Développement de modèles de Drosophila melanogaster pour l’imagerie et le contrôle optogénétique de la fonction cardiaque

Le protocole présente des modèles de drosophile où la fonction cardiaque peut être caractérisée et contrôlée à l’aide de la lumière. Cela permet aux chercheurs d’étudier les maladies cardiaques humaines chez la drosophile en utilisant des animaux intacts. Cette méthode permet d’obtenir de manière fiable une imagerie OCT non invasive et un contrôle optogénétique de la fonction cardiaque de la drosophile.

Il a une efficacité et une qualité élevées. La stimulation optogénétique peut potentiellement être une alternative à la stimulation électrique comme thérapie pour traiter les troubles arythmiques. L’imagerie OCT et la stimulation optogénétique peuvent être étendues à d’autres systèmes modèles tels que les organoïdes cardiaques, le poisson zèbre et la gorge et le cœur embryonnaires.

Pour commencer, combinez cinq mains GAL4 sur TM6 femelle vierge à double tubby et deux à trois mouches mâles de UAS Ops et Stocks par flacon. Le lendemain, préparez des aliments semi-définis selon les instructions du Bloomington Drosophila Stock Center en ajoutant 5,14 grammes par 100 millilitres de saccharose dans un récipient sur une plaque chauffante. Ensuite, refroidissez-le à 60 degrés Celsius en remuant constamment.

Ensuite, préparez des flacons étroits contre les mouches en ajoutant 50 microlitres de solution d’éthanol rétinien tout-trans de 100 millimolaires à chaque flacon. Utilisez une pipette sérologique pour éliminer cinq millilitres de nourriture pour mouches par mouche étroite. Après avoir vortex à vitesse maximale pendant 10 secondes, branchez ces flacons et enveloppez-les dans le tissu sombre pour les protéger de la lumière.

Le lendemain, transférer les mouches pondant régulièrement des œufs dans les flacons avec de la nourriture contenant de l’éthanol rétinien entièrement trans. Protégez les racks avec des flacons de la lumière. Après 24 à 48 heures, selon le nombre d’œufs pondus, jetez les parents pour éviter la surpopulation des flacons.

Ensuite, prélevez la progéniture non tubby pour l’imagerie cardiaque. Choisissez la larve ou la nymphe GAL4 de l’option UAS dans le flacon, placez-la sur un mouchoir en papier et essuyez doucement le support de la surface du corps à l’aide d’un pinceau. Préparez la lame de microscope avec un petit morceau de ruban adhésif double face au milieu.

Ensuite, placez doucement la larve ou la nymphe sur la surface de la bande avec le côté dorsal vers le haut et perpendiculairement au côté long de la lame à l’aide d’une brosse ou d’une pince à épiler fine. Appliquez une légère pression pour attacher la larve ou la nymphe à la surface de la bande. Maintenant, installez la lame sur la scène d’imagerie avec la larve ou la nymphe tournée vers le bas et allumez la tomographie par cohérence optique ou la source de lumière OCT par un logiciel de contrôle laser.

Ouvrez le logiciel de contrôle OCT de domaine spectral écrit personnalisé. Ensuite, cliquez sur la fenêtre d’aperçu. Ensuite, définissez les paramètres de numérisation dans le logiciel OCT du domaine spectral.

Utilisez des micro-manipulateurs pour contrôler l’étape de l’échantillon afin de mettre au point le cœur de mouche. Ajustez la position focale pour minimiser la réflexion de la lumière de la surface de la cuticule de la mouche. Pensez également à appliquer de l’huile minérale sur la surface de la larve ou de la nymphe pour minimiser la réflexion.

