Mesure in vivo résolue dans le temps de la dynamique des neuropeptides par immunosonde capacitive dans le cœur porcin

C’est la première fois qu’une méthode est développée pour la mesure résolue dans le temps des niveaux de transmetteurs peptidiques in vivo. Nous pouvons mesurer les niveaux de transmetteurs peptidiques chez des sujets individuels et des emplacements discrets avec une analyse en temps quasi réel. Tout d’abord, coupez une longueur de 25 centimètres de fil de platine recouvert de perfluoroalkyxie.

Ensuite, à l’aide d’un scalpel, dénudez environ cinq millimètres de revêtement perfluoroalcoxy d’une extrémité, en prenant soin de ne pas couper dans le fil de platine. Maintenant, insérez l’extrémité dénudée du fil de platine dans une broche de connecteur mâle plaquée or d’un millimètre. Ensuite, à l’aide d’une pince à aiguille, sertissez les dents de la broche du connecteur autour de l’extrémité dénudée du fil de platine et soudez le fil de platine à la broche de connecteur plaquée or.

Ensuite, préparez la solution de dopamine en ajoutant 50 milligrammes de chlorhydrate de dopamine dans 50 millilitres de PBS de 10 millimolaires avec un pH de six et mélangez en remuant. Après avoir complètement dissous la dopamine, placez l’extrémité du fil de platine dans le récipient contenant le PBS supplémenté en dopamine fraîchement fabriqué. Connectez l’électrode du disque de chlorure d’argent au canal de terre dans l’étage de tête.

Ensuite, placez le disque de chlorure d’argent dans le récipient contenant du PBS supplémenté en dopamine et du fil de platine. Avant de continuer, connectez un shunt de fil aux canaux de référence de l’étage de tête. Ouvrez le logiciel interactif d’acquisition de données et définissez un protocole de potentiel de commande d’électrodéposition en dents de scie en réglant le potentiel de démarrage à moins 0,6 volt, le potentiel de fin à 0,65 volt, le taux de balayage à 0,04 volt par seconde et la durée de dépôt à 420 secondes.

Après avoir terminé le dépôt de poly-dopamine, retirez la pastille de chlorure d’argent moulue et l’extrémité du fil de platine du récipient. Placez l’embout du fil dans un microtube contenant du PBS de pH 7,4 pendant deux à cinq minutes et assurez-vous que l’embout du fil n’entre pas en contact avec les côtés ou le fond du microtube. Ensuite, préparez la solution d’anticorps en combinant l’anticorps d’intérêt avec le PBS de pH 7,4 dans un rapport de 1:20 dans un récipient de taille appropriée.

Ensuite, faites tremper la pointe déposée en poly-dopamine de l’électrode de platine dans une solution d’anticorps pendant deux heures à température ambiante, en veillant à ce que la pointe du fil de platine soit suspendue en solution et ne repose pas sur la surface intérieure du microtube. Placez la pointe fonctionnelle de l’immunosonde capacitive dans la chambre d’écoulement, en prenant soin de ne pas perturber la pointe de l’électrode de quelque manière que ce soit, car cela pourrait endommager la pointe sensorielle de la sonde. Avant le premier test expérimental, effectuez une exécution standard TBS pour conditionner la sonde immunosonde capacitive et, pour le protocole de tension, réglez le potentiel de pas positif à 110 millivolts, le potentiel de pas négatif à moins cinq millivolts, la durée de pas de 20 millisecondes et la durée d’acquisition à 600 secondes.

Ensuite, créez la solution peptidique d’intérêt en utilisant le même TBS pour maintenir la composition du superfusat. Mettre en place un système de collecteur où le superfusat peut être commuté entre TBS et TBS complété par des peptides. Utilisez les paramètres standard TBS et configurez le protocole d’acquisition de données de détection peptidique en réglant la durée d’acquisition à 360 secondes.

Avant le dépôt de poly-dopamine, enfilez la pointe exposée de l’électrode en fil de platine à travers une aiguille hypodermique de calibre 22, laissant environ deux millimètres au-delà de la pointe de l’aiguille. Utilisez des pinces et pliez doucement l’extrémité de l’électrode en fil de platine pour créer une barbe qui pend de l’extrémité de l’aiguille hypodermique. Retirez doucement l’aiguille de la pointe barbelée, en laissant suffisamment de fil à placer dans le récipient sans que l’aiguille n’entre en contact avec le liquide et procédez au dépôt de dopamine comme démontré précédemment.

Maintenant, rincez la pointe de la sonde barbelée avec du PBS et placez-la dans la solution d’anticorps. Ensuite, retirez doucement la pointe fonctionnalisée du PBS. Déplacez l’aiguille hypodermique vers la sonde immunoactive capacitive barbelée et implantez-la doucement dans la région d’intérêt avant de brancher la broche du connecteur en or dans l’étage de tête.

Une fois implanté, retirez l’aiguille hypodermique en laissant l’électrode en place. Une étape positive dans le potentiel de commande mesure le courant d’injection nécessaire pour serrer la tension de la sonde et permet la mesure du courant capacitif. L’étape de potentiel de commande négative efface le peptide lié de l’anticorps par répulsion électrostatique.

La forme d’onde de commande de la fonction pas représentait la détection itérative résolue dans le temps et la quantification du peptide. La trace inférieure représentait le potentiel de commande et le courant résultant sous la superfusion de la sonde dans TBS. L’immunosonde capacitive équilibrée a montré une carie initiale plus petite et une ligne de base stable sur six minutes.

Le flux de neuropeptide Y dans la chambre d’écoulement a augmenté les courants capacitifs par rapport à la ligne de base. Les courants d’immunosonde capacitifs mesurés avec une sonde fonctionnalisée par anticorps neuropeptide Y ont montré un signal dépendant de la concentration sensible au neuropeptide Y à faible picomole Pour l’étalonnage, une courbe standard a été mesurée pour toutes les concentrations testées. La stimulation du ganglion stellaire bilatéral a montré un niveau élevé de neuropeptide Y lorsqu’il est co-tracé avec les courants capacitifs de contrôle négatif.

La libération de noradrénaline mesurée sous stimulation stellaire a montré une libération synchrone avec le neuropeptide Y, compatible avec une réponse sympathique évoquée. Le développement de ces techniques peut fournir des lectures peropératoires des modulateurs clés de l’activité cardiaque, fournissant ainsi un guidage thérapeutique ou interventionnel rapide potentiel. La technique présentée ici est spécifique au déploiement cardiovasculaire, mais la technique elle-même convient à d’autres contextes physiologiques, tels que l’urine, les muscles squelettiques, les reins, le tissu adipeux, etc.