Outils microfluidiques pour sonder les interactions fongiques-microbiennes au niveau cellulaire

À l’aide des dispositifs microfluidiques présentés, nous pouvons examiner les interactions dynamiques entre les champignons et d’autres microbes avec un contrôle précis de l’espace et de l’environnement, ainsi qu’une imagerie à haute résolution au niveau de la cellule unique. Il est important de noter que la croissance fongique peut être confinée et dirigée dans le canal microfluidique. Permettant d’obtenir des images en accéléré de haute qualité.

Par conséquent, les complexités des interactions fongiques-fongiques et fongiques-bactériennes peuvent être explorées. Comprendre les interactions microbiennes fongiques est une étape essentielle dans la définition et la préservation du microbiome du sol. Ces connaissances peuvent être exploitées pour le développement de nouveaux agents de lutte biologique avec une agriculture durable.

Pour commencer, préparez environ 40 grammes de poly(diméthylsiloxane) ou de PDM, en mélangeant soigneusement la base et l’agent de durcissement dans un rapport de 10 à 1 à l’aide d’une spatule dans un gobelet en plastique propre. Pour éliminer toutes les bulles d’air, placez la tasse dans une chambre à vide pendant une heure. Ensuite, à l’aide de ruban adhésif transparent, fixez le moule principal dans un support en plastique et utilisez de l’air filtré comprimé pour éliminer les particules de poussière, puis versez les PDM sur le centre du moule maître et laissez-le se déposer.

Pour éviter la sédimentation des particules de poussière sur la surface des PDM, recouvrez lâchement le moule maître avec un couvercle en plastique, puis transférez le moule maître dans un four et durcissez pendant la nuit à 70 degrés Celsius. Après avoir retiré le moule maître du four et l’avoir laissé refroidir, retirez les PDM durcis du moule principal et du cadre en plastique sans endommager le moule maître dans les PDM. Ensuite, pour maintenir une surface sans poussière, placez du ruban adhésif transparent sur les microcanaux en relief dans les PDM.

Ensuite, utilisez une guillotine montée ou une lame de rasoir pour couper les PDM en dalles comme indiqué par la conception. Lors de la coupe de l’ouverture latérale de la dalle PDM utilisée pour le dispositif d’interaction bactérien-fongique, ou dispositif BFI, assurez-vous que les microcanaux sont complètement ouverts. Cependant, pour les dalles PDM utilisées dans l’assemblage du dispositif d’interaction fongique-fongique, ou FFI, chaque coin doit être coupé de manière à ce qu’il s’insère dans une boîte de Petri à fond de verre.

Ensuite, utilisez une fraise de précision pour percer les trous d’entrée ou de sortie en fonction de la conception de l’appareil. Ensuite, immergez les dalles de PDM dans une solution d’hydroxyde de sodium de 0,5 molaire. Rincez les brames dans de l’eau stérile à double distillation avant de les transférer dans une solution d’éthanol à 70%.

Après avoir retiré l’éthanol et rincé à nouveau les brames avec de l’eau stérile double distillée, immergez les dalles dans de l’eau stérile double distillée et soniquez pendant cinq minutes, puis retirez la dalle de PDM de l’eau, séchez-les avec de l’air filtré comprimé et placez-les dans une boîte de Petri carrée stérile. Ensuite, incubez la boîte de Petri avec une dalle PDM dans un four à 70 degrés Celsius pendant une heure. Une fois que les dalles ont refroidi dans un environnement sans poussière, éliminez toute poussière de leur surface à l’aide de ruban adhésif et d’air filtré comprimé.

Pour activer les surfaces des dalles PDM et des boîtes de Petri à fond de verre, qui seront ensuite collées ensemble, placez-les dans un nettoyeur plasma avec les surfaces à activer vers le haut. Après avoir retiré la dalle des PDM dans les boîtes de Petri du nettoyeur plasma, collez-les doucement en plaçant les surfaces activées en contact conforme les unes avec les autres. Bond BFI et FFI PDMs dalle avec des boîtes de Petri de 35 millimètres et 55 millimètres de diamètres, respectivement pour vérifier le collage réussi, essayez de retirer le laboratoire PDM de sa boîte de Petri avec une pince à épiler.

