Name: Mesure in vivo résolue dans le temps de la dynamique des neuropeptides par immunosonde capacitive dans le cœur porcin (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 20 s
Description: Découvrez la mesure résolue dans le temps des neuropeptides in vivo par immunosonde capacitive dans le cœur porcin. Cette méthode permet une analyse quasi-temps réel pour étudier la signalisation peptidique.

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Nous remercions le Dr Olu Ajijola (UCLA Cardiac Arrhythmia Center) pour son soutien expert pour les expériences in vivo . Ce travail a été soutenu par NIH U01 EB025138 (JLA, CS).

Toutes les expériences sur les animaux ont été approuvées par le Comité de recherche animale de l’Université de Californie à Los Angeles et réalisées conformément aux directives établies par le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals (8e édition, 2011). Des porcs mâles adultes du Yorkshire d’environ 75 kg ont été utilisés pour des études in vivo 10.
1. Fabrication et fonctionnalisation de l’immunosonde capacitive
<ol><li>Coupez un fil de platine recouvert de perfluoroalkyoxy (PFA) d’une longueur de 25 cm (voir tableau des matériaux) et dénudez environ 5 mm de revêtement PFA d’une extrémité à l’aide d’un scalpel, en prenant soin de ne pas couper dans le fil de platine.</li>
	<li>Insérez l’extrémité dénudée du fil de platine dans une broche de connecteur mâle plaquée or de 1 mm et sertissez les dents de la broche du connecteur autour de l’extrémité dénudée du fil de platine à l’aide d’une pince à aiguille (voir tableau des matériaux).</li>
	<li>Soudez le fil de platine à la broche du connecteur plaqué or. Veillez à ne pas utiliser une quantité excessive de soudure.</li>
	<li>Préparer la solution de dopamine en dissolvant 50 mg de dopamine HCl dans 50 mL de solution saline tamponnée au phosphate de 10 mM (PBS, pH 6,0) en remuant.</li>
	<li>Une fois que la dopamine est complètement dissoute, placez l’extrémité du fil de platine dans le récipient contenant le PBS supplémenté en dopamine fraîchement fabriqué. Branchez une broche de connecteur en or dans un canal de la scène de tête (voir Tableau des matériaux).</li>
	<li>Connectez l’électrode à disque AgCl (électrode de masse, voir Tableau des matériaux) au canal de masse dans la scène de tête. Placez le disque AgCl dans le récipient contenant du PBS supplémenté en dopamine et du fil de platine; veillez uniquement à immerger l’électrode du disque et non toute longueur du fil ou de la soudure. Connectez un shunt de fil dans les canaux de référence de la scène de tête avant de continuer.</li>
	<li>Ouvrez le logiciel interactif d’acquisition de données (voir Tableau des matériaux). Préparez un protocole de potentiel de commande d’électrodéposition en dents de scie avec les paramètres suivants : potentiel de départ = −0,6 V ; potentiel final = +0,65 V; taux de balayage = 0,04 V∙s-1; durée du dépôt = 420 s. Commencez le protocole de dépôt de polydopamines, en vous assurant que tous les fils sont correctement connectés.</li>
	<li>Après avoir terminé le dépôt de polydopamine, retirez la pastille de terre AgCl et l’extrémité du fil de platine du récipient, en prenant soin de ne pas perturber l’extrémité de l’électrode du fil de platine. Placer l’extrémité du fil dans un microtube contenant du PBS (pH 7,4) pendant 2 à 5 minutes pendant que la solution d’anticorps est préparée; assurez-vous que l’extrémité du fil n’entre pas en contact avec les côtés ou le fond du microtube. REMARQUE: Une solution d’anticorps peut être fabriquée lors du dépôt de polydopamines; toutefois, le transfert du fil de platine du récipient contenant de la dopamine au microtube de PBS après le dépôt de polydopamines ne doit pas être ignoré.</li>
	<li>Préparez la solution d’anticorps. Combiner l’anticorps d’intérêt avec le PBS (pH 7,4) dans un rapport de 1:20 dans un récipient d’une taille appropriée (p. ex., un microtube). REMARQUE: L’anticorps monoclonal anti-NPY (voir tableau des matériaux) utilisé ici a été alicité à 1 mg / mL; un exemple de préparation d’anticorps ici serait 4 μL d’anticorps pour 76 μL de PBS.</li>
	<li>Faire tremper l’extrémité déposée en polydopamine de l’électrode de platine dans une solution d’anticorps pendant au moins 2 h à température ambiante, en veillant à nouveau à ce que l’extrémité du fil de platine soit suspendue en solution et ne repose pas sur la surface intérieure du microtube. REMARQUE: La mise en œuvre récente de cette technique a favorisé l’utilisation de l’électrode en fil de platine immédiatement après cette étape au lieu d’un stockage humide ou sec pour une utilisation ultérieure.</li>
