Name: Auto-assemblage de tactoïdes de microtubules (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Découvrez l'auto-assemblage de tactoïdes de microtubules avec MAP65 et PEG pour étudier l'organisation des microtubules et les fuseaux mitotiques. Cette méthode minimaliste et reproductible offre un modèle accessible pour la biologie cellulaire.

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Les auteurs tiennent à remercier tous les membres du Ross Lab de l’été 2021, en particulier K. Alice Lindsay, pour leur aide. Ce travail a été soutenu par une subvention de NSF BIO-2134215 qui a soutenu S. Sahu, N. Goodbee, H.B. Lee et J.L. Ross. Une subvention de la Fondation KECK (Rae Anderson, USD, chercheur principal) a partiellement soutenu R. Branch et P. Chauhan

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</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts financiers concurrents.

Les méthodes décrites ici ont été utilisées dans plusieurs articles pour créer des tactoïdes de microtubules (Figure 2)22,28. Ces expériences sont biologiquement pertinentes pour aider à découvrir les principes organisationnels qui contrôlent la forme et la stabilité du fuseau mitotique ou méiotique dans la plupart des types de cellules. En outre, les microtubules sont des mésogènes à cristaux liquides modèles qui peuvent aider à en apprendre davantage sur la façon dont les cristaux liquides se nucléent et développent des phases nématiques à partir de phases isotropes.
La procédure décrite ici présente plusieurs avantages pour explorer l’auto-organisation des microtubules. Tout d’abord, il est hautement reproductible, ayant été effectué en laboratoire par de nombreux étudiants, y compris des lycéens, avec peu de connaissances préalables ou de formation avant de commencer dans le laboratoire. Les tactoïdes sont biréfringents22, ce qui leur permet d’être vus en lumière transmise en plus de la microscopie à fluorescence, rendant cette méthode accessible à de nombreux laboratoires et cette procédure expérimentale adaptable à des fins éducatives, en plus de la recherche haut de gamme. Enfin, ce processus ouvre des voies pour continuer à comprendre et à sonder les systèmes biologiques dans une approche réductionniste dépouillée, permettant de comprendre comment chaque condition, protéine ou additif supplémentaire peut altérer l’auto-organisation des tactoïdes et, peut-être, en fin de compte, le fuseau. Les cibles pour un meilleur biomimétisme comprennent l’activité, la fluidité et le tri de la polarité des filaments.
Plusieurs facteurs peuvent affecter l’expérience donnant des résultats inattendus. Par exemple, si les tactoïdes ne se forment pas (Figure 2) mais que des motifs en forme d’éventail sont observés, le MAP65 n’est probablement pas présent ou ne se lie pas aux microtubules22,28. Cela devrait également être évident dans le canal de fluorescence MAP65, car le GFP-MAP65 ne sera pas lié aux microtubules.
Si les tactoïdes ne se forment pas et que l’arrière-plan apparaît comme des taches sur le verre, cela pourrait être dû au revêtement de surface. Une fois effectuée, la silanisation ne dure que 1 mois sur les coverslips. Lorsqu’elle s’estompe, la tubuline pourra se lier à la surface exposée de manière non spécifique. Cette liaison se produira selon des modèles étranges.
Si les tactoïdes ne se forment pas et que la tubuline est observée dans des agrégats de différentes formes et tailles, cela pourrait être dû à une tubuline de mauvaise qualité. La tubuline peut être centrifugée pour éliminer les agrégats initiaux qui peuvent entraîner cette agrégation hors voie au lieu de la polymérisation des microtubules. Si la surface se lie à la tubuline, elle peut également épuiser la tubuline dans la solution. De faibles concentrations de tubuline, inférieures à la concentration critique pour la polymérisation des microtubules, peuvent entraîner des agrégats.
Dans les expériences FRAP, si le canal MAP65 ne montre aucune récupération (Figure 5), il est possible que le photoblanchiment ait été photodamant les microtubules. Les photodommages provoquent la destruction localisée des filaments. Cela peut être vérifié par un examen dans le canal transmis. Les tactoïdes de microtubules sont visibles dans le canal transmis à travers un indice élevé de décalage de réfraction avec l’eau environnante. Les photodommages induits par la lumière apparaîtront comme une marque de brûlure ou une perte de contraste dans l’imagerie de la lumière transmise à l’emplacement du retour sur investissement soumis au photoblanchiment. Si cela se produit, la puissance du laser ou de la lumière doit être réduite pour inhiber les photodommages des protéines.
Plusieurs défis ont été rencontrés dans cette procédure et cette approche. Un problème est que les mesures de longueur sont actuellement effectuées à la main en cliquant sur l’image. Cette méthode, bien que simple, peut entraîner une grande incertitude. La mesure de la largeur qui utilise la section transversale et l’ajustement à un gaussien est une meilleure méthode pour quantifier la taille. Une méthode similaire pourrait être utilisée pour la longueur. Un deuxième problème est que, parfois, les tactoïdes, parce qu’ils sont si longs et minces, peuvent se plier. Cela rend la quantification de la longueur plus difficile. La longueur du contour peut être quantifiée à l’aide d’une ligne segmentée, mais il y a une incertitude supplémentaire chaque fois qu’un segment est ajouté.
