Name: Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-04-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 20 s
Description: Apprenez l'électroporation de l'ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris. Cette méthode permet un transfert de gènes efficace sans compromettre la contractilité musculaire.

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Toutes les expériences utilisant des animaux ont été réalisées au Penn State College of Medicine, approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Pennsylvanie, et réalisées conformément aux normes éthiques établies dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs. Des souris femelles C57BL/6 âgées de 12 semaines ont été utilisées pour cette procédure. Tous les outils chirurgicaux ont été autoclavés pour la stérilité avant l’expérimentation.
1. Préparation d’injection/électroporation TA et EDL
REMARQUE: Ces étapes sont identiques pour la préparation d’injection / électroporation TA et EDL.
<ol><li>Purifier les constructions plasmidiques d’expression à une concentration de 1 μg/μL diluée dans du PBS stérile avant l’expérience. Pour cette procédure, un kit de purification sans endotoxine disponible dans le commerce a été utilisé pour purifier le vecteur vide pcDNA3-EGFP (GFP) ou pcDNA3 (témoin).</li>
	<li>Calculer la concentration en plasmides pour assurer un volume d’injection adéquat (TA 50 μg d’ADN dans 50 μL de PBS stérile; EDL 10 μg d’ADN dans 10 μL de PBS stérile) et des échantillons aliquotes.</li>
	<li>Programmez les réglages de l’électroporateur en utilisant la roue de sélection et en appuyant sur la roue pour choisir les paramètres comme suit: Mode - BT, Tension - 12,5 V / mm (à ajuster au moment de l’injection), longueur d’impulsion - 20 ms, nombre d’impulsions - 5, intervalle - 200 ms, polarité - unipolaire.</li>
	<li>Anesthésier les souris à l’aide de gaz isoflurane. Placez les souris dans une boîte à induction contenant 5% d’isoflurane. Confirmer le plan chirurgical de l’anesthésie par l’absence du réflexe de pincement de l’orteil à l’aide de pinces et réduire l’isoflurane à 2% de dose d’entretien. Transférer les souris dans un cône de nez approprié reposant sur une plaque d’eau circulante à 37 ° C pour le reste de la procédure.</li>
	<li>Enlevez les poils des deux membres postérieurs à l’aide de petites tondeuses à cheveux. Frottez les membres inférieurs avec une alternance de 70% d’éthanol / bétadine pour assainir la zone d’injection.</li>
</ol>2. Injection/électroporation d’AT
<ol><li>Avec la souris en position couchée, localisez le tendon TA visible à travers la peau sur le côté latéral de la jambe. À l’aide d’une micro-seringue de 50 μL avec une aiguille détachable de 30 G, insérez l’aiguille de 1 à 2 mm au-dessus de la jonction myoténdineuse à un angle peu profond de 5 ° jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle. REMARQUE: L’injection au milieu du muscle est l’objectif.</li>
	<li>Appuyez lentement sur le piston tout en rétractant lentement l’aiguille le long du chemin d’injection pour délivrer 50 μL de solution plasmidique. Le muscle devrait gonfler.</li>
	<li>Réglez la minuterie pendant 1 min et mesurez l’épaisseur de la jambe au niveau de l’AT. Selon la taille de la souris, cela peut aller de 5 à 10 mm. Réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée et réglez la tension de l’électroporateur sur 12,5 V/mm.</li>