	<li>Après avoir trempé dans la solution d’anticorps, rincer brièvement l’embout de l’immunosonde capacitive nouvellement fonctionnalisée (sonde CI) dans le PBS (pH 7,4). La sonde est maintenant prête à l’emploi.</li>
</ol>2. Configuration expérimentale pour la détection et la mesure in vitro du peptide
<ol><li>Placez l’extrémité fonctionnelle de la sonde CI dans la chambre d’écoulement, en prenant soin de ne pas perturber la pointe de l’électrode de quelque manière que ce soit, car cela pourrait endommager la pointe sensorielle de la sonde. REMARQUE: La chambre d’écoulement a été créée en versant de l’élastomère de silicone (voir tableau des matériaux) dans un plat de culture de 35 mm avec une charge d’espace ovoïde allongée au centre du plat. Après durcissement, la forme ovoïde est retirée de l’élastomère. La chambre est ensuite superfusée avec une solution saline tamponnée Tris (TBS) et permet un débit de 3 mL/min. Assurez-vous que l’entrée et la sortie maintiennent le niveau de fluide dans la chambre de manière à ce qu’aucune action de marée du superfusat ne soit observée. Le débit doit rester en place aussi longtemps que la sonde CI est utilisée.</li>
	<li>Avant le premier test expérimental, effectuez une exécution standard TBS pour conditionner la sonde CI. Configurez le protocole de tension de commande suivant: potentiel de pas positif = +100 mV; potentiel de pas négatif = −5 mV; durée du pas = 20 ms; durée d’acquisition = 600 s. REMARQUE: Il est important de permettre l’équilibrage de la sonde pendant la phase initiale du cycle du potentiel de commande avant l’acquisition des données.</li>
	<li>Créez une solution du peptide d’intérêt en utilisant le même TBS pour maintenir la composition du superfusat. Mettre en place un système de collecteur où le superfusat peut être commuté entre TBS et TBS supplémenté en peptides sans introduire de bulles dans le système de tuyauterie ou la chambre d’écoulement. REMARQUE : Le peptide NPY porcin synthétique (voir tableau des matériaux) a été utilisé dans la présente étude.</li>
	<li>Configurez le protocole d’acquisition de données de détection peptidique à l’aide des paramètres standard TBS (voir étape 2.2.). REMARQUE: Dans cette mise en œuvre, la durée de chaque test expérimental était de 360 s (TBS de 120 s, TBS supplémenté en peptides de 120 s, TBS de 120 s).</li>
</ol>3. Adaptation de la sonde CI pour une utilisation in vivo
<ol><li>Avant le dépôt de polydopamine (étape 1.7.), enfiler l’extrémité exposée de l’électrode en fil de platine à travers une aiguille hypodermique de 22 G, en laissant environ 2 mm au-delà de la pointe de l’aiguille. À l’aide d’une pince, pliez doucement l’extrémité de l’électrode en fil de platine, créant une « barbe » qui pend de l’extrémité de l’aiguille hypodermique.<ol>
<li>Retirez doucement l’aiguille de la pointe barbelée, en laissant suffisamment de fil à placer dans le récipient sans que l’aiguille n’entre en contact avec le liquide. Passez aux étapes 1.4.-1.11. REMARQUE: Selon la configuration in vivo , il peut être nécessaire de couper une longueur de fil de platine de plus de 25 cm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Avant de connecter la sonde CI à la scène de tête, assurez-vous que toute la configuration électrique est correctement mise à la terre. Ne pas le faire peut introduire des interférences électriques indésirables pendant les enregistrements expérimentaux.</li>
	<li>Anesthésier les animaux à la suite d’un rapport publié précédemment10.</li>
	<li>Effectuez une intervention chirurgicale pour exposer la région d’intérêt. NOTE: Une sternotomie médiane a été réalisée dans la présente étude pour exposer le cœur. Veuillez consulter Kluge et al.10 pour plus de détails sur la chirurgie animale.</li>
	<li>Retirez doucement la pointe fonctionnalisée du rinçage PBS (étape 1.11.), transférez l’aiguille hydodermique à la sonde C.I. barbelée et implantez-la doucement dans la région d’intérêt avant de brancher la broche du connecteur en or dans la scène de tête. Une fois implanté, retirez l’aiguille hypodermique en laissant l’électrode en place. NOTE: Pour la présente étude, la sonde a été placée dans la paroi médiane latérale du myocarde ventriculaire gauche10.</li>
	<li>Après avoir assuré une configuration électrique appropriée, procédez à des protocoles d’essai standard et expérimentaux (étape 2.2. et étape 2.4.).</li>
	<li>À la fin des expériences, euthanasier l’animal en suivant des techniques approuvées par l’établissement. NOTE: Dans la présente étude, les animaux sont euthanasiés sous anesthésie profonde par induction de fibrillation ventriculaire10.</li>
</ol>