D’un point de vue scientifique, cette approche présente d’autres défis pour son utilisation comme modèle pour les cristaux liquides ou les fuseaux. Le premier défi a été la forme longue et mince des tactoïdes que les microtubules créent (Figure 3 et Figure 4). Comme indiqué dans des publications antérieures22, les tactoïdes microtubules sont des tactoïdes homogènes, et non bipolaires. Cela signifie que les microtubules qui composent la forme ne se réorientent pas pour pointer vers les extrémités de la structure. Au lieu de cela, tous les microtubules sont parallèles à l’axe long et les « pôles » sont situés à l’infini. Ceci est très différent des tactoïdes observés pour les cristaux liquides moléculaires ou même pour l’actine ou l’ADN qui peuvent également agir comme mésogènes à cristaux liquides. Dans ces autres systèmes, les tactoïdes sont bipolaires et, lorsqu’ils sont vus dans des polariseurs croisés, ils montrent les signes révélateurs de réorientation des tiges.
Un deuxième défi majeur dans ce système est que les microtubules sont immobiles à l’intérieur du tactoïde. Cela ressort clairement des expériences et des analyses FRAP, car la récupération des microtubules est très faible. Leur nature solide rend les tactoïdes de microtubules moins précieux que les analogues à cristaux liquides à grande échelle. La phase nématique d’un cristal liquide doit avoir à la fois des propriétés liquides (fluides) et cristallines (organisées). Bien que la forme semble appropriée pour la broche, l’immobilité rend le système moins excitant qu’un modèle de broche mitotique. D’autre part, ce numéro offre des occasions d’étudier comment on peut modifier les expériences pour créer plus de fluidité dans le système.
Ces défis scientifiques offrent des opportunités passionnantes qui permettront de nouvelles connaissances sur le système. Pour rendre les tactoïdes de microtubules plus bipolaires, on pourrait utiliser des microtubules plus courts. Il y a un défi supplémentaire, cependant, puisque les microtubules n’ont pas beaucoup de protéines de capsulage bien caractérisées pour contrôler la longueur comme le fait l’actine. L’utilisation de la nucléation et de la croissance nécessite l’utilisation de très fortes concentrations de tubuline et de GMPCPP pour fabriquer des microtubules courts. La concentration élevée de tubuline entraîne un plus grand nombre de filaments dans le système, ce qui rend plus difficile la séparation des tactoïdes les uns des autres. L’ajout de nouveaux cappers de microtubules, tels que DARPin33, peut aider à résoudre cette situation. Le deuxième problème de l’immobilité des microtubules pourrait être atténué par l’ajout de protéines motrices, telles que la kinésine-534, qui sont des tétramères de moteurs utilisés dans la mitose. Alternativement, des dimères artificiels de kinésine dimérique-1 pourraient être utilisés15.
Une autre façon d’ajouter plus de fluidité serait de permettre aux microtubules d’effectuer leur instabilité dynamique, la croissance et le rétrécissement des microtubules. Actuellement, les microtubules qui sont ensemencés avec des filaments GMPCPP stables et qui subissent ensuite une instabilité dynamique sont beaucoup plus longs que souhaité pour former un fuseau ou un tactoïde, ce qui entraînerait de très longues organisations comme des ventilateurs ou des faisceaux. Ainsi, l’ajout d’instabilité dynamique des microtubules devrait être fait avec soin pour préserver la forme tactoïde. L’ajout de protéines et d’enzymes associées qui peuvent contrôler la longueur peut atténuer ce problème. Par exemple, des kinésines dépolymérisantes, telles que la kinésine 1335, ou des enzymes de séparation, comme la katanin36, seraient probablement nécessaires. Ces expériences sont complexes et difficiles, bien qu’elles soient très perspicaces, peu importe ce que les résultats révèlent. Quelle que soit la direction que prendront les expériences futures, la plate-forme développée ici pour créer des tactoïdes de microtubules peut exposer de nouvelles informations sur la base physique de l’organisation des microtubules.

La division cellulaire par mitose est l’un des processus biologiques les plus importants pour maintenir la vie. Les filaments de microtubules, composés de dimères de tubuline, sont des éléments structurels essentiels de ce processus. La machinerie transitoire créée en métaphase lorsque les chromosomes s’alignent au centre cellulaire est appelée fuseau mitotique en raison de sa forme, qui est comme un fuseau d’un métier à tisser recouvert de fils (Figure 1A). Il est bien établi dans de nombreux organismes que les microtubules sont utilisés en métaphase pour pousser et tirer les chromosomes condensés au centre de la cellule, les aligner et les brancher à des microtubules qui les sépareront en anaphase (Figure 1B, C). Le fuseau se forme à la fois dans la méiose (Figure 1B) et la mitose (Figure 1C), créées à partir de nombreux microtubules qui se chevauchent et qui ne sont pas enroulés autour de l’axe central comme un filetage, mais parallèles à l’interface. La création de ces structures à base de microtubules nécessite des protéines associées qui se réticulent et des enzymes associées qui peuvent agir comme moteurs pour aider à pousser et à tirer les chromosomes1.
Des études sur les fuseaux méiotiques ont montré que les microtubules sont courts, dynamiques et se chevauchent dans des réseaux réticulés 2,3,4,5,6 (Figure 1Di). En raison de l’organisation physique de ces microtubules courts, le fuseau méiotique est similaire à un tactoïde à cristaux liquides (Figure 1E). En effet, il a été démontré que les fuseaux fusionnent et fusionnent, comme on pourrait s’y attendre des tactoïdes à cristaux liquides5.
