la partie linéaire de la courbe de rétraction pour calculer le rapport du signal DFL au déplacement, qui est la sensibilité optique inverse (IOS, nA nm-1) ou la sensibilité de déflexion.</li>
	<li>Répétez l’étape 2.17 pour toutes les courbes enregistrées et notez toutes les valeurs calculées du rapport signal / déplacement DFL. Ils devraient être les mêmes.</li>
	<li>Fermez la fenêtre d’analyse, cliquez sur l’onglet Approche , puis sur le bouton Supprimer pour retirer la sonde de l’échantillon.</li>
</ol>3. Acquisition des données
<ol><li>Guidez l’échantillon sous le porte-à-faux AFM à l’aide du microscope optique. Cliquez sur l’onglet Approche , puis sur le bouton Atterrissage pour approcher l’échantillon en mode contact avec un point de consigne de 1 nA.</li>
	<li>Cliquez sur l’onglet Numérisation , puis sur le bouton Zone . Sélectionnez la taille de zone de 70 μm x 70 μm à numériser.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Déplacer la sonde et vérifiez toute la zone de numérisation en déplaçant le scanner dessus. En fonction du degré de saillie du scanner, trouvez le point le plus élevé.</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Approche , puis cliquez sur le bouton Supprimer pour vous rétracter de l’échantillon. En utilisant le point le plus élevé comme cible, cliquez sur le bouton Atterrissage pour vous approcher à nouveau de l’échantillon. Ensuite, vérifiez à nouveau la surface en cliquant sur le bouton Déplacer la sonde et en déplaçant le scanner dessus. Aucun des points de la zone ne doit nécessiter que le scanner soit complètement relevé. REMARQUE: Idéalement, la plage z du scanner devrait dépasser la différence de hauteur de l’échantillon. Cependant, il est acceptable si certains points de la zone de numérisation sont inférieurs à la capacité du scanner. En même temps, il ne devrait pas y avoir beaucoup de points de ce genre. De grandes zones qui ne peuvent pas être atteintes par le scanner peuvent provoquer l’avortement par balayage.</li>
	<li>Définissez la fréquence de balayage sur 0,5 Hz. Définissez la taille de numérisation sur 70 μm x 70 μm et le point de numérisation sur 64 x 64. Cliquez sur le bouton Exécuter et scannez pour vérifier la surface de l’échantillon et sa contamination possible par l’agarose. REMARQUE: Si l’échantillon a des cellules avec une grande lumière, la taille de la zone de balayage peut être réduite, ou il doit être déplacé afin qu’il y ait plus de parois cellulaires sur le scan.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton On en haut de la fenêtre principale pour désactiver la boucle de rétroaction.</li>
	<li>Choisissez le mode HDPlus (méthode force-volume) dans le menu déroulant de la fenêtre principale du programme. Une fenêtre supplémentaire (fenêtre HD) apparaîtra.</li>
	<li>Définissez le point de consigne sur 0,1 nA dans la fenêtre principale du programme.</li>
	<li>Dans l’onglet Principal de la fenêtre HD, définissez les paramètres de balayage (amplitude et fréquence du mouvement sinusoïdal en porte-à-faux) appropriés à l’échantillon étudié. REMARQUE: Chaque type d’échantillon et de porte-à-faux nécessite la sélection des paramètres de numérisation. Quelques expériences préliminaires sont nécessaires. Pour les racines de maïs ou de seigle, des porte-à-faux tranchants et sphériques ont été utilisés à une amplitude de 400 nm et à une fréquence de 300 Hz.</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Bruits dans la fenêtre HD et entrez la fréquence de résonance du porte-à-faux.