	<li>Après 1 min, placez les électrodes de l’étrier autour du membre inférieur. Les électrodes doivent être bien ajustées mais pas trop serrées. Délivrer 5 impulsions d’ondes carrées, avec une durée de 20 ms et des intervalles de 200 ms (le muscle doit se contracter à chaque impulsion).</li>
	<li>Répétez l’opération avec l’autre membre à l’aide du vecteur témoin.</li>
	<li>Retirez la souris de l’anesthésie et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Une fois récupérée, retournez la souris dans sa cage.</li>
</ol>3. Injection/électroporation EDL
<ol><li>Avec la souris en décubitus dorsal, localisez la crête antérieure de l’os du tibia visuellement et par palpation douce.<ol>
<li>À l’aide d’un scalpel, faites une incision peu profonde à travers la peau du côté latéral de la crête antérieure du tibia de 5 mm inférieure au genou à 2 mm supérieure à la jonction myoténdineuse TA.</li>
		<li>À l’aide de petits ciseaux, disséquez le fascia émoussé, exposant le muscle TA.</li>
		<li>Encore une fois, en utilisant une dissection émoussée avec des ciseaux, séparez doucement le muscle TA du tibia en tirant le muscle latéralement, exposant l’EDL. De petites pinces incurvées peuvent être utilisées pour garder l’AT à l’écart de l’EDL pendant la procédure.</li>
	</ol>
</li>
	<li>À l’aide d’une micro-seringue de 50 μL avec une aiguille détachable de 30 G, insérez l’aiguille dans l’EDL longitudinalement jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle.</li>
	<li>Appuyez lentement sur le piston tout en rétractant lentement l’aiguille le long du chemin d’injection pour injecter 10 μL de la solution plasmidique (le muscle doit gonfler).</li>
	<li>Réglez une minuterie pendant 1 min et mesurez l’épaisseur de la jambe à l’EDL. Selon la taille de la souris, cela peut aller de 5 à 10 mm. Réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée et réglez la tension de l’électroporateur sur 12,5 V/mm.</li>
	<li>Après 1 min, placez les électrodes de l’étrier autour du membre inférieur. Les électrodes doivent être bien ajustées mais pas trop serrées. Délivrer 5 impulsions d’ondes carrées, d’une durée de 20 ms et d’intervalles de 200 ms (le muscle doit se contracter à chaque impulsion).</li>
	<li>Fermez l’incision à l’aide de sutures en nylon jetables 4/0 non résorbables.</li>
	<li>Répétez avec le membre alternatif ou laissez le membre intact comme contrôle absolu.</li>
	<li>Retirez la souris de l’anesthésie et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 °C. Administrer un analgésique sous-cutané approprié immédiatement après la chirurgie et 12-24 h après la chirurgie. Une fois récupérée, retournez la souris dans sa cage. NOTE: Des études antérieures ont montré un déficit de contractilité musculaire dans l’AT immédiatement après l’électroporation et que la récupération contractile se produit au cours de 3 jours13,15. Pour cette raison, l’analyse des muscles TA et EDL pour l’histologie, l’expression des protéines ou la contractilité musculaire est effectuée 3 à 10 jours après l’électroporation. Une expression prolongée de l’EGFP a été observée jusqu’à 3 semaines après la procédure13.</li>
</ol>