De nombreuses études remontant aux années 1960 ont utilisé la fixation, les coupes en série et la microscopie électronique pour déterminer qu’il existe deux types de microtubules à l’intérieur du fuseau mitotique 7,8,9,10. Le premier type est appelé les microtubules de kinétochore, qui relient le pôle de broche au kinétochore. Le deuxième type est appelé microtubules interpolaires ou polaires, qui se développent au-delà des chromosomes et se chevauchent à la zone médiane (Figure 1Dii)8,9,10. Un troisième type est appelé les microtubules astraux, qui sont à l’extérieur de la broche et relient les pôles au bord de la cellule; ces organisations de microtubules sortent du cadre de la discussion actuelle. Il y a eu des études récentes sur l’interaction entre l’augmine6 et le complexe de cycles gamma-tubuline influençant les centres de nucléation des microtubules, ce qui a entraîné un fuseau mitotique avec des microtubules plus courts comme dans la figure 1D.
Étant donné que les microtubules sont plus longs que larges, avec un rapport d’aspect élevé et une rigidité élevée, ils sont comme des versions mises à l’échelle des molécules de cristaux liquides. En physique de la matière molle, les atomes et les molécules ont été approchés en utilisant des interactions minimales pour déduire les mécanismes physiques des transitions de phase, y compris la nucléation et la fusion des cristaux11. De même, les microtubules sont des objets à méso-échelle qui sont des versions à grande échelle de molécules de cristaux liquides, donnant un aperçu de la physique de la dynamique des cristaux liquides, y compris la nucléation et la croissance des phases nématiques à partir de phases isotropes. En outre, comme discuté ci-dessus, le fuseau méiotique présente des propriétés similaires à celles d’un tactoïde à cristaux liquides, un état nématique qui se nuclée et se développe à partir de l’état isotrope des molécules de cristaux liquides 3,4,5. Pour les tactoïdes, la nucléation et la croissance sont semblables à celles des autres cristaux (c’est-à-dire nécessitant une concentration relativement élevée de mésogènes [les molécules qui forment les cristaux liquides]). La forme unique du « fuseau » du tactoïde provient de l’alignement local des mésogènes à cristaux liquides qui s’alignent dans la phase nématique (Figure 1E). Ils ne peuvent pas former un cristal arrondi car les molécules sont très asymétriques. Compte tenu de la nature des microtubules, il n’est peut-être pas surprenant que la machinerie de broche mitotique fabriquée à partir d’une forte concentration locale de microtubules soit également de la même forme, qu’elle soit appelée tactoïde ou fuseau. Les tactoïdes peuvent être bipolaires, avec des pôles aux extrémités effilées (Figure 1Ei), ou homogènes, avec des pôles effectivement à l’infini (Figure 1Eii).
Compte tenu de l’importance de la formation du fuseau, des efforts ont été entrepris pour la formation auto-organisée du fuseau in vitro en démontrant la condensation des microtubules en faisceaux via les espèces ioniques 12,13, les agents d’encombrement qui créent des interactions d’épuisement 14,15 et les protéines de réticulation de microtubules spécifiques 13,16,17,18,19, 21. Étonnamment, bien que ces agents agissent tous pour augmenter la concentration locale de microtubules, ils se traduisent souvent par de longs faisceaux de microtubules mais pas de tactoïdes. L’une des raisons pour lesquelles ces faisceaux sont longs pourrait être que les microtubules qui les composent sont également longs. Des travaux récents utilisant des microtubules plus courts ont également rapporté des faisceaux plus longs qui ne sont pas effilés à la fin15; dans ce cas, les faisceaux sont maintenus ensemble avec des protéines motrices qui provoquent l’extension des faisceaux et, par conséquent, les rendent plus longs. Des microtubules courts avec des réticulants non extensiles sont nécessaires pour les assemblages coniques en forme de broche, comme décrit ici.
Récemment, nous avons développé une technique permettant la création de tactoïdes de microtubules à l’aide du réticulateur antiparallèle, MAP65, en présence de microtubules stables nucléants22. Les microtubules devaient être courts, mais peu de régulateurs connus de la longueur des microtubules peuvent coiffer les microtubules contre l’instabilité dynamique ou le recuit de bout en bout. Au lieu de cela, gmpcpp a été utilisé pour nucléer et stabiliser les filaments après la croissance. Cela a permis de créer une densité élevée de microtubules courts qui pouvaient s’auto-organiser en tactoïdes. Ces tactoïdes étaient homogènes lorsqu’ils étaient considérés sous biréfringence. En plus des microtubules courts, un réticulateur antiparallèle spécifique, MAP65, a été utilisé pour former les tactoïdes (Figure 2). MAP65 est une protéine végétale associée aux microtubules de la famille PRC1/Ase1 des réticulants mitotiques23. MAP65 existe sous forme de dimère, avec une forte affinité pour se lier à lui-même ainsi qu’aux microtubules24. Contrairement au fuseau méiotique et aux tactoïdes observés avec les filaments d’actine 25,26,27, qui sont bipolaires et ont les propriétés liquides des cristaux liquides, les tactoïdes de microtubules ont été observés comme étant solides 22,28.
Ici, des protocoles sont présentés pour créer les tactoïdes de microtubules et caractériser la forme des assemblages et la mobilité des constituants à l’aide de techniques basées sur la fluorescence.