</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Quant de la fenêtre HD et entrez IOS, rigidité en porte-à-faux, rayon et angle de pointe. Sélectionnez le modèle de contact qui sera utilisé pour les calculs en fonction de la géométrie de la pointe. REMARQUE: Le modèle DMT prend en compte la force d’adhérence existant entre la sonde et l’échantillon, et est le plus couramment utilisé en mécanobiologie21.</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Scan de la fenêtre HD et sélectionnez les signaux à enregistrer. Sélectionnez la direction dans laquelle le signal est enregistré. Cochez la case Forcer le volume pour obtenir un enregistrement de toutes les courbes de force. REMARQUE: Enregistrez le signal du module d’élasticité dans les directions avant et arrière. Il fournira plus de points à calculer.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Désactivé en haut de la fenêtre principale du programme pour activer la boucle de rétroaction.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton PhaseCorr dans la fenêtre HD principale pour corriger la sensibilité du système optique.</li>
	<li>L’onglet vs Time de la fenêtre HD principale présente la fonction du signal DFL par rapport au temps en temps réel; Sélectionnez les parties de cette fonction qui seront utilisées pour la détermination du niveau de référence et pour ajuster le modèle de contact pour d’autres calculs.</li>
	<li>Définissez la valeur du point de balayage sur 256 x 256 dans la fenêtre principale du programme. Réglez la fréquence d’analyse sur 0,2 Hz et cliquez sur le bouton Exécuter pour analyser l’échantillon.</li>
	<li>Une fois la numérisation terminée, cliquez sur le bouton On en haut de la fenêtre principale pour désactiver la boucle de rétroaction.</li>
	<li>Choisissez le mode Contact dans le menu déroulant, ouvrez l’onglet Approche et cliquez sur le bouton Supprimer pour vous retirer de l’échantillon.</li>
	<li>Cliquez sur le bouton Données pour ouvrir le logiciel d’analyse et enregistrer la sortie.</li>
	<li>À la fin de la journée de mesure, retirez le porte-embout en porte-à-faux de la tête et rincez-le soigneusement à l’eau ultrapure plusieurs fois. Chaque fois, retirez l’eau avec une lingette de précision.</li>
</ol>4. Évaluation et post-traitement des données
REMARQUE : Ne vous fiez pas aux valeurs de module d’élasticité calculées automatiquement. Étant donné que la surface varie considérablement en hauteur, de nombreuses courbes d’artefacts doivent être expulsées.
<ol><li>Ouvrez le fichier enregistré dans le logiciel d’analyse.</li>
	<li>Sélectionnez le cadre HDForceVolume .</li>
	<li>Maintenez la touche Ctrl enfoncée et sélectionnez une image visuelle obtenue dans le même sens de numérisation. Cliquez sur le bouton Charger la carte externe pour voir où se trouvent les parois cellulaires. REMARQUE : Toute carte de signaux peut être utilisée comme cadre visuel, mais l’utilisation de la carte de signaux LDF (différents instruments peuvent l’appeler un signal de déviation ou un signal d’erreur) peut être le moyen le plus simple.</li>
	<li>Vérifiez les valeurs de rigidité InvOptSens (IOS) et cantilever dans l’onglet Principal.</li>
	<li>Ouvrez l’onglet Supplémentaire et vérifiez les paramètres de l’astuce et le modèle de contact.</li>
	<li>Cliquez sur différents points des parois cellulaires du cadre visuel et sélectionnez uniquement les courbes bien décrites par le modèle. Voir Résultats représentatifs pour plus de détails.</li>
	<li>Notez les valeurs obtenues.</li>
</ol>

