Électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique de la souris

L’électroporation de l’ADN plasmidique dans le muscle squelettique est une méthode viable pour moduler l’expression des gènes sans compromettre la contractilité musculaire chez la souris.

Le transfert de gènes médié par électroporation dans les muscles est une technique facile et efficace pour étudier les changements dans la physiologie musculaire. Nous avons constaté que l’électroporation ne compromet pas la contractilité musculaire. L’électroporation des constructions géniques dans le muscle in vivo est une procédure simple et efficace qui ne nécessite pas un conditionnement plus étendu des constructions géniques en vecteurs viraux.

Il est difficile de visualiser, d’isoler et d’injecter l’EDL en raison de son emplacement et de sa petite taille. Pratiquer sur une carcasse de souris et l’injection d’encre biologique telle que l’encre de Chine peut aider à fournir des preuves d’une injection suffisante. Brian Hain, un post-doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Avant d’injecter la souris, confirmez le plan chirurgical de l’anesthésie à l’aide d’une pince avec l’absence du réflexe de pincement des orteils, puis transférez la souris sur un cône de nez reposant sur une plaque d’eau circulante à 37 degrés Celsius pour le reste de la procédure. Une fois la souris placée en décubitus dorsal, retirez les poils des deux membres postérieurs à l’aide de petites tondeuses à cheveux, puis désinfectez la zone d’injection avec une alternance d’éthanol à 70% et de bétadine. Pour l’injection, localisez le tendon tibialis antérieur ou TA visible à travers la peau sur le côté latéral de la jambe inférieure et marquez l’extrémité supérieure du muscle TA.

Insérez ensuite une aiguille de calibre 30 montée sur une micro-seringue de 50 microlitres dans le muscle à un angle peu profond de cinq degrés supérieur d’un à deux millimètres à la jonction myoténdineuse jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle. Appuyez sur le piston tout en rétractant lentement l’aiguille le long du chemin d’injection pour délivrer 50 microlitres de la solution plasmidique dans le muscle. Le muscle devrait gonfler.

Réglez la minuterie pendant une minute et mesurez l’épaisseur de la jambe au niveau du muscle TA, puis réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée. Réglez ensuite la tension de l’électroporateur à 12,5 volts par millimètre. Après une minute, placez les électrodes de l’étrier près du membre inférieur sans être trop serrées pour délivrer cinq impulsions d’onde carrées d’une durée de 20 millisecondes et des intervalles de 200 millisecondes.

Le muscle devrait se contracter à chaque pouls. Répétez la procédure avec l’autre membre en utilisant le vecteur plasmidique de contrôle. Lorsque vous avez terminé, retirez la souris du cône de nez et laissez la souris récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius.

Une fois récupérée, retournez la souris dans sa cage. Avec la souris en position couchée, localisez la crête antérieure de l’os du tibia visuellement et par palpitation douce. Utilisez un scalpel pour faire une incision peu profonde à travers la peau du côté latéral de la crête antérieure du tibia cinq millimètres inférieurs au genou à deux millimètres supérieurs à la jonction myoténdineuse TA.

À l’aide de petits ciseaux, disséquez carrément le fascia, exposant le muscle TA, puis séparez doucement le muscle TA du tibia en tirant sur le muscle pour révéler l’extenseur digitorum longus ou EDL. Gardez l’AT dégagé de l’EDL pendant la procédure à l’aide de petites pinces incurvées. Insérez l’aiguille de calibre 30 dans l’EDL longitudinalement jusqu’à ce que l’aiguille atteigne l’extrémité supérieure du muscle et injectez 10 microlitres de la solution plasmidique comme démontré précédemment.

Le muscle EDL devrait gonfler. Mesurez l’épaisseur de la jambe à l’EDL et réglez les électrodes de l’étrier sur l’épaisseur mesurée pour délivrer cinq impulsions d’onde carrées comme expliqué précédemment. Lorsque vous avez terminé, fermez l’incision à l’aide de sutures en nylon jetables 4-0 non résorbables.

Plus tard, retirez la souris du cône de nez et laissez-la récupérer sur un coussin chauffant réglé à 37 degrés Celsius. Administrer un analgésique sous-cutané approprié immédiatement après la chirurgie et 12 à 24 heures après la chirurgie. Une fois récupérée, retournez la souris dans la cage d’accueil.

Après l’injection et l’électroporation du plasmide pcDNA3-EGFP dans les muscles TA et EDL, l’expression de GFP a été observée indiquant une absorption d’ADN dans les fibres musculaires. Lorsqu’elle est imagée à un grossissement plus faible, l’efficacité de la transfection musculaire EDL pourrait être visualisée par l’apparition de fibres vertes par rapport aux fibres noires. Les EDL injectés et électroporés avaient des réponses tétaniques similaires à 100 Hertz par rapport aux muscles témoins non injectés ou électroporés.

L’EDL injecté et électroporé, la force musculaire tétanique, la force musculaire tétanique spécifique, le temps de tension maximale et la moitié du temps de relaxation n’ont pas été compromis par rapport au contrôle intact. Il est important d’identifier avec précision le muscle à injecter et de délivrer efficacement la solution plasmidique. Un certain nombre de mesures histologiques et biochimiques peuvent être effectuées à l’aide de ce protocole.

La localisation cellulaire des protéines cibles, l’élimination des gènes cibles, les rapporteurs transcriptionnels et un éventail de colorations tissulaires peuvent être effectués. Cette technique a été utilisée pour identifier une vaste gamme de changements dans la signalisation moléculaire dans les muscles au cours de conditions physiologiques et physiopathologiques. L’étude de la contractilité musculaire suite au transfert de gènes est réalisable en utilisant cette technique.