<ol><li>Dodd, S., Hain, B., Judge, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+prevents+disuse+muscle+atrophy+in+senescent+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Biogerontology%22%5BJournal%5D)">Hsp70 prevents disuse muscle atrophy in senescent rats.</a> Biogerontology. 10, 605-611 (2009).</li>
<li>Dodd, S. L., Gagnon, B. J., Senf, S. M., Hain, B. A., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ros-mediated+activation+of+NF-kappaB+and+Foxo+during+muscle+disuse%5BTitle%5D)+AND+%22Muscle+and+Nerve%22%5BJournal%5D)">Ros-mediated activation of NF-kappaB and Foxo during muscle disuse.</a> Muscle and Nerve. 41 (1), 110-113 (2010).</li>
<li>Dodd, S. L., Hain, B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp27+inhibits+IKK%CE%B2-induced+NF-%CE%BAB+activity+and+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp27 inhibits IKKβ-induced NF-κB activity and skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 23 (10), 3415-3423 (2009).</li>
<li>Hain, B. A., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IkappaBalpha+degradation+is+necessary+for+skeletal+muscle+atrophy+associated+with+contractile+claudication%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Regulatory%2C+Integregrative+and+Comparative+Physiology%22%5BJournal%5D)">IkappaBalpha degradation is necessary for skeletal muscle atrophy associated with contractile claudication.</a> American Journal of Physiology Regulatory, Integregrative and Comparative Physiology. 300 (3), 595-604 (2011).</li>
<li>Houston, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat+shock+protein+70+overexpression+does+not+attenuate+atrophy+in+botulinum+neurotoxin+type+A-treated+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">Heat shock protein 70 overexpression does not attenuate atrophy in botulinum neurotoxin type A-treated skeletal muscle.</a> Journal of Applied Physiology. 119 (1), 83-92 (2015).</li>
<li>Reed, S. A., Sandesara, P. B., Senf, S. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+FoxO+transcriptional+activity+prevents+muscle+fiber+atrophy+during+cachexia+and+induces+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Inhibition of FoxO transcriptional activity prevents muscle fiber atrophy during cachexia and induces hypertrophy.</a> The FASEB Journal. 26 (3), 987-1000 (2012).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., McClung, J. M., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hsp70+overexpression+inhibits+NF-kappaB+and+Foxo3a+transcriptional+activities+and+prevents+skeletal+muscle+atrophy%5BTitle%5D)+AND+%22The+FASEB+Journal%22%5BJournal%5D)">Hsp70 overexpression inhibits NF-kappaB and Foxo3a transcriptional activities and prevents skeletal muscle atrophy.</a> The FASEB Journal. 22 (11), 3836-3845 (2008).</li>
<li>Blaveri, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Patterns+of+repair+of+dystrophic+mouse+muscle%3A+studies+on+isolated+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Patterns of repair of dystrophic mouse muscle: studies on isolated fibers.</a> Developmental Dynamics. 216 (3), 244-256 (1999).</li>
<li>Fewell, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+the+treatment+of+hemophilia+B+using+PINC-formulated+plasmid+delivered+to+muscle+with+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for the treatment of hemophilia B using PINC-formulated plasmid delivered to muscle with electroporation.</a> Molecular Therapy. 3 (4), 574-583 (2001).</li>
<li>Wolff, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+gene+transfer+into+mouse+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct gene transfer into mouse muscle in vivo.</a> Science. 247 (4949), 1465-1468 (1990).</li>
<li>Aihara, H., Miyazaki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+transfer+into+muscle+by+electroporation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Gene transfer into muscle by electroporation in vivo.</a> Nature Biotechnology. 16 (9), 867-870 (1998).</li>
<li>Mir, L. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+gene+transfer+into+skeletal+muscle+mediated+by+electric+pulses%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (8), 4262-4267 (1999).</li>