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<li>Braunsmann, C., Schaffer, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Note%3A+Artificial+neural+networks+for+the+automated+analysis+of+force+map+data+in+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Review+of+Scientific+Instruments%22%5BJournal%5D)">Note: Artificial neural networks for the automated analysis of force map data in atomic force microscopy.</a> Review of Scientific Instruments. 85 (5), 056104(2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires déterminent la direction et le taux de croissance des cellules végétales, et donc la taille et la forme futures de la plante. La méthode basée sur l’AFM présentée ici complète les techniques existantes qui sont utilisées pour étudier les propriétés des parois cellulaires végétales. Il permet d’étudier l’élasticité des parois cellulaires, qui appartiennent aux tissus internes de la plante. En utilisant la méthode présentée, les propriétés mécaniques des parois cel...

Les propriétés mécaniques de la paroi cellulaire végétale déterminent la forme de la cellule et sa capacité à se développer. Par exemple, l’extrémité en croissance du tube pollinique est plus molle que les parties non en croissance du même tube1. La formation de primordia sur le méristème d’Arabidopsis est précédée d’une diminution locale de la rigidité de la paroi cellulaire sur le site du futur primordium 2,3. Les parois cellulaires d’Arabidopsis hypocotyle, qui sont parallèles à l’axe de croissance principal et se développent plus rapidement, sont plus molles que celles qui sont perpendiculaires à cet axe et se développent plus lentement 4,5. Dans la racine de maïs, la transition des cellules de la division à l’élongation s’est accompagnée d’une diminution des modules élastiques dans tous les tissus de la racine. Les modules sont restés faibles dans la zone d’allongement et ont augmenté dans la zone d’allongement tardif6.
Malgré la disponibilité de diverses méthodes, les grands réseaux d’informations biochimiques et génétiques sur la biologie de la paroi cellulaire obtenus chaque année sont rarement comparés aux propriétés mécaniques des parois cellulaires. Par exemple, les mutants sur les gènes liés à la paroi cellulaire ont souvent une croissance et un développement altérés 4,7,8, mais sont rarement décrits en termes de biomécanique. L’une des raisons en est la difficulté d’effectuer des mesures aux niveaux cellulaire et subcellulaire. La microscopie à force atomique (AFM) est actuellement la principale approche pour de telles analyses9.
Au cours des dernières années, de nombreuses études basées sur l’AFM sur la biomécanique de la paroi cellulaire végétale ont été réalisées. Les propriétés mécaniques des parois cellulaires des tissus externes d’Arabidopsis 2,3,4,5,10,11 et de l’oignon 12, ainsi que des cellules cultivées13,14,15, ont été étudiées. Cependant, les cellules superficielles d’une plante peuvent avoir des parois cellulaires dont les propriétés mécaniques diffèrent de celles des tissus internes6. De plus, les cellules végétales sont pressurisées par la turgescence, ce qui les rend plus rigides. Pour se débarrasser de l’influence de la pression de turgescence, les chercheurs doivent utiliser des solutions plasmolysantes 2,3,4,5,10,11 ou décomposer les valeurs obtenues en apports de turgescence et de paroi cellulaire 12. La première approche conduit à la déshydratation de l’échantillon et modifie l’épaisseur et les propriétés de la paroi cellulaire16, tandis que la seconde approche nécessite des mesures supplémentaires et des mathématiques compliquées, et ne s’applique qu’aux cellules de forme relativement simple12. Les propriétés de la paroi cellulaire des tissus internes peuvent être évaluées sur des cryosections17 ou des sections de matériel végétal imprégnées de résine8. Cependant, les deux méthodes impliquent la déshydratation et / ou l’imprégnation des échantillons, ce qui entraîne inévitablement des changements dans les propriétés. Les propriétés des cellules isolées ou cultivées sont difficiles à relier à la physiologie de la plante entière. La culture et l’isolement des cellules végétales peuvent affecter les propriétés mécaniques de leurs parois cellulaires.
La méthode présentée ici complète les approches susmentionnées. En l’utilisant, les parois cellulaires primaires de n’importe quel tissu et à n’importe quel stade du développement de la plante peuvent être examinées. Les observations de sectionnement et d’AFM ont été effectuées dans un liquide, ce qui évite la déshydratation de l’échantillon. Le problème de la turgescence a été résolu au fur et à mesure que les cellules sont coupées. Le protocole décrit le travail avec les racines de maïs et de seigle, mais tout autre échantillon peut être examiné s’il convient à la section des vibratomes.
Les études AFM décrites ici ont été réalisées à l’aide de la technique force-volume. Différents instruments utilisent des noms différents pour cette méthode. Cependant, le principe de base est le même; Une carte force-volume de l’échantillon est obtenue par un mouvement sinusoïdal ou triangulaire du porte-à-faux (ou échantillon) pour atteindre une certaine force de charge à chaque point analysé, tout en enregistrant la déviation en porte-à-faux18. Le résultat combine une image topographique de la surface et le tableau des courbes force-distance. Chaque courbe est utilisée pour calculer la déformation, la rigidité, le module de Young, l’adhérence et la dissipation d’énergie en un point spécifique. Des données similaires peuvent être obtenues par spectroscopie de force point par point après balayage en modecontact 19, bien que cela prenne plus de temps.