Ensuite, définissez les paramètres de numérisation pour l’acquisition d’images OCT en mode M et acquérez cinq ensembles de données de contrôle sans impulsions de stimulation de la lumière rouge pour calculer la fréquence cardiaque au repos. Concevez l’impulsion lumineuse pour la stimulation de la stimulation dans le logiciel de contrôle OCT personnalisé. Pour cela, cliquez sur les onglets des paramètres et ajoutez les séquences d’impulsions lumineuses conçues pour contrôler la fréquence d’impulsion, la largeur d’impulsion, la durée de stimulation et le temps d’attente selon différents protocoles de stimulation.

Ouvrez ensuite le logiciel de contrôle de lumière pour générer des impulsions de lumière rouge. Choisissez le mode d’impulsion dans la sélection du mode. Double-cliquez sur la figure correspondant aux paramètres du profil d’impulsion, puis choisissez le mode suiveur.

Maintenez l’intensité off à zéro et réglez le pourcentage d’intensité activé lors du calcul de la densité de puissance réelle. Acquérir des vidéos en mode M du cœur battant de la drosophile avec stimulation lumineuse en cliquant sur Acquérir dans le logiciel de contrôle OCT. Enregistrez les éclairs de lumière rouge dans le cœur de la mouche pendant l’acquisition de l’imagerie.

Notez que différents paramètres de stimulation sont nécessaires pour contrôler la fonction cardiaque de la mouche avec des modèles de channelrhodopsine décalée vers le rouge et de mouches NPHR. Ouvrez le logiciel de segmentation de cœur de mouche développé sur mesure et cliquez sur sélectionner un fichier. Sélectionnez ensuite le fichier à analyser dans l’interface utilisateur graphique.

Entrez les limites verticales et horizontales de la région du cœur en pixels dans les zones de texte supérieures. Cliquez sur redimensionner. À l’aide du curseur en bas, assurez-vous que toute la région du cœur est visible et qu’elle remplit toute la boîte pour toute la collection.

Après avoir cliqué sur l’onglet prédire, le programme passera en revue chaque tranche de la collection et sélectionnera la région du cœur en trois minutes environ. Une fois la prédiction terminée, cliquez sur le graphique HR pour afficher un tracé de la région du cœur au fil du temps dans une nouvelle fenêtre. Sélectionnez les zones de pic ou de vallée correctes, choisissez le pouls, puis les onglets HR pour générer un chiffre final.

Les paramètres fonctionnels seront enregistrés simultanément dans les fichiers CSV. La spécificité tissulaire du pilote GAL4 de la main a été vérifiée par imagerie de l’expression de protéines fluorescentes vertes. Les images typiques de la TCO de la coupe transversale des larves et des nymphes sont présentées ici.

Pour imiter différentes affections cardiaques, quatre types d’impulsions lumineuses ont été conçus. Une seule impulsion d’une durée de 10 secondes après cinq secondes d’attente a généré un arrêt cardiaque réparateur. Pour la stimulation cardiaque à des fréquences inférieures à la fréquence cardiaque au repos, deux séquences d’impulsions lumineuses avec des fréquences de stimulation égales à la moitié de la fréquence cardiaque au repos et un quart de la fréquence cardiaque au repos d’une durée de huit secondes avec un temps d’attente de six secondes entre les deux ont été utilisées.

Le schéma de stimulation pour augmenter la fréquence cardiaque due à l’activation de la channelrhodopsine décalée vers le rouge consistait en trois séquences d’impulsions lumineuses. La fréquence réduite de contraction cardiaque suivant les signaux lumineux a entraîné un ralentissement du rythme cardiaque qui imite les larves et les nymphes. Une série de trois trains d’impulsions lumineuses à différentes fréquences de stimulation a été appliquée sur les larves et les cœurs de pupes ont clairement montré une augmentation de la fréquence cardiaque après les impulsions lumineuses.

La sélection de la préparation de la descendance correcte, le montage de l’échantillon et la procédure d’imagerie sont essentiels. Nous espérons transférer la technologie de stimulation optogénétique à des modèles animaux plus grands, étudier les maladies cardiaques des mammifères et explorer de nouvelles approches thérapeutiques pour traiter l’arythmie.