Name: Une approche photodynamique pour étudier la fonction de rupture des vésicules intracellulaires (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 16 s
Description: Découvrez la technique CALI pour étudier la rupture des vésicules intracellulaires dans les cellules HeLa vivantes. Cette méthode photodynamique permet un contrôle spatiotemporel précis des dommages subcellulaires et l'analyse des voies de signalisation activées.

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Les auteurs souhaitent remercier l’Academia Sinica Inflammation Core Facility, IBMS pour son soutien à la recherche. L’installation de base est financée par le projet d’instrument de base et d’instrument novateur de l’Academia Sinica (AS-CFII-111-213). Les auteurs remercient l’installation de base d’équipement commun de l’Institut des sciences biomédicales (IBMS), Academia Sinica (AS) pour avoir aidé à l’acquisition d’images.

1. Préparation du stock AlPcS2a
<ol><li>Dissoudre 10 mg d’AlPcS2a dans 400 μL de NaOH 0,1 M. Pour améliorer la solubilité, chauffer la solution à 50 °C et vortex.</li>
	<li>Mélanger la solution avec 4 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ensuite, filtrer la solution avec un filtre de 0,22 μm pour éliminer les précipités insolubles.</li>
	<li>Mesurer la concentration de la solution à l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis. Le coefficient d’extinction de AlPcS2a à 672 nm est de 4 x 104 cm-1 M-1. Diluer la solution AlPcS2a avec du PBS pour obtenir une solution de 1 mM. Préparer 1 mL d’aliquotes et conserver à -20 °C.</li>
</ol>2. Transfection
NOTE: Gal3-GFP est appliqué comme indicateur pour l’imagerie de cellules vivantes de la rupture lysosomale.
<ol><li>Maintenir la culture cellulaire HeLa dans du DMEM complété par 10% de sérum fœtal bovin (FBS). Après avoir lavé les cellules avec du PBS, trypsiniser les cellules, puis remettre en suspension les cellules dans du DMEM complété par 10% de FBS. REMARQUE: La méthode est applicable à la plupart des lignées cellulaires attachées, y compris les lignées cellulaires HeLa et A549. En principe, bien qu’ils n’aient pas testé de cellules en suspension, des tests CALI pourraient être effectués avec celles-ci.</li>
	<li>Diluer 300 ng de plasmide Gal3-GFP dans 25 μL de milieu sérique réduit, puis ajouter 0,6 μL de réactif P3000. Mélanger délicatement. Diluer 0,45 μL de réactif Lipofectamine 3000 dans 25 μL de milieu sérique réduit. Mélanger délicatement.</li>
	<li>Incuber pendant 5 min à température ambiante. Mélanger l’ADN dilué et la lipofectamine 3000 diluée, puis incuber pendant 10 min à température ambiante.</li>
	<li>Mélanger le mélange ADN-lipofectamine, 3 x 105 cellules HeLa en suspension et 200 μL de DMEM + 10% FBS, puis ensemencer les cellules sur la région vitrée centrale d’un plat bouton en verre de 35 mm.</li>
</ol>3. Coloration AlPcS2a
<ol><li>Pour permettre la fixation des cellules, incuber les cellules à 37 °C dans l’incubateur alimenté avec 5% de CO2 pendant au moins 4 h.</li>
	<li>Diluer AlPcS 2a dans du DMEM complété avec 10% de FBS pour obtenir une solution d’AlPcS2a de 1 μM. Préchauffer le milieu contenant de l’AlPcS2a dans un bain-marie à 37 °C. Remplacez le milieu de culture par le milieu contenant de l’AlPcS2a.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 °C dans l’incubateur alimenté avec 5% de CO2 pendant une nuit (16-18 h).</li>
	<li>Le lendemain, lavez les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer l’AlPcS2a extracellulaire. Remplacer le milieu par un milieu frais, puis incuber à 37 °C pendant 4 h pour permettre au colorant résiduel le long de la voie endocytaire de s’accumuler en lysosomes. NOTE: Pour colorer les endosomes, incuber des cellules dans 1 μM AlPcS2a dans DMEM contenant 10% FBS pendant 15 min à 37 °C. Ensuite, lavez les cellules deux fois avec du PBS et incuberez-les dans un milieu préchauffé avant l’imagerie.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig01.jpg"> Graphique 1. Figure schématique représentant les dommages IV sélectifs avec AlPcS2a. La figure montre les schémas des dommages intraveineux sélectifs. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig02.jpg"> Graphique 2. Coloration lysosomale avec AlPcS2a. Les lysosomes marqués pendant la nuit avec 1 μM AlPcS2a dans les cellules HeLa sont colorés positivement avec un colorant fluorescent vert de 50 nM. Barre d’échelle: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