<ol><li>Chow, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Biomarkers+for+the+prevention%2C+assessment%2C+and+management+of+heart+failure%3A+A+scientific+statement+from+the+American+Heart+Association%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Role of Biomarkers for the prevention, assessment, and management of heart failure: A scientific statement from the American Heart Association.</a> Circulation. 135 (22), 1054-1091 (2017).</li>
<li>Goldstein, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adrenal+responses+to+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">Adrenal responses to stress.</a> Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (8), 1433-1440 (2010).</li>
<li>Ullman, B., Hulting, J., Lundberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prognostic+value+of+plasma+neuropeptide-Y+in+coronary+care+unit+patients+with+and+without+acute+myocardial+infarction%5BTitle%5D)+AND+%22European+Heart+Journal%22%5BJournal%5D)">Prognostic value of plasma neuropeptide-Y in coronary care unit patients with and without acute myocardial infarction.</a> European Heart Journal. 15 (4), 454-461 (1994).</li>
<li>Farrell, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiotensin+II+modulates+catecholamine+release+into+interstitial+fluid+of+canine+myocardium+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Angiotensin II modulates catecholamine release into interstitial fluid of canine myocardium in vivo.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 281 (2), 813-822 (2001).</li>
<li>Ardell, J. L., Foreman, R. D., Armour, J. A., Shivkumar, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathectomy+and+spinal+cord+stimulation+attenuate+reflex-mediated+norepinephrine+release+during+ischemia+preventing+ventricular+fibrillation%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathectomy and spinal cord stimulation attenuate reflex-mediated norepinephrine release during ischemia preventing ventricular fibrillation.</a> JCI Insight. 4 (23), 131648(2019).</li>
<li>Franco-Cereceda, A., Lundberg, J. M., Dahlof, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuropeptide+Y+and+sympathetic+control+of+heart+contractility+and+coronary+vascular+tone%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiologica+Scandinavica%22%5BJournal%5D)">Neuropeptide Y and sympathetic control of heart contractility and coronary vascular tone.</a> Acta Physiologica Scandinavica. 124 (3), 361-369 (1985).</li>
<li>Habecker, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+cellular+neurocardiology%3A+development%2C+and+cellular+and+molecular+adaptations+to+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Molecular and cellular neurocardiology: development, and cellular and molecular adaptations to heart disease.</a> The Journal of Physiology. 594 (14), 3853-3875 (2016).</li>
<li>Hoang, J. D., Salavatian, S., Yamaguchi, N., Swid, M. A., Vaseghi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+sympathetic+activation+circumvents+high-dose+beta+blocker+therapy+in+part+through+release+of+neuropeptide+Y%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Cardiac sympathetic activation circumvents high-dose beta blocker therapy in part through release of neuropeptide Y.</a> JCI Insight. 5 (11), 135519(2020).</li>
<li>Rigel, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+neuropeptides+on+heart+rate+in+dogs%3A+comparison+of+VIP%2C+PHI%2C+NPY%2C+CGRP%2C+and+NT%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Effects of neuropeptides on heart rate in dogs: comparison of VIP, PHI, NPY, CGRP, and NT.</a> American Journal of Physiology. 255, 311-317 (1988).</li>
<li>Kluge, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+measurement+of+cardiac+neuropeptide+dynamics+by+capacitive+immunoprobe+in+the+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Rapid measurement of cardiac neuropeptide dynamics by capacitive immunoprobe in the porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 320 (1), 66-76 (2021).</li>