<table><tbody><tr><td>2 % de dichlorodiméthylsilane</td><td>GE Healthcare</td><td>118945</td><td>Un traitement de surface hydrophobe au silane. Il peut être réutilisé jusqu’à trois fois et conservé à température ambiante pendant un an.</td></tr><tr><td>5-minute époxy</td><td>Bob Smith Industries</td><td></td><td>Pour l’étanchéité des chambres expérimentales</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Fisher</td><td>32900HPLC</td><td>100 %</td></tr><tr><td>BL21 cellules</td><td>Bio Labs</td><td>C2527I</td><td>Cellules bactériennes compétentes utilisées pour exprimer MAP65</td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma</td><td>C30-500MG</td><td>Fait partie du système de piégeage de l’oxygène. Un stock de 300 mg/ml est fabriqué dans ddH2O et stocké dans 10 &mu ; l aliquotes en -20&deg ; C pour une durée maximale d’un an.</td></tr><tr><td>Lamelles (22 mm x 22 mm ou 22 mm x 30 mm)</td><td>Fisher</td><td>12544-AP</td><td>Pour les chambres expérimentales</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>Une petite molécule utilisée pour rompre les liaisons disulfure et récupérer l’oxygène. Un stock de 1 M est fabriqué à partir de poudre (Sigma) dans ddH2O. La solution est aliquote et stockée à -20C jusqu’à un an. Les aliquotes sont utilisées 7 à 8 fois puis jetées.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>Tampon de tubuline ingrédient de base</td></tr><tr><td>Eppendorf Tubes de 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>Pour maintenir les solutions expérimentales</td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Fisher</td><td>111000200</td><td>200</td></tr><tr><td>proof Papier filtre</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>Pour le nettoyage et l’extraction des solutions à travers les chambres expérimentales</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence à haute ouverture numérique objectifs</td><td>Nikon</td><td>Ti-E, W2 Confocal</td><td>Pour les expériences d’imagerie</td></tr><tr><td>Congélateur -20&deg ; C</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>Pour le stockage des réactifs</td></tr><tr><td>Congélateur -80&deg ; C</td><td>Thermo scientific</td><td>328223H01-C</td><td>Pour le stockage des protéines.</td></tr><tr><td>Récipients en verre pour l’silanisation</td><td>Michaels</td><td></td><td>Pour la préparation des chambres expérimentales - traitement des verres de couverture</td></tr><tr><td>Lames en verre</td><td>Fisher</td><td>12544-4</td><td>Pour les chambres expérimentales</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td>Fait partie du système de piégeage de l’oxygène. Un stock de 300 mg/ml est fabriqué dans ddH2O et stocké dans 10 &mu ; l aliquotes en -20&deg ;C.</td></tr><tr><td>Glucose oxydase</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Fait partie du système de piégeage de l’oxygène. Celle-ci est stockée à 4&deg ; C pour une durée maximale d’un an.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>Analogue lentement hydrolysable du GTP utilisé pour polymériser et stabiliser les microtubules en réduisant l’instabilité dynamique et la concentration critique spontanée pour la nucléation des microtubules afin d’obtenir une longueur constante. Nous achetons un stock de 10 mM chez Jena Biosciences et le stockons à -20&deg ; C pour une durée maximale d’un an.</td></tr><tr><td>Élément chauffant pour microscope</td><td>Incubateur</td><td></td> supérieur de platine Okolab <td>Pour les expériences d’imagerie</td></tr><tr><td>Imidizole</td><td>Sigma</td><td>I2399</td><td>Utilisé pour éluer la protéine MAP65 à partir de billes de nickel pour purifier MAP65</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>Pour le nettoyage et pour aspirer des solutions à travers des chambres expérimentales.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M en ddH2O, à l’état frais pour éviter l’acidification dans le temps.</td></tr><tr><td>Azote liquide</td><td>Airgas</td><td>NI 230LT22</td><td>Pour déposer des aliquotes de congélation. Il peut également être utilisé pour le stockage (non recommandé) de la</td></tr> <tr><td>protéine MAP65</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>Une protéine associée aux microtubules (MAP) d’un poids moléculaire de 65 kD qui est un réticulant anti-microtubule parallèle. Nous avons purifié une version non marquée et marquée à la GFP de MAP65-1 à partir d’Arabidopsis thaliana. Nous mélangeons le GFP-MAP65 avec le MAP65 non marqué, de sorte que 10 % de la protéine est marquée. Le stock de travail est un 10.8 &mu ; M. Cette solution de travail est stockée à 4&deg ; C et refait chaque semaine. Le protocole de purification du MAP65 et du GFP-MAP65 est donné dans notre chapitre méthodes précédentes (26).</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>MKCJ940</td><td>Tubuline ingrédient tampon</td></tr><tr><td>NTA-Nickel perles</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>nécessaires pour purifier 6xHis protéines MAP65 marquées</td></tr><tr><td>Optomicroscan</td><td>Système laser Nikon</td><td></td><td>405 nm qui peut focaliser le laser dans n’importe quelle forme souhaitée de région d’intérêt</td></tr><tr><td>PEM80</td><td></td><td></td><td>Tampon de base de polymérisation de tubuline neutre pour solution à base de tuyaux K de 80 mM, pH 6,8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, stocké à 4&deg ; C pour une durée maximale d’un an.