4. Imagerie des échantillons et éclairage lumineux
REMARQUE: Des dommages IV dans une région sous-cellulaire d’une seule cellule ou de toutes les cellules marquées AlPcS2a dans une boîte de culture peuvent être effectués. L’éclairage en vrac de l’ensemble de la boîte de culture permet une étude quantitative de ces dommages, y compris des études biochimiques.
<ol><li>Manipuler des cellules individuelles en endommageant les lysosomes dans une seule cellule, comme décrit ci-dessous.<ol><li>Placez la capsule de culture sur la scène d’un microscope confocal. Utilisez les lasers 488 nm et 561 nm pour exciter GFP et AlPcS2a, respectivement.</li>
		<li>Encerclez une région d’intérêt (ROI) de 5 x 5 μm2 sur les vésicules marquées AlPcS2a qui sont sélectionnées pour être endommagées.</li>
		<li>Pulse illumine le ROI avec un laser 633 nm de 0,21 mW pour 70 répétitions. Surveiller la formation de Gal3 puncta comme indicateur de perméabilisation de la membrane lysosomale.</li>
	</ol></li>
	<li>Endommagez toutes les cellules marquées dans une boîte de culture comme décrit ci-dessous.<ol><li>Placez le plat de culture sur une plate-forme. Illuminer la parabole avec 660 nm de lumière LED collimatée (la lumière proche infrarouge est une base idéale sur le spectre d’excitation d’AlPcS2a).</li>
		<li>Placer la capsule de culture sur le microscope et surveiller les indicateurs de perméabilisation membranaire comme mentionné à l’étape 4.1.3.</li>
	</ol></li>
	<li>Évaluer les blessures des intraveineuses à l’aide des indicateurs suivants.<ol><li>Le contenu de l’endosome ou du lysosome est le plus fortement glycosylé, qui est exposé au cytosol lors de la rupture IV. Marquez-les rapidement à l’aide de galectines cytosoliques liant le glycane, y compris la galectine-1, la galectine-3, la galectine-8 et la galectine-916,20.</li>
		<li>La taille de la plaie peut être déterminée par la libération d’un colorant imperméable à la membrane comme décrit en21.</li>
		<li>La différence entre les endosomes et les lysosomes réside dans leur pH luminal. La rupture lysosomale perturbe le pH luminal, qui peut être mesuré à l’aide d’un colorant sensible au pH, tel que FITC-dextran3.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63962/63962fig03.jpg"> Graphique 3. Le CALI médié par AlPcS2a induit le recrutement local de TagRFP-galectin-3 (Gal3) dans les lysosomes dans la région d’illumination. Les lysosomes dans les cellules HeLa exprimées en TagRFP-galectine-3 ont été colorés pendant la nuit avec 1 μM AlPcS2a, suivis d’une illumination de focalisation avec une lumière proche infrarouge (633 nm) dans le carré jaune. Le signal AlPcS2a dans le carré jaune est photoblanchi, accompagné de la formation de TagRFP-galectin-3 puncta. Barre d’échelle: 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63962/63962fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

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</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

AlPcS2a se lie à la membrane plasmique, puis est internalisé par endocytose et finit par s’accumuler dans les lysosomes. AlPcS2a peut ainsi être localisé dans les compartiments subcellulaires en ajustant la durée d’incubation. Une limite de cette méthodologie est que seule une sous-population d’IV pourrait être marquée par AlPcS2a par endocytose, car il existe de nombreuses autres sources membranaires d’IV, telles que les appareils ER et Golgi. En outre, le marquage sélectif d’AlPcS2...