<li>Berggren, C., Bjarnason, B., Johansson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Capacitive+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Electroanalysis%22%5BJournal%5D)">Capacitive biosensors.</a> Electroanalysis. 13 (3), 173-180 (2001).</li>
<li>Prodromidis, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impedimetric+immunosensors-A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Electrochimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Impedimetric immunosensors-A review.</a> Electrochimica Acta. 55 (14), 4227-4233 (2010).</li>
<li>Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mussel-inspired+surface+chemistry+for+multifunctional+coatings%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings.</a> Science. 318 (5849), 426-430 (2007).</li>
<li>Leszczyszyn, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secretion+of+catecholamines+from+individual+adrenal+medullary+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Secretion of catecholamines from individual adrenal medullary chromaffin cells.</a> Journal of Neurochemistry. 56 (6), 1855-1863 (1991).</li>
<li>Pihel, K., Schroeder, T. J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+selective+cyclic+voltammetric+measurements+of+epinephrine+and+norepinephrine+as+a+method+to+measure+secretion+from+single+bovine+adrenal+medullary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Rapid and selective cyclic voltammetric measurements of epinephrine and norepinephrine as a method to measure secretion from single bovine adrenal medullary cells.</a> Analytical Chemistry. 66 (24), 4532-4537 (1994).</li>
<li>Jaffe, E. H., Marty, A., Schulte, A., Chow, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrasynaptic+vesicular+transmitter+release+from+the+somata+of+substantia+nigra+neurons+in+rat+midbrain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Extrasynaptic vesicular transmitter release from the somata of substantia nigra neurons in rat midbrain slices.</a> The Journal of Neuroscience. 18 (10), 3548-3553 (1998).</li>
<li>Walsh, P. L., Petrovic, J., Wightman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+splanchnic+nerve+and+chromaffin+cell+stimulation+in+mouse+adrenal+slices+with+fast-scan+cyclic+voltammetry%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Distinguishing splanchnic nerve and chromaffin cell stimulation in mouse adrenal slices with fast-scan cyclic voltammetry.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 300 (1), 49-57 (2011).</li>
<li>Wolfe, J. T., Wang, H., Perez-Reyes, E., Barrett, P. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulation+of+recombinant+Ca%28v%293.2%2C+T-type%2C+Ca%282%2B%29+channel+currents+by+CaMKIIgamma%28C%29%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stimulation of recombinant Ca(v)3.2, T-type, Ca(2+) channel currents by CaMKIIgamma(C).</a> The Journal of Physiology. 538, 343-355 (2002).</li>
<li>Chan, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+in+vivo+detection+of+myocardial+norepinephrine+levels+in+the+beating+porcine+heart%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Heart+and+Circulatory+Physiology%22%5BJournal%5D)">Fast in vivo detection of myocardial norepinephrine levels in the beating porcine heart.</a> American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 318 (5), 1091-1099 (2020).</li>
<li>Chow, R. H., von Rüden, L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChow%2C+RH+%22Single-Channel+Recording%2C+Second+Edition%22">Single-Channel Recording, Second Edition</a>. Sakmann, B., Neher, E. , Plenum Press. 245-275 (1995).</li>
<li>Ren, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile%2C+high+efficiency+immobilization+of+lipase+enzyme+on+magnetic+iron+oxide+nanoparticles+via+a+biomimetic+coating%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Facile, high efficiency immobilization of lipase enzyme on magnetic iron oxide nanoparticles via a biomimetic coating.</a> BMC Biotechnology. 11, 63(2011).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts, financier ou autre.