<li>Schertzer, J. D., Plant, D. R., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+plasmid-based+gene+transfer+for+investigating+skeletal+muscle+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Optimizing plasmid-based gene transfer for investigating skeletal muscle structure and function.</a> Molecular Therapy. 13 (4), 795-803 (2006).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+REDD1+prevents+chemotherapy-induced+muscle+atrophy+and+weakness+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle%22%5BJournal%5D)">Loss of REDD1 prevents chemotherapy-induced muscle atrophy and weakness in mice.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 12 (6), 1597-1612 (2021).</li>
<li>Schertzer, J. D., Lynch, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid-based+gene+transfer+in+mouse+skeletal+muscle+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Plasmid-based gene transfer in mouse skeletal muscle by electroporation.</a> Methods in Molecular Biology. 433, 115-125 (2008).</li>
<li>Roche, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physiological+and+histological+changes+in+skeletal+muscle+following+in+vivo+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%3A+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation.</a> American Journal of Physiology: Cell Physiology. 301 (5), 1239-1250 (2011).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zoledronic+Acid+Improves+Muscle+Function+in+Healthy+Mice+Treated+with+Chemotherapy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Zoledronic Acid Improves Muscle Function in Healthy Mice Treated with Chemotherapy.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 35 (2), 368-381 (2020).</li>
<li>Hain, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((REDD1+deletion+attenuates+cancer+cachexia+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Applied+Physiology%22%5BJournal%5D)">REDD1 deletion attenuates cancer cachexia in mice.</a> Journal of Applied Physiology. 131 (6), 1718-1730 (2021).</li>
<li>Hain, B. A., Xu, H., Wilcox, J. R., Mutua, D., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotherapy-induced+loss+of+bone+and+muscle+mass+in+a+mouse+model+of+breast+cancer+bone+metastases+and+cachexia%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cachexia%2C+Sarcopenia+and+Muscle+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Chemotherapy-induced loss of bone and muscle mass in a mouse model of breast cancer bone metastases and cachexia.</a> Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle Rapid Communications. 2 (1), (2019).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-beta+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-beta mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21, 1262-1271 (2015).</li>
<li>Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessment+of+muscle+mass+and+strength+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Bonekey+Reports%22%5BJournal%5D)">Assessment of muscle mass and strength in mice.</a> Bonekey Reports. 4, 732(2015).</li>
<li>Senf, S. M., Dodd, S. L., Judge, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FOXO+signaling+is+required+for+disuse+muscle+atrophy+and+is+directly+regulated+by+Hsp70%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology+Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">FOXO signaling is required for disuse muscle atrophy and is directly regulated by Hsp70.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 298 (1), 38-45 (2010).</li>
<li>Rana, Z. A., Ekmark, M., Gundersen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coexpression+after+electroporation+of+plasmid+mixtures+into+muscle+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica%22%5BJournal%5D)">Coexpression after electroporation of plasmid mixtures into muscle in vivo.</a> Acta Physiologica. 181 (2), 233-238 (2004).</li>
<li>Sokolowska, E., Blachnio-Zabielska, A. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Critical+Review+of+Electroporation+as+A+Plasmid+Delivery+System+in+Mouse+Skeletal+Muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Integrative+Journal+of+Molecular+Science%22%5BJournal%5D)">A Critical Review of Electroporation as A Plasmid Delivery System in Mouse Skeletal Muscle.</a> Integrative Journal of Molecular Science. 20 (11), (2019).</li>
<li>Molnar, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+influencing+the+efficacy%2C+longevity%2C+and+safety+of+electroporation-assisted+plasmid-based+gene+transfer+into+mouse+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy%22%5BJournal%5D)">Factors influencing the efficacy, longevity, and safety of electroporation-assisted plasmid-based gene transfer into mouse muscles.</a> Molecular Therapy. 10 (1), 447-455 (2004).</li>
</ol>