Les endosomes, un type de vésicule intracellulaire (IV), sont formés par endocytose et mûrissent ensuite en lysosomes. Diverses voies de signal intracellulaires sont impliquées dans la formation des IV; De plus, différents stimuli intrinsèques et extrinsèques peuvent endommager les IV (p. ex., les agents pathogènes peuvent s’échapper de la membrane limitée pendant l’infection et entrer dans le cytoplasme1). Cela s’accompagne généralement de la rupture des vésicules endocytotiques2. Par conséquent, les techniques de ciblage et d’endommagement des IV peuvent être utilisées dans des études connexes3.
La thérapie photodynamique (PDT) est une thérapie dépendante de la lumière pour lutter contre les maladies en tuant les tumeurs ou les agents pathogènes4. Dans la PDT, les cellules ciblées sont marquées avec des chromophores non toxiques, appelés photosensibilisants, qui peuvent être activés localement par l’éclairage lumineux 5,6. Les photosensibilisateurs absorbent l’énergie de la lumière et se transforment en un état singulet excité, conduisant à l’état triplet excité à longue durée de vie. Les photosensibilisateurs de l’état triplet peuvent subir un transfert d’électrons ou d’énergie et former des espèces réactives de l’oxygène (ROS) en présence d’oxygène, et peuvent détruire spatialement les cellules marquées dans la région d’illumination7. La conséquence varie en fonction de la puissance de la lumière8. En contrôlant la concentration de photosensibilisateurs et l’intensité de l’éclairage lumineux, les biomolécules ciblées peuvent être sélectivement inactivées sans lyse cellulaire, appelée inactivation de la lumière assistée par chromophore (CALI)9. Avec le développement significatif de photosensibilisateurs capables de marquer sélectivement diverses cibles subcellulaires, CALI est devenu un outil précieux pour contrôler l’inactivation médiée par la lumière des biomolécules pour les petites biomolécules telles que les nucléotides et les protéines, ainsi que les organites tels que les mitochondries et les endo-lysosomes 3,10,11,12,13.
Par rapport à CALI, des méthodes chimiques ou physiques sont également utilisées pour altérer les membranes, telles que la toxine bactérienne 14,15 et le traitement Leu-Leu-OMe16 pour les lésions lysosomales. Cependant, ces méthodes présentent une altération massive des IV dans les cellules. Des photosensibilisateurs robustes (c.-à-d. l’acide disulfonique de chlorure de phtalocyanine Al(III) (AlPcS2a)) sont utilisés dans le CALI; AlPcS2a, ciblant les lysosomes par endocytose, est utilisé pour rompre des endosomes ou des lysosomes dans une région contrôlée17. AlPcS2a est un chromophore à base de phtalocyanine imperméable à la membrane cellulaire qui se lie aux lipides sur la membrane plasmique et est internalisé par endocytose et finit par s’accumuler dans le lysosome par la voie endocytaire18. Il absorbe la lumière dans une région spectrale proche infrarouge et génère de l’oxygène singulet, un ROS majeur généré par AlPcS2a18 excité. La désintégration de l’oxygène singulet limite rapidement sa diffusion et sa distance de réaction dans une minuscule région dans les cellules (environ 10-20 nm)19. En ajustant la durée d’incubation d’AlPcS2a et l’éclairage lumineux, le contrôle spatio-temporel des dommages des IV dans une zone subcellulaire est autorisé. CALI devient donc un outil puissant pour examiner les conséquences des dommages intraveineux, ainsi que la formation et la régulation des intraveineuses.
Dans cette étude, un protocole spécifique de CALI utilisant AlPcS2a comme photosensibilisateur est abordé. Ce protocole peut être appliqué à divers types d’intraveineuses, y compris les endosomes et les lysosomes, et utilisé pour examiner les réponses de suivi après la rupture de la membrane. Des cellules HeLa exprimant la galectine-3 conjuguée fluorophore-316,20 révélée après rupture du lysosome sont utilisées pour démontrer ce protocole.