</td></tr><tr><td>Ruban adhésif permanent double face</td><td>3M - Scotch</td><td>34-8724-5691-7</td><td>Pour chambres expérimentales Boîte</td></tr><tr><td>de Pétri Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Pour chambre humide</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P7643-100G</td><td>Tampon de tubuline ingrédient de base</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Un copolymère séquestre avec deux blocs d’oxyde de polyéthylène (PEO) hydrophile aux extrémités et un bloc central hydrophobe de revêtement de surface hydrophobe à l’oxyde de polyphénylène (PPO) que nous utilisons pour empêcher la liaison des protéines à la surface. Pluronic-F127 est acheté sous forme de poudre (Sigma) et dissous dans une solution à 5 % (p/v) dans ddH2O pendant la nuit. Une fois dissoute, la solution peut être conservée à température ambiante jusqu’à un an.</td></tr><tr><td>Polyéthylène glycol</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM</td><td>Un agent d’encombrement utilisé pour créer des forces d’épuisement afin de faire remonter les tactoïdes à la surface et d’aider à organiser les microtubules. Nous créons une solution à 5 % (p/v) de PEG 100 kDa dans PEM80. La solution est stockée à 4&deg ; C jusqu’à un an et placé sur la bascule avant utilisation. Il est visqueux, nous vous recommandons donc d’utiliser une pipette à déplacement positif pour le travailler.</td></tr><tr><td>Pipette à déplacement positif</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Pour le pipetage de liquides visqueux</td></tr><tr><td>Racks pour lamelles</td> de <td>recouvrement Microscopie électronique Sciences</td><td>72240</td><td>Pour la préparation de chambres expérimentales - traitement des verres de protection</td></tr><tr><td>Réfrigérateur 4&deg ; C</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Pour le stockage des réactifs</td></tr><tr><td>Tubuline</td><td>Cytosquelette</td> marqué <td>TL590M</td> La <td>tubuline lyophilisée marquée à la rhodamine provenant de cerveau de porc est achetée (cytosquelette) et stockée à -80&deg ; C jusqu’à ce qu’il soit hydraté dans PEM80 et utilisé jusqu’à un an.</td></tr><tr><td>Protéine de tubuline</td><td>Cytosquelette</td><td>T240</td><td>La tubuline lyophilisée à 99 % pure non étiquetée à partir de cerveau de porc est achetée (cytosquelette) et stockée dans -80&deg ; C jusqu’à ce qu’il soit hydraté dans PEM80 et utilisé jusqu’à un an.</td></tr><tr><td>UV-Ozone</td><td>Jelight</td><td>Model 342</td><td>Pour la préparation de chambres expérimentales - traitement des verres de couverture</td></tr><tr><td>Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td> <td>plugin pour l’enregistrement des données de séries chronologiques pour supprimer la dérive</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> <td>plugin pour l’enregistrement des données de séries temporelles pour supprimer la dérive</td></tr></tbody></table>

auto-assemblage de tactoïdes de microtubules

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Le cytosquelette est responsable de l’organisation interne majeure et de la réorganisation au sein de la cellule, le tout sans gestionnaire pour diriger les changements. C’est particulièrement le cas lors de la mitose ou de la méiose, où les microtubules forment le fuseau lors de la division cellulaire. Le fuseau est la machinerie utilisée pour séparer le matériel génétique pendant la division cellulaire. Pour créer des fuseaux auto-organisés in vitro, nous avons récemment développé une technique pour reconstituer des microtubules en assemblages de type fuseau avec un ensemble minimal de protéines associées aux microtubules et d’agents d’encombrement. Plus précisément, MAP65 a été utilisé, qui est un réticulant de microtubules antiparallèles de plantes, un homologue d’Ase1 de levure et de PRC1 d’organismes de mammifères. Ce réticulant auto-organise les microtubules en assemblages auto-organisés de microtubules longs, minces et en forme de fuseau. Ces assemblages sont également similaires aux tactoïdes à cristaux liquides, et les microtubules pourraient être utilisés comme mésogènes à méso-échelle. Ici, des protocoles sont présentés pour créer ces tactoïdes de microtubules, ainsi que pour caractériser la forme des assemblages à l’aide de la microscopie à fluorescence et la mobilité des constituants en utilisant la récupération de fluorescence après photoblanchiment.

Avec seulement un petit nombre de composants, de dimères de tubuline et de réticulants de microtubules, des tactoïdes de microtubules peuvent se former (Figure 2A). Bien que ce protocole décrive l’incubation pour nucléer et développer des microtubules dans un incubateur, la nucléation et la croissance peuvent être observées directement au microscope (qui sont complètes en 30 minutes) (Figure 2B). La concentration de tubuline est maintenue constante à 13,6 μm et la liaison MAP65-MT à 10%.
La figure 4 représente les données réussies. Les tactoïdes doivent être visibles à la fois avec un laser de 561 nm dans le canal de la tubuline et de 488 nm dans le canal MAP65, qui se chevauchent parfaitement (Figure 4A). Un mystère du système a été que la largeur des tactoïdes ne semble pas varier sous une variété de changements expérimentaux, y compris la modification des longueurs de microtubules, de la concentration de MAP65 et des agents d’encombrement (Figure 4B)22,28. La longueur est beaucoup plus variable et dépend à la fois de la longueur des microtubules et de la concentration de MAP65 (Figure 4B)22,28.