B.A.H. et D.L.W. ne revendiquent aucun conflit d’intérêts.

Le transfert de gènes in vivo dans le muscle squelettique amélioré par électroporation est un outil utile et relativement simple pour moduler l’expression des protéines dans le muscle. Nous avons montré les étapes nécessaires pour obtenir un transfert efficace de gènes dans les muscles EDL et TA et démontré que la mesure de la contractilité de l’EDL est viable après la procédure. Cette technique ne nécessite pas de vecteurs viraux plus compliqués et permet de comparer la section transversale des fibres musculair...

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique in vivo est un outil important pour évaluer les changements dans la physiologie des muscles squelettiques et la signalisation moléculaire en modulant l’expression des gènes dans diverses conditions physiologiques et physiopathologiques 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Le transfert expérimental de gènes dans le muscle squelettique a été démontré dès 1990 par Wolff et al., où l’ARN et l’ADN ont été transférés avec succès sans électroporation, et l’expression de la luciférase a été maintenue pendant au moins 2 mois10. L’efficacité de transfection relativement faible avec injection seulement est problématique, et Aihara et Miyazaki ont démontré une augmentation du transfert de gènes avec l’électroporation en 1998 en électroporatant une construction pCAGGS-IL-5 dans le muscle tibialis antérieur (TA) et en mesurant l’expression sérique de l’IL-511. Depuis lors, de nombreuses études ont étudié l’efficacité de différentes concentrations d’ADN, volumes et paramètres d’électroporation pour assurer une efficacité maximale du transfert de gènes. Mir et al. ont testé différents paramètres d’électroporation, y compris la tension, le nombre d’impulsions, la durée et la fréquence des impulsions, ainsi que la concentration d’ADN, et ont déterminé qu’une tension, un nombre d’impulsions et une concentration d’ADN plus élevés contribuaient tous à une efficacité accrue de l’électroporation12. Une mise en garde majeure à la tension d’électroporation élevée est que, bien qu’elle facilite l’absorption accrue de l’ADN dans les myofibres, elle provoque également des dommages musculaires, ce qui peut confondre les résultats. Schertzer et al. ont montré que l’électroporation à 200 V causait des dommages dans environ 50% des myofibres 3 jours après l’électroporation, alors que seulement 10% des myofibres étaient endommagés à 50 V13. Nous avons pris en considération les variables affectant le transfert efficace de l’ADN par rapport aux dommages musculaires et avons constaté qu’une tension de 125 V par centimètre de largeur d’étrier est suffisante pour réaliser un transfert de gène efficace.
L’analyse de la section transversale des fibres musculaires et de la contractilité musculaire entière après électroporation sont des aspects importants de la méthode de mesure des changements de taille et de fonction musculaires dus à la modulation des gènes. Nous et d’autres avons déjà démontré que l’électroporation des vecteurs de contrôle seule ne provoque pas une diminution de la zone myofibre. La construction de la protéine fluorescente verte (EGFP) était un indicateur fluorescent utile de la transfection de l’ADN dans ces études13,14. Un certain nombre d’études ont étudié la contractilité in situ de l’AT après électroporation et ont trouvé des résultats variables. Une étude a montré que l’électroporation de 75 V / cm entraînait une réduction d’environ 30% de la force tétanique 3 jours après l’électroporation, et 7 jours après l’électroporation, la force tétanique était revenue au niveau de contrôle, tandis que l’électroporation de 50 V / cm ne compromettait pas la force13,15. Une autre étude a montré qu’il y avait une perte de 30% de la force tétanique 3 h après une électroporation de 180 V / cm, qui a retrouvé les niveaux de force simulée après 7 jours16.
Dans la procédure détaillée suivante, nous démontrons l’injection et l’électroporation d’un plasmide pcDNA3-EGFP dans les muscles TA et extenseur digitorum longus (EDL) de souris. Nous démontrons également que cette méthode n’affecte pas la contractilité musculaire entière de l’EDL. L’objectif est de démontrer une absorption efficace des plasmides dans les myofibres sans entraîner de perte de fonction.

<table><tbody><tr><td>4-0 Suture en nylon (non résorbable)</td><td>Ethicon</td><td>662G</td><td>Suture pour fermer l’incision cutanée</td></tr><tr><td>50&micro ; l Seringue Hamilton</td><td></td><td>80501</td><td>microseringue</td></tr><tr><td>C57BLl/6NHsd</td> souris <td>Envigo</td><td>044</td><td>Souris femelles de 12 semaines utilisées pour l’expérimentation</td></tr><tr><td>Électrode d’étrier</td><td>BTX</td><td>45-0102</td><td>1,0 cm x 1,0 cm acier inoxydable</td></tr> Contrôle <tr><td>dynamique des muscles Acquisition/analyse des données Aurora</td><td>Scientific</td><td>605A</td><td>Logiciel utilisé pour la mesure et l’analyse de la contractilité musculaire</td></tr><tr><td>ECM 830 Système d’électroporation</td><td>BTX</td><td>45-0662</td><td>Électroporateur</td></tr><tr><td>EndoFree Plasmid Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td>Kit de purification de plasmide</td></tr><tr><td>Ciseaux extra étroits</td><td>Outils scientifiques fins</td><td>14088-10</td><td>Ciseaux pour dissection émoussée</td></tr><tr><td>Transducteur de force</td><td>Aurora Scientific</td><td>407A</td><td>Pour mesurer la force des</td></tr><tr><td>hémastats EDL Micro-Masquito</td><td>Outils de science fine</td><td>13010-12</td><td>Hémastats pour la surturation du</td></tr><tr><td>vecteur d’expression de l’ADN3.1 chez les mammifères</td><td>Fisher Scientific</td><td>V79020</td><td>Vecteur de contrôle</td></tr><tr><td>Plasmide d’expression de l’ADNA3-EGFP</td><td>Addgene</td><td>13031</td><td>Plasmide pour l’expression de la GFP</td></tr><tr><td>Pince courbe Semken</td><td>Outils de science fine</td><td>11009-13</td><td>Pince pour la chirurgie</td></tr><tr><td>Lames chirurgicales en acier inoxydable n° 10</td><td>Becton Dickinson</td><td>37 1210</td><td>Lames de scalpel</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Média</td><td>VWR</td><td>25608-930</td><td>Agent de congélation pour l’histologie</td></tr><tr><td>Germe de blé Agglutinin- Texas Red</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>W21405</td><td>Coloration membranaire pour coupe musculaire</td></tr></tbody></table>