<table><tbody><tr><td><fort>réactif</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Al(III) Chlorure de phtalocyanine Acide disulfonique (AlPcS2a)</td><td>Frontier Scientific</td><td>P40632</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture</td><td>ibidi</td><td>812128-200</td><td></td></tr><tr><td>Milieu</td><td></td><td></td> de culture <td>DMEM complété par 10 % de FBS et 100 U/mL de pénicilline G et 100 mg/mL de streptomycine</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A4736301</td><td></td></tr><tr><td>Gal3-GFP plasmide</td><td>addgene</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000008</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Vert DND-26</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L7526</td><td>vert colorant fluorescent</td></tr><tr><td>Plaque multiparoi</td><td>perkinelmer</td><td>PK-6005550</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Q15895</td><td></td></tr><tr><td>OptiMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td></td></tr><tr><td>Saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco</td><td>21600-069</td><td>137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1,8 mM KH2PO4</td></tr><tr><td>Cell line </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Les</td><td></td><td></td><td>méthodes sont applicables à la plupart des lignées cellulaires attachées. Les conditions doivent être déterminées individuellement.</td></tr><tr><td><fort>Équipements</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.22 & micro ; m Filtre</td><td>Merck</td><td>SLGV013SL</td><td></td></tr><tr><td>Lumière LED Collimatée&nbsp ; (660 nm)</td><td>Thorlabs</td><td>M660L3-C1 et DC2100</td><td>La lumière proche infrarouge est la base idéale sur le spectre d’excitation de l’AlPcS2a.</td></tr><tr><td>Microscopie confocale</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 780</td><td>Un système d’incubation est nécessaire pour l’imagerie à long terme.</td></tr><tr><td>Spectrophotomètres NanoDrop 2000/2000c</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lumière LED rouge</td><td>Tholabs</td><td>M660L4-C1</td><td></td></tr></tbody></table>

une approche photodynamique pour étudier la fonction de rupture des vésicules intracellulaires

A Photodynamic Approach to Study Function of Intracellular Vesicle Rupture

Les vésicules intracellulaires (IV) sont formées par endocytose des vésicules dans le cytoplasme. La formation IV est impliquée dans l’activation de diverses voies de signal par perméabilisation des membranes IV et la formation d’endosomes et de lysosomes. Une méthode appelée inactivation laser assistée par chromophore (CALI) est appliquée pour étudier la formation des IV et les matériaux dans le contrôle de la régulation IV. CALI est une méthodologie photodynamique basée sur l’imagerie pour étudier la voie de signalisation induite par la perméabilisation membranaire. La méthode permet de perméabiliser la manipulation spatio-temporelle de l’organite sélectionné dans une cellule. La méthode CALI a été appliquée pour observer et surveiller des molécules spécifiques par perméabilisation d’endosomes et de lysosomes. La rupture membranaire des IV est connue pour recruter sélectivement des protéines liant les glycanes, telles que la galectine-3. Ici, le protocole décrit l’induction de la rupture IV par AlPcS2a et l’utilisation de la galectine-3 comme marqueur pour marquer les lysosomes altérés, ce qui est utile pour étudier les effets en aval de la rupture de la membrane IV et leurs effets en aval dans diverses situations.

Une figure schématique représentant les dommages intraveineux induits par AlPcS2a, y compris l’endosome et le lysosome, a été montrée (Figure 1).
Des marqueurs disponibles dans le commerce peuvent être utilisés pour déterminer les conditions de coloration AlPcS2a . Par exemple, AlPcS 2apuncta et colorant fluorescent vert22 colocalisation (Figure 2).
L...

L’inactivation laser assistée par chromophore (CALI) médiée par AlPcS2a est un outil puissant pour étudier les dommages spatio-temporels des vésicules intracellulaires (IV) dans les cellules vivantes.