Lors de l’exécution de FRAP, il a été observé que le signal MAP65 se rétablit, mais que le signal du microtubule ne se rétablit pas (Figure 5). La récupération dans FRAP est due à la mobilité et au mouvement des objets étiquetés et photoblanchis. Dans le cas du MAP65, les molécules assombries se dissocient et s’éloignent du microtubule et de nouvelles se déplacent dans la région (Figure 5). La liaison MAP65 est en équilibre, de sorte que le taux de liaison et de déliaison est égal (mesuré en molécules par seconde). Pour les microtubules, aucune récupération n’a été observée, ce qui implique que les microtubules ne sont pas capables de quitter le tactoïde (Figure 5A, Bi, C). De plus, aucune propagation de la région sombre n’a été observée, ce qui suggère que les microtubules sont localement immobiles et non un fluide dans la forme tactoïde.
<img alt="Alignement des chromosomes en métaphase ; structure du fuseau et organisation des microtubules ; Schéma de microscopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Différents modèles de formation de fuseaux. Un fuseau mitotique est une machine faite de microtubules et de leurs protéines et enzymes associées qui aligne et sépare les chromosomes en deux nouvelles cellules filles pendant la division cellulaire. (A) Image d’une réplique de fuseau de chute du début du Moyen Âge avec du fil fin des Pays-Bas. Cette figure a été modifiée à partir d’une image Wikimedia par Peter van der Sluijs30. (B) Reconstruction tridimensionnelle de microtubules à différents stades de la méiose II de type sauvage. Les microtubules sont représentés en vert et les chromosomes en gris. Barre d’échelle = 1 μm. Ce chiffre a été modifié à partir de Lantzsch et al.31. (C) Image microscopique des microtubules dans un fuseau mitotique d’une cellule Sf9 en division. Les pôles du fuseau et les microtubules du fuseau sont marqués avec une protéine fluorescente verte. Barre d’échelle = 5 μm. Ce chiffre a été modifié à partir d’Advani et al.32. (D) Différents modèles d’organisation des microtubules fusiformes mitotiques et méiotiques. (i) Précédemment observés pour les fuseaux méiotiques créés à partir d’extraits d’œufs de Xenopus, les microtubules (verts) ont été déduits comme étant courts et dynamiques tout au long du fuseau. Ceci est similaire à une organisation tactoïde bipolaire à l’intérieur d’un cristal liquide. (ii) Le modèle canonique pour l’organisation des microtubules à l’intérieur d’un fuseau mitotique comporte deux types de microtubules : les microtubules interpolaires ou polaires (vert foncé) qui se réticulent à la zone médiane autour des chromosomes et les microtubules kinétochores (vert clair) qui sont regroupés et étirés du pôle au kinétochore pour pousser et tirer les chromosomes. Dans toutes les images, les chromosomes sont représentés en bleu transparent et les pôles du fuseau sont représentés en vert foncé. (E) Schémas de mésogènes (lignes vertes) dans un tactoïde à cristaux liquides pour (i) les tactoïdes bipolaires et (ii) les tactoïdes homogènes. Les tactoïdes bipolaires ont deux pôles à l’extrémité du tactoïde, et les mésogènes se réorientent pour pointer vers ces pôles. Les tactoïdes homogènes ont des pôles à l’infini, et les mésogènes ne changent pas d’orientation le long de la longueur du tactoïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Méthode de formation tactoïde, schémas et séries chronologiques ; microtubules, réticulation MAP65, microscopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Condensation des microtubules. (A) Les microtubules peuvent être regroupés et réticulés par diverses méthodes, y compris les espèces ioniques, les forces d’épuisement causées par les agents d’encombrement et les réticulants de microtubules spécifiques, tels que MAP65. i) Les dimères de tubuline et les protéines MAP65 sont mélangés pour nucléer et développer des microtubules. (ii) Les microtubules se nucléent et se développent à partir de la tubuline, et MAP65 se lie immédiatement aux microtubules, à un autre monomère MAP65, ou aux deux, et provoque un regroupement. iii) Les microtubules dans les faisceaux réticulés se nucléent et se développent. (iv) La configuration finale est un tactoïde de microtubule semblable à une broche. (B) Série chronologique de tactoïdes de microtubules se nucléant et se développant pendant 105 min. Barre d’échelle = 5 μm. Figure adaptée d’Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma de la chambre d’écoulement avec lamelle silanisée, pour l’analyse du sens d’écoulement des échantillons en microscopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Assemblage de la chambre d’écoulement. La chambre d’écoulement est fabriquée à l’aide d’une glissière en verre, d’un verre de couverture silanisé et d’un ruban adhésif double face permanent. La région surlignée en jaune est la voie d’écoulement où l’échantillon est acheminé et observé. Le volume de la chambre d’écoulement est d’environ 20 μL. L’époxy a été utilisé pour sceller les extrémités de la chambre afin d’empêcher l’échantillon de s’évaporer pendant l’imagerie à long terme pendant plusieurs heures. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse tactoïde : microtubules et canaux MAP65, images fusionnées, quantification longueur-largeur, graphique." