Détermination de l’affinité de liaison (K_D) des anticorps radiomarqués aux antigènes immobilisés

Cette méthode permet de déterminer l’affinité de liaison d’un anticorps radiomarqué pour son antigène. Il mesurera également la spécificité de la liaison. Le principal avantage de cette méthode simple est la caractérisation spécifique de l’affinité de liaison de l’anticorps radiomarqué uniquement sans interférence de l’anticorps parental non conjugué.

Cette technique valide quantitativement la capacité d’un anticorps radiomarqué à se lier à sa cible. Ceci est important pour les applications en imagerie nucléaire et en thérapie nucléaire dans une variété de maladies. Erika Belitzky, une associée de troisième cycle de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.

Pour commencer, préparez un tampon d’immobilisation en ajoutant 191 milligrammes de bicarbonate de sodium et 23,9 milligrammes de carbonate de sodium à un tube conique de 50 millilitres. Ensuite, ajoutez 40 millilitres d’eau de 18 mégaohms et dissolvez par vortex. Maintenant, ajustez le pH à 9,0 avant de porter le volume total à 50 millilitres.

Ensuite, préparez 200 millilitres de tampon de lavage en ajoutant 200 millilitres de PBS et 100 microlitres de Tween 20 à une bouteille de 250 millilitres. Préparez également 50 millilitres de tampon de liaison en ajoutant 50 milligrammes de BSA et 25 microlitres de Tween 20 à 50 millilitres de PBS et mélangez par vortex. Ajouter 1,5 gramme de BSA à 50 millilitres de PBS pour préparer le tampon bloquant et le vortex doucement pour mélanger.

Diluer l’antigène dans un tampon d’immobilisation. Ensuite, prenez une plaque à fond plat de 96 puits et ajoutez 100 microlitres d’antigène au fond de chaque puits de 24 puits dans un réseau de huit par trois. Couvrir la plaque avec du ruban adhésif et incuber à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, lavez la plaque trois fois avec un tampon de lavage. Inversez la plaque rapidement dans l’évier pour éliminer le liquide et tapotez la plaque sur un tas d’essuie-tout pour éliminer l’excès de liquide. Ensuite, aux puits contenant l’antigène, ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage par puits à l’aide d’une pipette multicanal.

Ajouter 300 microlitres de tampon bloquant par puits aux puits revêtus de 24 antigènes et aux 24 puits vides de la plaque de 96 puits. Ensuite, incubez la plaque pendant une heure à température ambiante et lavez chaque puits de la plaque trois fois avec 300 microlitres de tampon de lavage. Effectuer trois fois les dilutions en série de l’anticorps radiomarqué dans le tampon de liaison pendant huit rangées désignées comme A à H sur la plaque.

Tout d’abord, calculez le volume d’anticorps radiomarqué de base nécessaire pour fabriquer une solution de 1,2 millilitre de la première concentration. Ensuite, ajoutez 800 microlitres de tampon de liaison aux tubes de microcentrifugation étiquetés B à H et ajoutez le volume requis de tampon de liaison à un tube de microcentrifuge étiqueté A.Ajoutez le volume calculé d’anticorps radiomarqués de base au tube A et vortexez doucement. Ensuite, tournez vers le bas à l’aide d’une mini-microcentrifugeuse pour recueillir tout le liquide au fond du tube.

Ensuite, ajoutez 400 microlitres de liquide de deux A au tube B.Après le vortex, faites-le tourner vers le bas à l’aide d’une mini-microcentrifugeuse. De même, ajouter la solution du tube B au tube C, C à D, jusqu’au tube H.Ajouter 100 microlitres de chaque dilution par puits à trois puits immobilisés avec de l’antigène et trois puits bloqués avec du BSA seulement. Maintenant, ajoutez 100 microlitres de chaque dilution aux tubes de microcentrifugation étiquetés A standard à H standard et enregistrez ces tubes en tant qu’étalons d’anticorps radiomarqués à doser dans le compteur gamma.

Incuber la plaque pendant une heure à 37 degrés Celsius avec un léger balancement. Étiquetez les tubes de microcentrifugation pour chaque puits tel que décrit dans le manuscrit. Aspirer l’anticorps radiomarqué des puits de la plaque de 96 puits à l’aide d’un aspirateur à vide.

Maintenant, à l’aide d’une pipette multicanal, ajoutez 300 microlitres de tampon de lavage à chaque puits. Aspirez le tampon de lavage et répétez le lavage quatre fois de plus. Séparez les puits en tubes de microcentrifugation appropriés.

Comptez la radioactivité dans les tubes avec l’antigène marqué comme H1, H2, H3, H3 à A1, A2, A3, puis avec BSA uniquement marqué comme H4, H5, H6, à A4, A5, A6 à l’aide d’un compteur gamma. L’amivantamab radiomarqué a montré une liaison spécifique pour les protéines EGFR et cMET. De même, des affinités de liaison ont également été conservées par des fabs radiomarqués à bras unique liés aux protéines EGFR et cMET.

Les diagrammes de liaison à la saturation ont montré que lorsque les concentrations d’anticorps radiomarqués étaient trop faibles, la saturation n’était pas atteinte, comme l’indique la courbe linéaire. Des concentrations d’anticorps radiomarqués trop élevées ont conduit à une saturation sans croissance logarithmique distincte, comme le montre le plateau horizontal. En outre, une liaison non spécifique élevée a été observée en raison de concentrations élevées d’anticorps radiomarqués.

Cette procédure peut prendre plusieurs tentatives pour optimiser la plage de concentration pour chaque anticorps radiomarqué spécifique. Utilisez les données des résultats négatifs pour aider à concevoir de futures expériences. Une fois que l’affinité de liaison est connue, il peut être utilisé comme référence pour d’autres essais in vitro dans le cadre de la caractérisation d’un anticorps radiomarqué.