Une approche photodynamique pour étudier la fonction de rupture des vésicules intracellulaires

Intracellular vesicles (IVs) are formed through endocytosis of vesicles into cytoplasm. IV formation is involved in activating various signal pathways ...

L’endocytose de la vésicule en cytoplasie entraîne la formation de vésicules intracellulaires. La perméabilisation de la vésicule active diverses voies de signal. L’inactivation laser assistée par chromophore est utilisée pour étudier les conséquences de la rupture des vésicules intracellulaires.Un contrôle spatial et temporel des dommages subcellulaires aux vésicules intracellulaires peut être obtenu en ajustant la condition debout et l’éclairage lumineux. Pour commencer, maintenez la culture cellulaire HeLa dans DMEM supplémentée avec 10% FBS. Après avoir lavé les cellules avec PBS, trypsiniser les cellules.Ensuite, remettez en suspension les cellules dans DMEM complétées par 10% FBS. Diluer 300 nanogrammes de plasmide Gal3-GFP dans 25 microlitres de milieu sérique réduit. Ajoutez ensuite 0,6 microlitre de réactif P3000.Et mélanger doucement, puis vortex la solution. Diluer 0,45 microlitre de réactif Lipofectamine 3000 dans 25 microlitres de milieu sérique réduit et mélanger doucement. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante.Ensuite, mélanger l’ADN dilué et la lipofectamine 3000 diluée et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir mélangé le mélange d’ADN lipofectamine, 300 000 cellules HeLa en suspension et 200 microlitres de DMEM avec 10% FBS, ensemencez les cellules sur la région vitrée centrale d’un plat de bouton en verre de 35 millimètres. Pour permettre la fixation des cellules, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’incubateur alimenté avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins quatre heures.Diluer AlPcS2a dans du DMEM complété avec 10% FBS pour obtenir une solution d’AlPcS2a à une micromolaire. Préchauffer le milieu contenant AlPcS2a dans un bain-marie de 37 degrés Celsius et remplacer le milieu de culture par le milieu contenant AlPcS2a. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’incubateur alimenté avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit.Le lendemain, laver les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer l’AlPcS2a extracellulaire après avoir remplacé le milieu par un milieu frais. Incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures pour permettre au colorant résiduel le long de la voie endocytaire de s’accumuler dans les lysosomes. Pour manipuler des cellules individuelles en endommageant les lysosomes, placez la boîte de culture sur la scène d’un microscope confocal.Utilisez les lasers 488 nanomètres et 561 nanomètres pour exciter GFP et AlPcS2a, respectivement. Encerclez une région carrée d’intérêt de cinq micromètres sur cinq sur les vésicules marquées AlPcS2a qui sont sélectionnées pour être endommagées. Ensuite, les impulsions éclairent la région d’intérêt avec un laser de 633 nanomètres de 0,21 milliwatt, soit 70 répétitions.Surveiller la formation de Gal3 puncta comme indicateur de perméabilisation de la membrane lysosomale. La coloration lysosomale avec AlPcS2a dans les cellules HeLa a été réalisée à l’aide de marqueurs disponibles dans le commerce et a été colorée positivement avec un colorant fluorescent vert. Les lysosomes dans les cellules HeLa exprimées par TagRFP-Galectine3 ont été colorés avec AlPcS2a.Suivi d’une illumination focalisée avec de la lumière proche infrarouge, les résultats indiquent que l’inactivation laser assistée par chromophore à base d’AlPcS2a a été capable de contrôler la rupture lysosomale locale dans la région d’intérêt, laissant le reste des lysosomes intacts. Cette étape est importante car le temps d’incubation déterminera les endosomes debout ou les lysosomes. Par exemple, les gens peuvent déterminer la taille de par la libération de colorant imperméable à la membrane.Peut également utiliser des colorants sensibles au pH tels que le dextran FITC pour différencier les endosomes et les lysosomes. Cette technique est utile pour commencer les effets en aval de la rupture de la membrane des vésicules intracellulaires. Et il y a des effets en aval dans diverses situations.

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