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Images tactoïdes et analyse de la longueur et de la largeur. (A) Exemples de données de tactoïdes formés comme décrit et imagé à l’aide d’un disque confocal en rotation montrant (i) l’imagerie du canal microtubule de la tubuline marquée à la rhodamine à l’aide d’un laser de 561 nm, (ii) l’imagerie du canal GFP-MAP65 à l’aide d’un laser de 488 nm, et (iii) l’image de superposition fusionnée du canal microtubule (magenta) et du canal GFP-MAP65 (cyan). Les régions de chevauchement sont affichées en blanc et démontrent que les microtubules et MAP65 colocalisent exactement. Barre d’échelle = 10 μm pour toutes les images en (A). (B) Quantification de la longueur et de la largeur des tactoïdes. (i) Image d’un tactoïde à analyser sans étiquettes. Barre d’échelle = 5 μm. (ii) Même image que dans (i), où les mesures de longueur (ligne continue avec capuchons de ligne) et de largeur (ligne pointillée) sont indiquées. Barre d’échelle = 5 μm. (iii) La largeur a été mesurée en prenant le profil d’intensité à travers le tactoïde au bisecteur perpendiculaire (ligne pointillée) noté en (ii). Le profil d’intensité était adapté à une fonction gaussienne pour révéler l’amplitude et la largeur du tactoïde. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Analyse FRAP : microtubules, séries temporelles MAP65, courbes d’intensité. Dynamique de récupération de fluorescence." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Figure 5: Données et analyses FRAP représentatives. (A) Données de série chronologique de microscopie de (i) tactoïde microtubule et (ii) GFP-MAP65, et (iii) image superposée des deux canaux avec des microtubules en magenta et GFP-MAP65 en cyan qui ont été photoblanchis au temps 63 s et observés pendant 5 minutes supplémentaires. (B) Intensité quantifiée de la (i ) canal microtubule dans la région blanchie (cercles magenta) et arrière-plan (cercles gris foncé) et ii) canal GFP-MAP65 dans la région blanchie (carrés cyan) et arrière-plan (carrés gris foncé). (C) Les données ont été corrigées pour tenir compte du bruit de fond et redimensionnées pour le canal microtubule (cercles magenta) et le canal GFP-MAP65 (carrés cyan). Les microtubules ne se rétablissent pas, mais le GFP-MAP65 le fait et peut être adapté (ligne gris foncé) à une désintégration exponentielle croissante pour trouver l’amplitude et l’échelle de temps de récupération. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

Cet article présente un protocole pour la formation d’assemblages de microtubules en forme de tactoïdes en utilisant MAP65, un réticulant de microtubules à base de plantes, et PEG comme agent d’encombrement.

Auto-assemblage de tactoïdes de microtubules

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Ce protocole permet l’auto-organisation spontanée des tactoïdes de microtubules à l’aide d’un réticulateur anti-parallèle, MAP65. Ce système peut nous aider à comprendre l’organisation des microtubules et les systèmes biologiques comme les fuseaux mitotiques. Le principal avantage de cette technique est qu’il s’agit d’un système minimaliste capable de recréer des formes en forme de fuseau pour les microtubules, hautement reproductible et accessible à de nombreux laboratoires.Cette méthode n’est pas seulement applicable aux systèmes cellulaires, mais peut également servir de modèle pour les études de cristaux liquides à l’échelle méso. Pour préparer la tubuline, sortez d’abord une aliquote de tubuline non étiquetée contenant un milligramme de tubuline lyophilisée du congélateur à moins 80 degrés Celsius et conservez-la sur de la glace. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de PEM-80 froid.Pour dissoudre tout le lyophilate, gardez le tube sur de la glace pendant 10 minutes. Ensuite, sortez un tube de tubuline marquée à la rhodamine contenant 20 microgrammes de poudre de tubuline lyophilisée du congélateur à moins 80 degrés Celsius et conservez-le sur de la glace. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de PEM-80 froid et gardez le tube sur la glace pendant 10 minutes pour dissoudre tout le lyophilate.Une fois les tubulines lyophilisées dissoutes, ajouter 100 microlitres de la solution de tubuline non marquée remise en suspension à la solution de tubuline marquée à quatre microlitres de rhodamine. Ensuite, mélangez les solutions en tuyautant six à sept fois très lentement. Pour stocker les 100 microlitres restants de solution de tubuline non marquée, insérez d’abord le tube dans l’azote liquide pour congeler la solution, puis maintenez le tube à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future.Ensuite, répartissez le mélange de tubuline dans sept nouveaux tubes en ajoutant 15 microlitres dans chacun. Congelez les tubes dans de l’azote liquide comme démontré précédemment et stockez-les à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation future. Pour assembler des chambres d’écoulement pour effectuer des expériences, nettoyez d’abord une lame de verre avec de l’eau double distillée et séchez-la avec une lingette de laboratoire non pelucheuse.Ensuite, nettoyez d’abord la lame avec de l’éthanol, puis de l’eau distillée en double. Pour créer un chemin d’écoulement, coupez un morceau de ruban adhésif double face de 40 à 50 millimètres de long. Ensuite, divisez-le entre les deux pour créer deux bandes de ruban plus minces et placez les deux bandes sur la glissière espacées de cinq à huit millimètres.Ensuite, placez des glissières de couverture silanisées sur le dessus du chemin d’écoulement. Ensuite, scellez la glissière et le couvercle a glissé les bandes de ruban adhésif double face en