Le présent protocole décrit la fabrication et l’essai d’une immunosonde capacitive (sonde IC) capable de détecter et de mesurer des biomarqueurs d’intérêt in vitro et in vivo . La détection est réalisée en piégeant le biomarqueur à l’extrémité de l’électrode. L’événement de piégeage modifie la jonction capacitive entre une immunosonde capacitive à fil de platine et l’environnement de fluide conducteur environnant, mesurée comme un changement de courant de charge en réponse à un changement potentiel dans...

Plusieurs méthodes chimiques de détection et de quantification des biomarqueurs sont couramment utilisées dans la chimie des protéines et le diagnostic clinique, en particulier dans les diagnostics de cancer et l’évaluation de la progression des maladies cardiovasculaires. Actuellement, des méthodes telles que la chromatographie liquide à haute performance (CLHP), le dosage immuno-enzymatique (ELISA) et la spectrométrie de masse reposent sur la collecte d’échantillons dans le compartiment vasculaire 1,2,3 par prélèvement de fluide en vrac ou dans le compartiment interstitiel par microdialyse. La microdialyse utilise un tube membranaire semi-perméable de longueur connue qui est placé dans une région d’intérêt. Le liquide de prélèvement est perfusé à travers le tube pendant plusieurs minutes4 pour prélever l’échantillon pour l’analyse5, limitant ainsi la résolution temporelle. De cette manière, les échantillons prélevés ne fournissent qu’une valeur moyenne dans le temps du microenvironnement local et sont limités par le taux de perfusion et la collecte d’un volume d’échantillon suffisant. De plus, ces méthodes nécessitent la mise en commun des données expérimentales et la moyenne des signaux; par conséquent, ils peuvent ne pas tenir compte de la variabilité entre les sujets. Il est important de noter que le temps écoulé entre le prélèvement de l’échantillon et l’analyse hors ligne ultérieure empêche une intervention clinique et thérapeutique immédiate.
Dans le présent protocole, l’utilisation d’un biocapteur capacitif d’immunosonde (sonde CI) pour la détection électrique résolue dans le temps de peptides bioactifs spécifiques est décrite. Le neuropeptide Y (NPY), libéré par les neurones sympathiques post-ganglionnaires qui innervent le système vasculaire, l’endocarde, les cardiomyocytes et les ganglions intracardiaques, est un transmetteur peptidique neuromodulateur majeur dans le système cardiovasculaire 6,7,8,9. La méthode présentée ici est conçue pour mesurer le NPY, et la faisabilité expérimentale est démontrée dans un modèle de cœur porcin. Cependant, cette approche s’applique à tout peptide bioactif pour lequel un anticorps sélectif est disponible10. Cette méthode repose sur la jonction capacitive entre une sonde en fil de platine et le fluide conducteur à la pointe fonctionnalisée11,12. Dans cette application, l’interaction a été médiée par un anticorps contre le neuropeptide cible (NPY), qui était lié à la pointe de l’électrode, interfaçant l’environnement fluide conducteur. Cette fonctionnalisation a été obtenue par électrodéposition de polydopamine réactive sur la pointe de la sonde de fil de platine10,13.
Lorsque la sonde fonctionnalisée par anticorps est placée in vivo dans une région d’intérêt, la libération endogène évoquée de NPY conduit à la liaison aux anticorps de piégeage sur la pointe de la sonde, et le fluide conducteur à la surface de l’électrode est déplacé par la protéine NPY. L’altération locale de l’environnement électrique entraîne le déplacement d’un fluide à haute mobilité et à haute diélectrique avec une molécule immobile chargée statiquement. Cela modifie l’interface électrode-fluide et, par conséquent, sa capacité, qui est mesurée comme un changement de courant de charge en réponse à un potentiel de commande de fonction pas à pas. Un potentiel de « réinitialisation » négatif est utilisé immédiatement après chaque cycle de mesure individuel pour repousser le NPY lié de l’anticorps par interaction électrostatique, éliminant ainsi les sites de liaison des anticorps pour les cycles de mesure suivants10. Cela permet effectivement de mesurer le NPY d’une manière résolue dans le temps. La technique unique d’IC surmonte les limites des méthodes immunochimiques basées sur la microdialyse décrites ci-dessus pour mesurer les niveaux de biomarqueurs dynamiques à partir d’une seule expérience sans mise en commun des données ni moyenne des signaux sur plusieurs expériences9, fournissant des données en temps quasi réel. De plus, la capacité d’adapter cette méthode à tout biomarqueur d’intérêt pour lequel il existe un anticorps approprié à une échelle localisée et résolue dans le temps fournit une avancée technique majeure dans la mesure immunochimique pour l’évaluation de la progression de la maladie et l’orientation des interventions thérapeutiques.
Le logiciel d’acquisition et d’analyse de données a été écrit sur mesure dans IGOR Pro (un environnement logiciel entièrement interactif). Un système de convertisseur analogique-numérique (A/N) émettait une tension de commande sous contrôle informatique et acquérait des données à partir d’un amplificateur personnalisé. L’amplificateur possédait certaines caractéristiques uniques. Ceux-ci comprenaient une résistance de rétroaction (commutable) pour chacun des quatre canaux d’acquisition, permettant de choisir des circuits de serrage de tension de rétroaction de 1 MOhm ou 10 MOhm pour intégrer la variabilité de l’électrode. Une unité de scène avec une seule tête et un circuit de terre / référence mutuel pour les quatre canaux d’acquisition a également été construite pour placer l’appareil près de la poitrine dans un seul module physique. Un réglage de résistance de rétroaction de 1 MOhm a été utilisé pour collecter toutes les données rapportées.
Les paramètres de filtre et de gain ont été télégraphiés à partir de l’amplificateur et enregistrés dans le fichier de données. Les données ont été filtrées à 1 kHz via un filtre Bessel analogique à 2 pôles numérisé à 10 kHz. La différence de potentiel entre la sonde et la solution conductrice environnante crée une couche capacitive de Helmholtz à l’extrémité de la sonde. La liaison du ligand à l’anticorps à l’extrémité de la sonde entraîne une altération de la charge locale et, par conséquent, une modification de la capacité de Helmholtz. Cette modification de la composante capacitive du circuit entraîne un changement dans l’amplitude de la charge injectée nécessaire pour amener la sonde au potentiel du protocole de tension à fonction pas à pas. Ainsi, la liaison d’un ligand spécifique à la sonde fonctionnalisée entraîne une altération de la mesure de la capacité de l’électrode sous la forme d’un changement du courant capacitif de crête.