Visualisez soigneusement l’appareil à l’œil nu ou par microscopie générique pour éviter l’effondrement des entrées d’inoculation ou des microcanaux. Pour les conditions saturées en eau ou riches en nutriments, pipettez 100 microlitres de la solution souhaitée pour remplir les dispositifs BFI immédiatement après le collage. Pour les appareils FFI, ajoutez 30 microlitres du support dans chaque entrée.

Enfin, ajoutez 100 à 200 microlitres d’eau stérile double distillée à la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité. Cependant, pour les conditions d’eau insaturée, il suffit d’ajouter 100 à 200 microlitres d’eau stérile double distillée à la boîte de Pétri pour maintenir l’humidité. Pour l’inoculation fongique, à l’intérieur d’une hotte à écoulement laminaire, à l’aide d’un foreur de liège stérilisé, retirez un bouchon de gélose d’une colonie à la périphérie d’une culture vieille de trois jours, en veillant à garder intact le front hyphale en croissance.

Introduisez ensuite le bouchon de gélose dans l’entrée fongique du dispositif BFI et / ou FFI avec le côté mycélium vers le bas dans le front hyphale orienté vers les ouvertures microcanaux pour encourager l’infiltration hyphale des canaux. Pour l’appareil FFI, introduisez un autre bouchon de gélose avec une deuxième espèce fongique dans l’entrée opposée. Ensuite, scellez la boîte de Petri avec un film transparent et incubez à 25 à 28 degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à l’imagerie.

Pour l’inoculation bactérienne, après avoir retiré le dispositif BFI de l’incubateur, pipettez 10 microlitres d’une suspension bactérienne dans l’entrée bactérienne dans un environnement stérile. Une fois la boîte de Petri scellée avec un film transparent, rangez l’appareil à la verticale à 25 degrés Celsius dans l’obscurité jusqu’à ce que l’imagerie commence. En utilisant ce protocole, l’interaction entre le champignon Coprinopsis cinerea et la bactérie Bacillus subtilis a pu être visualisée avec succès.

Il a été observé qu’en présence de la bactérie, le taux de croissance du champignon a commencé à diminuer considérablement après environ cinq heures de coinoculation. De plus, les hyphes fongiques associés à la bactérie avaient un aspect mince et transparent. La microscopie à fluorescence en accéléré a également révélé un effondrement des hyphes fongiques après cinq heures de coinoculation avec Bacillus subtilis.

Cependant, à partir de six heures, la population bactérienne a également commencé à décliner. La visualisation des interactions fongiques-fongiques a montré que Fusarium graminearum inhibait fortement la croissance de Trichoderma rossicum, ce qui était évident en utilisant la microscopie à fluorescence. Ce protocole a en outre révélé des changements morphologiques significatifs dans le champignon Verticillium longisporum en présence des bactéries Pseudomonas synxantha et Pseudomonas fluorescens.

La technique d’imagerie dynamique à haute résolution utilisée dans l’étude a également révélé la formation de septa dans Fusarium graminearum en présence du champignon Clonostachys rosea. Le marquage par fluorescence a permis la quantification dynamique de la prolifération hyphale de Clonostachys rosea dans le dispositif FFI. Ces dispositifs peuvent être adaptés et modifiés par l’utilisateur pour incorporer différentes espèces d’intérêt et répondre à leurs questions expérimentales spécifiques concernant les interactions microbiennes fongiques.

Les dispositifs BFI et FFI ont repoussé les frontières scientifiques, révélant comment les champignons propagent les signaux de défense et les nutriments lors d’attaques de champignons, de virus, de nématodes et permettant des recherches sur la dispersion bactérienne.