<table><tbody><tr><td>Agarose, point de fusion bas</td><td>Helicon</td><td>B-5000-0.1</td><td>pour la fixation de l’échantillon</td></tr><tr><td>Brosse</td><td>-</td><td>-</td><td>pour section</td></tr><tr><td>mobile Cantilevers</td><td>NanoTools, Allemagne</td><td>NT_B150_v0020-5</td><td>Modèle : Biosphere B150-FM</td></tr><tr><td>Cantilevers</td><td>NT-MDT, Russie</td><td>FMG01/50</td><td>Modèle : FMG01</td></tr><tr><td>Adhésif cyanoacrylate</td><td>-</td><td>-</td><td>pour </td></tr><tr><td>Lames en verre</td><td>Heinz Herenz</td><td>1042000</td><td>pour la vibratomie et l’étalonnage AFM</td></tr><tr><td>Logiciel ImageAnalysis P9</td><td>NT-MDT, Russie</td> <td>-</td> <td>pour l’analyse des données</td></tr><tr><td>Microscope à épifluorescence Leica DM1000</td><td>Leica Biosystems, Allemagne</td><td>11591301</td><td>pour le contrôle de section</td></tr><tr><td>NaOCl</td> <td>-</td><td></td> <td>pour la stérilisation des semences</td></tr><tr><td>Nova PX 3.4.1 Logiciel</td><td>NT-MDT,</td> <td>Russie-pour</td> <td>les expériences menées Microscope</td></tr><tr><td>NTEGRA Prima avec contrôleur HD</td><td>NT-MDT, Russie-pour</td><td></td> <td>l’AFM et l’acquisition de données</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>153066</td><td>pour la fixation d’échantillons</td></tr><tr><td>Pipette à pointe 1000 &micro ; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Pipette à</td> <td>4642092-Tip</td></tr> <tr><td>2-20 & micro ; L</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td> <td>4642062-Eau</td></tr> <tr><td>ultrapure</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Vibratome Leica VT 1000S</td><td>Leica Biosystems, Allemagne</td><td>1404723512</td><td>pour la coupe d’échantillons</td></tr></tbody></table>

caractérisation des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire primaire dans les organes vivants de plantes à l’aide de la microscopie à force atomique

Characterizing Mechanical Properties of Primary Cell Wall in Living Plant Organs Using Atomic Force Microscopy

Les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires déterminent la direction et le taux de croissance des cellules végétales et, par conséquent, la taille et la forme futures de la plante. De nombreuses techniques sophistiquées ont été développées pour mesurer ces propriétés; Cependant, la microscopie à force atomique (AFM) reste la plus pratique pour étudier l’élasticité de la paroi cellulaire au niveau cellulaire. L’une des limites les plus importantes de cette technique a été que seules les cellules vivantes superficielles ou isolées peuvent être étudiées. Ici, l’utilisation de la microscopie à force atomique pour étudier les propriétés mécaniques des parois cellulaires primaires appartenant aux tissus internes d’un corps végétal est présentée. Ce protocole décrit les mesures du module apparent de Young des parois cellulaires dans les racines, mais la méthode peut également être appliquée à d’autres organes végétaux. Les mesures sont effectuées sur des coupes de matériel végétal dérivées de vibratomes dans une cellule liquide, ce qui permet (i) d’éviter l’utilisation de solutions plasmolysantes ou d’imprégnation d’échantillons avec de la cire ou de la résine, (ii) de rendre les expériences rapides et (iii) de prévenir la déshydratation de l’échantillon. Les parois cellulaires anticlinales et périclinales peuvent être étudiées, selon la façon dont le spécimen a été sectionné. Les différences dans les propriétés mécaniques des différents tissus peuvent être étudiées dans une seule section. Le protocole décrit les principes de planification de l’étude, les problèmes liés à la préparation et aux mesures des éprouvettes, ainsi que la méthode de sélection des courbes force-déformation pour éviter l’influence de la topographie sur les valeurs obtenues du module d’élasticité. La méthode n’est pas limitée par la taille de l’échantillon, mais est sensible à la taille des cellules (c.-à-d. que les cellules avec une grande lumière sont difficiles à examiner).

Les cartes typiques du module d’élasticité et du LDF, ainsi que les courbes de force obtenues sur les racines de seigle et de maïs par la méthode décrite, sont présentées à la figure 2. La figure 2A montre les cartes du module d’élasticité et du LDF obtenues sur la section transversale de la racine primaire du seigle. Les zones blanches dans la carte des modules (Figure 2A, à gauche) correspondent à une surestimation erronée du modu...

Les études de la biomécanique de la paroi cellulaire sont essentielles pour comprendre la croissance et la morphogenèse des plantes. Le protocole suivant est proposé pour étudier les parois cellulaires primaires minces dans les tissus internes des jeunes organes végétaux à l’aide de la microscopie à force atomique.

Caractérisation des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire primaire dans les organes vivants de plantes à l’aide de la microscopie à force atomique

The mechanical properties of the primary cell walls determine the direction and rate of plant cell growth and, therefore, the future size and shape of the ...