<table><tbody><tr><td>Électrode disque AgCl</td><td>Warner Instruments (Holliston, MA)</td><td>64-1307</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps monoclonal anti-NPY</td><td>Abcam, (Cambridge, MA)</td><td>ab112473</td><td></td></tr><tr><td>Amplificateur multicanal personnalisé/ 1 M&Omega ; résistance de rétroaction multicanal Headstage</td><td>NPI Electronic, (Tamm, Allemagne)</td><td>NA</td><td>Basé sur NPI VA-10M amplificateur multicanal</td></tr><tr><td>Dopamine HCl</td><td>Sigma Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>H8502-10G</td><td></td></tr><tr><td>Connecteur mâle plaqué or</td><td>AMP-TE Connectivity (Amplimite)</td><td>6-66506-1</td><td></td></tr><tr><td>HEKA LIH 8+8 Dispositif analogique-numérique/numérique-analogique</td><td>HEKA Elektronik, (Holliston, MA)</td><td>Logiciel</td> d’acquisition de données NA <td></td></tr><tr><td>Igor Pro, v. 7.08</td><td>WaveMetrics, (Lake Oswego, OR)</td><td></td><td>Le logiciel pilotant le potentiel de commande et l’acquisition de données a été écrit sur mesure</td></tr><tr><td>Pompe péristaltique numérique Masterflex L/S Standard</td><td>Cole Palmer, (Vernon Hills, IL)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fil de platine revêtu de PFA</td><td>A-M Systems, (Sequim, WA)</td><td>773000</td><td>0,005 » de diamètre nu, 0,008 » de diamètre revêtu</td></tr><tr><td>Élastomère de silicone</td><td>World Precision Instruments (Sarasota, FL)</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Peptide NPY porcin synthétique</td><td>Bachem (Torrance, CA)</td><td></td><td></td>4011654</tr><tr><td>Peptide NPY porcin synthétique</td><td>Bachem (Torrance, CA)</td><td>4011654</td><td></td></tr></tbody></table>

mesure in vivo résolue dans le temps de la dynamique des neuropeptides par immunosonde capacitive dans le cœur porcin

Time-Resolved In Vivo Measurement of Neuropeptide Dynamics by Capacitive Immunoprobe in Porcine Heart