appuyant doucement sur la zone de bande avec le dos d’un stylo. Si le joint est bien fait, le ruban doit passer de translucide à clair.Pour retirer le ruban adhésif supplémentaire sur les bords, coupez le ruban avec une lame de rasoir, en ne laissant qu’un millimètre de l’entrée de la chambre d’écoulement. Ensuite, étiquetez la chambre avec les paramètres expérimentaux appropriés Pour effectuer les expériences tactoïdes, tout d’abord, décongelez tous les réactifs nécessaires sur la glace et stockez-les sur la glace pendant le travail. Ensuite, recouvrez la chambre d’écoulement de 20 microlitres de 5% de tensioactif copolymère séquencé non ionique dissous dans le PEM-80 avec de petites gouttes aux deux extrémités de la chambre pour empêcher la formation de bulles d’air à l’intérieur.Ensuite, conservez la chambre d’écoulement dans une chambre humide en boîte de Pétri avec une lingette de laboratoire humide et non pelucheuse pendant au moins cinq à sept minutes. Ensuite, mélangez PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, dithiothréitol, glucose, polyéthylène glycol, le mélange de tubuline fabriqué plus tôt, et MAP65 avec GFP MAP65 pour la visualisation dans un tube stérile en pipetant cinq à six fois, en gardant le tube sur la glace. Ensuite, ajoutez un microlitre d’une solution prémélangée de glucose oxydase et de catalase dans le tube de mélange tubuline-MAP et mélangez à nouveau en tuyautant sept à huit fois.Diviser le volume total de la solution en deux portions à utiliser dans des chambres séparées. Pendant ce temps, le liquide ajouté plus tôt à la chambre d’écoulement doit être éliminé par action capillaire en utilisant une lingette de laboratoire non pelucheuse à l’autre extrémité de la chambre, ainsi que l’ajout du mélange tubuline-MAP à la chambre d’écoulement. Une fois que l’échantillon est complètement à l’intérieur de la chambre, scellez les deux extrémités de la chambre à l’aide d’époxy de cinq minutes et maintenez-le à 37 degrés Celsius pendant environ 30 minutes pour nucléer et développer des tactoïdes de microtubules.Pour l’imagerie des tactoïdes par microscopie à fluorescence, utilisez des objectifs avec une ouverture numérique de 1,2 ou plus en grossissement de 60X ou plus pour recueillir suffisamment de lumière en fluorescence. Enregistrez les images avec un semi-conducteur à oxyde métallique gratuit ou une caméra à dispositif à couplage de charge. Pour maintenir l’échantillon, conservez-le dans une chambre environnementale fixée à 37 degrés Celsius.Alternativement, d’autres réchauffeurs de scène, y compris des réchauffeurs de scène à air chaud et des colliers objectifs à température contrôlée avec circulation d’eau chaude, peuvent être utilisés à cette fin. Comme les sources d’excitation appropriées sont essentielles pour la fluorescence correcte de la tubuline de rhodamine, utilisez un laser de 561 nanomètres avec au moins un milliwatt de puissance à l’échantillon pour des images de bonne qualité. Cependant, pour GFP MAP65, remplacez la source d’excitation par un laser de 488 nanomètres.Si vous utilisez la microscopie à épifluorescence à grand champ, utilisez un cube filtrant en rhodamine avec une excitation de 540 12,5 nanomètres, dichroïque de 545 nanomètres 12,5 nanomètres et une émission de 575 nanomètres de long passage. Pour GFP MAP, utilisez un cube de filtre GFP avec une excitation de 480 à 15 nanomètres, un dichroïque de 505 nanomètres coupé à 15 nanomètres et une émission de 515 nanomètres de long passage. Après vous être assuré que la puissance d’éclairage et les temps d’exposition sont tels que l’échelle d’intensité de l’appareil photo n’est pas saturée, prenez au moins 10 images de différentes zones pour imager plus de 100 tactoïdes dans les canaux rouge et vert, et enregistrez-les en tant qu’images TIFF 16 bits pour analyse.En utilisant ce protocole, les tactoïdes de microtubules dont la formation est terminée en 30 minutes peuvent être directement visualisés au microscope. Les tactoïdes sont visibles à la fois avec un laser de 561 nanomètres dans le canal de la tubuline et un laser de 488 nanomètres dans le canal MAP65. Les images se chevauchent également parfaitement les unes avec les autres.Dans cette méthode, la longueur et la largeur des tactoïdes ont également pu être mesurées. Le profil d’intensité d’un tactoïde varie en fonction de sa largeur. De plus, la nature immobile des tactoïdes des microtubules a été démontrée par la récupération de fluorescence après photo-blanchiment ou expériences FRAP, qui n’ont montré aucune récupération de fluorescence après le photo-blanchiment.D’autre part, les expériences FRAP ont révélé une nature mobile de MAP65, pour laquelle une récupération progressive et une fluorescence ont pu être observées après photo-blanchiment. Cette récupération de fluorescence par MAP65 peut être adaptée à une désintégration exponentielle croissante pour trouver l’amplitude et l’échelle de temps de récupération. La partie de l’expérience tactoïde doit être terminée dans les 10 à 12 minutes, car la tubuline peut se détériorer rapidement sur la glace, ce qui peut nuire à la nucléation des tactoïdes.Les travaux futurs avec différentes protéines de réticulation de microtubules et de protéines motrices de réticulation, des enzymes capables de déplacer des microtubules, continueront d’exposer de nouvelles informations sur l’auto-organisation du fuseau mitotique.

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