La croissance des cellules végétales est contrôlée par les propriétés mécaniques de leurs parois cellulaires. Par conséquent, il est important de connaître ces propriétés dans différents organes et tissus des plantes. La méthode présentée ici permet la caractérisation biomécanique des parois cellulaires non fixes et non déshydratées dans les tissus internes des jeunes plantes.Commencez par préparer les solutions et l’échantillon pour la section du vibratome. Versez une couche de quatre millimètres de 3% d’agarose fondu sur le fond de la boîte de Petri et laissez-la refroidir légèrement pour éviter d’endommager l’échantillon par la chaleur. Placez environ cinq millimètres de long trois ou quatre morceaux de l’organe de la plante horizontalement sur l’agarose.Environ 30 à 60 secondes plus tard, un mince film semi-solide apparaîtra au-dessus de la première couche d’agarose. Ensuite, versez soigneusement une deuxième couche sur le dessus. Une fois l’agarose complètement solidifiée, découpez le bloc contenant le spécimen.Façonnez le bloc en une pyramide tronquée hexagonale pour assurer sa stabilité lors de la section ultérieure. Avant de commencer la section de l’échantillon avec le vibratome, collez le bloc à l’étage du vibratome avec un adhésif cyanoacrylate. Placez la scène dans le vibratome, de sorte que l’un des coins de la pyramide fasse face à la lame du vibratome et versez de l’eau dans le bain de vibratome.Définissez les paramètres de sectionnement tels que l’épaisseur de la section, la vitesse de la lame et la fréquence de vibration et coupez l’échantillon. À l’aide d’une brosse fine, déplacez la section du bain-marie sur une lame de verre et placez une goutte d’eau sur la section pour l’empêcher de se dessécher. Après avoir vérifié la qualité de la section au microscope optique, sélectionnez la section appropriée ayant une paroi cellulaire perpendiculaire au plan de la section.Ensuite, immobiliser la section pour les mesures de microscopie à force atomique en versant une couche d’un millilitre d’agarose fondue à 1% sur le fond du capuchon de la boîte de Petri à l’aide d’une pipette. Une fois que l’agarose s’est solidifiée, enlever l’excès d’eau de la section en amenant le papier filtre sur son bord. Transférez délicatement la section de la lame au centre du capuchon vaisselle de Petri à l’aide d’un pinceau.Ensuite, ajoutez soigneusement 1% d’agarose autour de la section à l’aide d’une pipette de 20 microlitres et versez l’eau ou une autre solution pour la microscopie à force atomique dans le capuchon de la boîte de Petri avec la section immobilisée. Guidez l’échantillon sous le porte-à-faux de microscopie à force atomique à l’aide du microscope optique. Cliquez sur le bouton Approche, puis sur le bouton Atterrissage pour approcher l’échantillon en mode contact avec un point de consigne d’un nanoampère.Cliquez sur le bouton Numérisation, puis sur le bouton Zone. Sélectionnez la taille de zone de 50 micromètres par 50 micromètres à numériser. Cliquez sur le bouton Déplacer la sonde et vérifiez toute la zone de numérisation en déplaçant le scanner dessus et en trouvant le point le plus élevé en fonction du degré de saillie du scanner.Ouvrez l’onglet Approche. Cliquez ensuite sur le bouton Supprimer pour vous rétracter de l’échantillon. En utilisant le point le plus élevé comme cible, cliquez sur le bouton Atterrissage pour vous approcher à nouveau de l’échantillon.Vérifiez ensuite à nouveau la surface en cliquant sur le bouton Déplacer la sonde et en déplaçant le scanner dessus. Réglez la fréquence de balayage sur 0,5 hertz, définissez la taille de numérisation sur 50 micromètres sur 50 micromètres et le point de balayage sur 64 sur 64. Cliquez sur le bouton Exécuter et scannez pour vérifier la surface de l’échantillon et sa contamination possible par l’agarose.Après avoir cliqué sur le bouton On, choisissez le mode HDPlus dans le menu déroulant de la fenêtre principale du programme et définissez le point de consigne sur 0,1 nanoampère dans la fenêtre principale du programme. Dans l’onglet principal de la fenêtre HD, définissez les paramètres de numérisation appropriés à l’échantillon étudié. Ouvrez ensuite l’onglet Bruits dans la fenêtre HD et entrez la fréquence de résonance du porte-à-faux.Ouvrez l’onglet Quant de la fenêtre HD et entrez l’IOS, la rigidité en porte-à-faux, le rayon de pointe et l’angle. Sélectionnez