La capacité de mesurer in vivo des biomarqueurs pertinents pour l’évaluation de la progression de la maladie est d’un grand intérêt pour les communautés scientifiques et médicales. La résolution des résultats obtenus à partir des méthodes actuelles de mesure de certains biomarqueurs peut prendre plusieurs jours ou semaines, car leur résolution peut être limitée à la fois spatialement et temporellement (p. ex., microdialyse du compartiment fluide du liquide interstitiel analysée par dosage immuno-enzymatique [ELISA], chromatographie liquide à haute performance [CLHP] ou spectrométrie de masse); ainsi, leur orientation du diagnostic et du traitement en temps opportun est perturbée. Dans la présente étude, une technique unique de détection et de mesure des transmetteurs peptidiques in vivo grâce à l’utilisation d’un biocapteur capacitif d’immunosonde (sonde CI) est rapportée. Le protocole de fabrication et la caractérisation in vitro de ces sondes sont décrits. Des mesures de la libération in vivo de neuropeptide Y évoqué par stimulation sympathique (NPY) sont fournies. La libération de NPY est corrélée à la libération sympathique de noradrénaline à titre de référence. Les données démontrent une approche pour la mesure rapide et localisée des neuropeptides in vivo. Les applications futures comprennent l’évaluation peropératoire en temps réel de la progression de la maladie et le déploiement mini-invasif de ces sondes par cathéter.

Fabrication et caractérisation d’électrodes Une immunosonde capacitive flexible (sondes CI) a été fabriquée et une image représentative est représentée à la figure 1A. Le potentiel de l’électrode a été défini par un circuit de serrage de tension contrôlé par ordinateur (Figure 1B), et l’électrode a été immergée dans une solution de polydopamine fabriquée dans du PBS. La polydopamine a été électrodéposée sur la pointe d’électrode conductrice<s...

Les méthodes immunochimiques établies pour mesurer les transmetteurs peptidiques in vivo reposent sur la microdialyse ou le prélèvement de fluide en vrac pour obtenir l’échantillon en vue d’une analyse hors ligne. Cependant, ceux-ci souffrent de limitations spatio-temporelles. Le présent protocole décrit la fabrication et l’application d’un biocapteur capacitif immunoprobe qui surmonte les limites des techniques existantes.

Mesure in vivo résolue dans le temps de la dynamique des neuropeptides par immunosonde capacitive dans le cœur porcin

The ability to measure biomarkers in vivo relevant to the assessment of disease progression is of great interest to the scientific and medical ...