Électroporation de l’adn plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

Electroporation of Plasmid DNA into Mouse Skeletal Muscle

La modulation transitoire de l’expression génique dans le muscle squelettique murin par électroporation plasmidique est un outil utile pour évaluer la physiologie normale et pathologique. La surexpression ou l’élimination des gènes cibles permet aux chercheurs de manipuler des événements moléculaires individuels et, par conséquent, de mieux comprendre les mécanismes qui ont un impact sur la masse musculaire, le métabolisme musculaire et la contractilité. De plus, l’électroporation des plasmides d’ADN qui codent des étiquettes fluorescentes permet aux chercheurs de mesurer les changements dans la localisation subcellulaire des protéines dans le muscle squelettique in vivo. Une évaluation fonctionnelle clé du muscle squelettique comprend la mesure de la contractilité musculaire. Dans ce protocole, nous démontrons que les études de contractilité musculaire entière sont encore possibles après l’injection d’ADN plasmidique, l’électroporation et la modulation de l’expression génique. L’objectif de cette procédure pédagogique est de démontrer la méthode étape par étape de l’électroporation du plasmide d’ADN dans le muscle squelettique de la souris pour faciliter l’absorption et l’expression dans les myofibres des muscles tibialis antérieur et extenseur digitorum longus, ainsi que de démontrer que la contractilité des muscles squelettiques n’est pas compromise par l’injection et l’électroporation.

L’électroporation pour faciliter le transfert de gènes dans le muscle squelettique est une technique utile utilisée pour évaluer les changements dans la physiologie musculaire. Nous avons démontré une procédure détaillée, étape par étape, pour réaliser un transfert efficace de gènes dans les muscles TA et EDL. Les différences dans l’efficacité de la transfection se produisent en raison d’un certain nombre de variables. Parmi ces variables figurent les paramètres d’électroporation (impulsions, tension, durée de l’impulsio...

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique est une méthode viable pour moduler l’expression des gènes sans compromettre la contractilité musculaire chez la souris.

Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

Transient gene expression modulation in murine skeletal muscle by plasmid electroporation is a useful tool for assessing normal and pathological ...

Le transfert de gènes médié par électroporation dans les muscles est une technique facile et efficace pour étudier les changements dans la physiologie musculaire. Nous avons constaté que l’électroporation ne compromet pas la contractilité musculaire. L’électroporation des constructions géniques dans le muscle in vivo est une procédure simple et efficace qui ne nécessite pas un conditionnement plus étendu des constructions géniques en vecteurs viraux.Il est difficile de visualiser, d’isoler et d’injecter l’EDL en raison de son emplacement et de sa petite taille. Pratiquer sur une carcasse de souris et l’injection d’encre biologique telle que l’encre de Chine peut aider à fournir des preuves d’une injection suffisante. Brian Hain, un post-doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.Avant d’injecter la souris, confirmez le plan chirurgical de l’anesthésie à l’aide d’une pince avec l’absence du réflexe de pincement des orteils, puis transférez la souris sur un cône de nez reposant sur une plaque d’eau circulante à 37 degrés Celsius pour le reste de la procédure. Une fois la souris placée en décubitus dorsal, retirez les poils des deux membres postérieurs à l’aid

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Nous décrivons des procédures détaillées pour la transfection efficace de l'ADN plasmidique dans les fibres des muscles du pied des souris vivantes en utilisant l'électroporation et la visualisation ultérieure de l'expression des protéines en utilisant la microscopie à fluorescence.