le modèle de contact, qui sera utilisé pour les calculs en fonction de la géométrie de la pointe. Après cela, ouvrez l’onglet Scan de la fenêtre HD et sélectionnez les signaux, ainsi que la direction dans laquelle le signal est enregistré.Cochez la case Force Volume pour obtenir un enregistrement de toutes les courbes de force et cliquez sur le bouton Off en haut de la fenêtre principale du programme pour activer la boucle de rétroaction Cliquez sur le bouton Phase Core dans la fenêtre HD principale pour corriger la sensibilité du système optique. L’onglet Versus Time de la fenêtre HD principale présente la fonction du signal DFL en fonction du temps en temps réel. Sélectionnez les parties de cette fonction qui seront utilisées pour la détermination du niveau de référence et pour ajuster le modèle de contact pour d’autres calculs.Maintenant, définissez la valeur du point d’analyse sur 256 par 256 dans la fenêtre principale du programme. Ensuite, réglez la vitesse de balayage sur 0,2 hertz et cliquez sur le bouton Exécuter pour analyser l’échantillon. Une fois la numérisation terminée, cliquez sur le bouton On en haut de la fenêtre principale pour désactiver la boucle de rétroaction.Choisissez Mode Contact dans le menu déroulant, ouvrez l’onglet Approche et cliquez sur le bouton Supprimer pour vous retirer de l’échantillon. Cliquez sur le bouton Données pour ouvrir le logiciel d’analyse et enregistrer la sortie. Ouvrez le fichier enregistré dans le logiciel d’analyse.Sélectionnez l’image HD force volume. Maintenez la touche Ctrl enfoncée et sélectionnez une image visuelle obtenue dans la même direction de numérisation. Cliquez sur le bouton Charger la carte externe pour voir où se trouvent les parois cellulaires.Vérifiez les valeurs de rigidité InvOptSens et cantilever dans l’onglet principal. Ouvrez l’onglet Supplémentaire et vérifiez les paramètres de l’astuce et le modèle de contact. Cliquez sur différents points des parois cellulaires du cadre visuel et sélectionnez uniquement les courbes bien décrites par le modèle.Les zones blanches dans la carte de module correspondent à une surestimation erronée du module de Young due au scanner atteignant sa limite dans la direction Z. Cette image ne peut pas être utilisée comme carte externe pour une sélection ultérieure de courbes de force satisfaisantes. Cependant, la carte des signaux LDF présentée à droite convient mieux ici.Différents instruments peuvent se référer aux signaux DFL en tant que signaux de déviation ou d’erreur. Le scanner qui a été complètement étendu en essayant d’atteindre le fond de l’échantillon peut entraîner des mesures erronées et même des balayages interrompus. La présence d’agarose peut être vérifiée lors de l’obtention du premier balayage en mode contact car les parois cellulaires et certains fonds cellulaires sont visibles sur ces scans.Cependant, en cas d’immobilisation imprécise, la surface peut être recouverte d’agarose, ce qui masque la topographie de l’échantillon. Sur quatre courbes de force différentes enregistrées en différents points de la même paroi cellulaire, la courbe enregistrée à 0,1 ne montre aucune ligne de base, ce qui signifie aucune séparation de la pointe en porte-à-faux de la paroi cellulaire. La courbe enregistrée à 0,3 montre un épaulement sur la partie approchante indiquant une flexion de la paroi cellulaire.Les points deux et quatre montrent des courbes de force satisfaisantes avec des valeurs de modules similaires. La préparation et l’examen des échantillons nécessitent de la pratique, mais ils peuvent être maîtrisés. Une partie cruciale de ce protocole consiste à filtrer les courbes résultantes.Ne vous fiez pas aux modules, qui ont été calculés automatiquement. La même technique peut être utilisée pour mesurer les forces d’adhésion ou la dissipation d’énergie. Il peut également être important pour la description du comportement viscose ou viscoélastique de certains matériaux.

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Caractérisation des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire primaire dans les organes vivants de plantes à l’aide de la microscopie à force atomique (Vidéo) | JoVE Journal

Caractérisation des propriétés mécaniques de la paroi cellulaire primaire dans les organes vivants de plantes à l’aide de la microscopie à force atomique

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