C’est la première fois qu’une méthode est développée pour la mesure résolue dans le temps des niveaux de transmetteurs peptidiques in vivo. Nous pouvons mesurer les niveaux de transmetteurs peptidiques chez des sujets individuels et des emplacements discrets avec une analyse en temps quasi réel. Tout d’abord, coupez une longueur de 25 centimètres de fil de platine recouvert de perfluoroalkyxie.Ensuite, à l’aide d’un scalpel, dénudez environ cinq millimètres de revêtement perfluoroalcoxy d’une extrémité, en prenant soin de ne pas couper dans le fil de platine. Maintenant, insérez l’extrémité dénudée du fil de platine dans une broche de connecteur mâle plaquée or d’un millimètre. Ensuite, à l’aide d’une pince à aiguille, sertissez les dents de la broche du connecteur autour de l’extrémité dénudée du fil de platine et soudez le fil de platine à la broche de connecteur plaquée or.Ensuite, préparez la solution de dopamine en ajoutant 50 milligrammes de chlorhydrate de dopamine dans 50 millilitres de PBS de 10 millimolaires avec un pH de six et mélangez en remuant. Après avoir complètement dissous la dopamine, placez l’extrémité du fil de platine dans le récipient contenant le PBS supplémenté en dopamine fraîchement fabriqué. Connectez l’électrode du disque de chlorure d’argent au canal de terre dans l’étage de tête.Ensuite, placez le disque de chlorure d’argent dans le récipient contenant du PBS supplémenté en dopamine et du fil de platine. Avant de continuer, connectez un shunt de fil aux canaux de référence de l’étage de tête. Ouvrez le logiciel interactif d’acquisition de données et définissez un protocole de potentiel de commande d’électrodéposition en dents de scie en réglant le potentiel de démarrage à moins 0,6 volt, le potentiel de fin à 0,65 volt, le taux de balayage à 0,04 volt par seconde et la durée de dépôt à 420 secondes.Après avoir terminé le dépôt de poly-dopamine, retirez la pastille de chlorure d’argent moulue et l’extrémité du fil de platine du récipient. Placez l’embout du fil dans un microtube contenant du PBS de pH 7,4 pendant deux à cinq minutes et assurez-vous que l’embout du fil n’entre pas en contact avec les côtés ou le fond du microtube. Ensuite, préparez la solution d’anticorps en combinant l’anticorps d’intérêt avec le PBS de pH 7,4 dans un rapport de 1:20 dans un récipient de taille appropriée.Ensuite, faites tremper la pointe déposée en poly-dopamine de l’électrode de platine dans une solution d’anticorps pendant deux heures à température ambiante, en veillant à ce que la pointe du fil de platine soit suspendue en solution et ne repose pas sur la surface intérieure du microtube. Placez la pointe fonctionnelle de l’immunosonde capacitive dans la chambre d’écoulement, en prenant soin de ne pas perturber la pointe de l’électrode de quelque manière que ce soit, car cela pourrait endommager la pointe sensorielle de la sonde. Avant le premier test expérimental, effectuez une exécution standard TBS pour conditionner la sonde immunosonde capacitive et, pour le protocole de tension, réglez le potentiel de pas positif à 110 millivolts, le potentiel de pas négatif à moins cinq millivolts, la durée de pas de 20 millisecondes et la durée d’acquisition à 600 secondes.Ensuite, créez la solution peptidique d’intérêt en utilisant le même TBS pour maintenir la composition du superfusat. Mettre en place un système de collecteur où le superfusat peut être commuté entre TBS et TBS complété par des peptides. Utilisez les paramètres standard TBS et configurez le protocole d’acquisition de données de détection peptidique en réglant la durée d’acquisition à 360 secondes.Avant le dépôt de poly-dopamine, enfilez la pointe exposée de l’électrode en fil de platine à travers une aiguille hypodermique de calibre 22, laissant environ deux millimètres au-delà de la pointe de l’aiguille. Utilisez des pinces et pliez doucement l’extrémité de l’électrode en fil de platine pour créer une barbe qui pend de l’extrémité de l’aiguille hypodermique. Retirez doucement l’aiguille de la pointe barbelée, en laissant suffisamment de fil à placer dans le récipient sans que l’aiguille n’entre en contact avec le liquide et procédez au dépôt de dopamine comme démontré précédemment.Maintenant, rincez la pointe de la sonde barbelée avec du PBS et placez-la dans la solution d’anticorps. Ensuite, retirez doucement la pointe fonctionnalisée du PBS. Déplacez l’aiguille hypodermique vers la sonde immunoactive capacitive barbelée et implantez-la doucement dans la région d’intérêt avant de brancher la broche du connecteur en or dans l’étage de tête.Une fois implanté, retirez l’aiguille hypodermique en laissant l’électrode en place. Une étape positive dans le potentiel de commande mesure le courant d’injection nécessaire pour serrer la tension de la sonde et permet la mesure du courant capacitif. L’étape de potentiel de commande négative efface le peptide lié de l’anticorps par répulsion électrostatique.La forme d’onde de commande de la fonction pas représentait la détection itérative résolue dans le temps et la quantification du peptide. La trace inférieure représentait le potentiel de commande et le courant résultant sous la superfusion de la sonde dans TBS. L’immunosonde capacitive équilibrée a montré une carie initiale plus petite et une ligne de base stable sur six minutes.Le flux de neuropeptide Y dans la chambre d’écoulement a augmenté les courants capacitifs par rapport à la ligne de base. Les courants d’immunosonde capacitifs mesurés avec une sonde fonctionnalisée par anticorps neuropeptide Y ont montré un signal dépendant de la concentration sensible au neuropeptide Y à faible picomole Pour l’étalonnage, une courbe standard a été mesurée pour toutes les concentrations testées. La stimulation du ganglion stellaire bilatéral a montré un niveau élevé de neuropeptide Y lorsqu’il est co-tracé avec les courants capacitifs de contrôle négatif.La libération de noradrénaline mesurée sous stimulation stellaire a montré une libération synchrone avec le neuropeptide Y, compatible avec une réponse sympathique évoquée. Le développement de ces techniques peut fournir des lectures peropératoires des modulateurs clés de l’activité cardiaque, fournissant ainsi un guidage thérapeutique ou interventionnel rapide potentiel. La technique présentée ici est spécifique au déploiement cardiovasculaire, mais la technique elle-même convient à d’autres contextes physiologiques, tels que l’urine, les muscles squelettiques, les reins, le tissu adipeux, etc.

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Mesure in vivo résolue dans le temps de la dynamique des neuropeptides par immunosonde capacitive dans le cœur porcin

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