Transfection d&#39;ADN des mammifères muscles squelettiques à l&#39;aide In Vivo L&#39;électroporation

Cette vidéo démontre l’administration de l’ADN plasmidique dans les cellules neuronales cérébelleuses d’embryons murins en utilisant l’électroporation in utero. Cette méthode est utile pour comprendre la fonction in vivo des gènes dans le développement normal du cerveau et les changements dans l’expression des gènes des cellules neuronales au cours de la progression tumorale.

Livraison de gènes basée sur l’électroporation in utero : une technique pour injecter de l’ADN plasmidique dans des cellules cérébelleuses embryonnaires d’embryons murins

Les progéniteurs myogéniques dérivés de cellules souches pluripotentes induites (csps) sont des candidats prometteurs pour les stratégies de thérapie cellulaire visant à traiter les dystrophies musculaires. Ce protocole décrit la transplantation et les mesures fonctionnelles exigées pour évaluer l’engraftment et la différentiation des mesoangioblasts iPSC-dérivés (un type de progéniteurs de muscle) dans des modèles murins de régénération aiguë et chronique de muscle.

Transplantation de progéniteurs myoangioblastes dérivés de cellules souches pluripotentes induites dans des modèles murins de régénération musculaire

La surface piale est une zone de progéniteur unique dans le système nerveux central qui reçoit une attention croissante. Ici, nous détaillons une méthode de manipulation génétique rapide de cette zone souches en utilisant une méthode d'électroporation modifié. Cette procédure peut être utilisée pour les enquêtes cellulaires et moléculaires de lignées cellulaires et les voies de signalisation impliquées dans la différenciation cellulaire et d'élucider le sort et les propriétés des cellules...

Néonatale Pial électroporation de surface

Cet article décrit la micro-injection et l'électroporation de testicule de souris in vivo en tant que technique de transfection de cellules testiculaires de souris pour étudier les procédés uniques de la spermatogenèse. Le protocole présenté implique des étapes de préparation capillaire en verre, la micro-injection par le conduit efférent, et la transfection par électroporation.

In Vivo L&#39;électroporation et microinjection de testicule de souris

Ce protocole utilise l’électroporation pour introduire et exprimer des protéines marquées par fluorescence dans les fibres musculaires de souris. Après récupération après électroporation, les fibres sont isolées. Les fibres individuelles sont ensuite imagées à l’aide de la microscopie confocale à haute résolution pour visualiser la structure musculaire.

ADN électroporation, isolement et d&#39;imagerie de myofibres

Nous décrivons une nouvelle méthode pour la livraison de plasmides d’ADN dans les cellules urothéliales de souris la vessie in vivo par cathétérisme de l’urètre et électroporation. Il offre un moyen rapide et pratique pour générer des modèles autochtones murins de maladies de la vessie.

Nouvelle méthode de livraison ADN plasmidique aux souris vessie urothélium par électroporation

La fluorométrie fonctionnelle dirigée par site est une méthode permettant d’étudier les mouvements du domaine protéique en temps réel. La modification de cette technique pour son application dans les cellules natives permet maintenant la détection et le suivi des mouvements du capteur de tension unique à partir de canaux Ca2+ voltage-dépendants dans des fibres musculaires squelettiques isolées murines.

Fluorométrie fonctionnelle dirigée dans des cellules natives pour étudier l’excitabilité des muscles squelettiques

Ici, nous présentons un protocole qui combine l’électroporation in vivo et la dénervation du muscle releveur crânien du long auris (LAL). Cette procédure permet d’étudier le rôle potentiel des protéines dérivées du muscle dans la régénération de la synapse neuromusculaire.

Combinaison d’électroporation in vivo et de réinnervation à court terme du muscle squelettique du muscle squelettique du muscle squelettique du releveur crânien de l’auris long

Ici, nous présentons une approche de thérapie génique qui délivre du chitosane enrobé d’ABE directement dans la moelle osseuse par injection intra-osseuse.

Amélioration de l’administration et de l’expression de gènes à l’aide de l’injection intraosseuse de plasmides d’éditeur de base d’adénine encapsulés dans des nanoparticules de chitosane

Apprenez l'électroporation de l'ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris. Cette méthode permet un transfert de gènes efficace sans compromettre la contractilité musculaire.

Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

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