Une approche photodynamique pour étudier la fonction de rupture des vésicules intracellulaires
17 mars 2023
L’inactivation laser assistée par chromophore (CALI) médiée par AlPcS2a est un outil puissant pour étudier les dommages spatio-temporels des vésicules intracellulaires (IV) dans les cellules vivantes.
L’endocytose de la vésicule en cytoplasie entraîne la formation de vésicules intracellulaires. La perméabilisation de la vésicule active diverses voies de signal. L’inactivation laser assistée par chromophore est utilisée pour étudier les conséquences de la rupture des vésicules intracellulaires.
Un contrôle spatial et temporel des dommages subcellulaires aux vésicules intracellulaires peut être obtenu en ajustant la condition debout et l’éclairage lumineux. Pour commencer, maintenez la culture cellulaire HeLa dans DMEM supplémentée avec 10% FBS. Après avoir lavé les cellules avec PBS, trypsiniser les cellules.
Ensuite, remettez en suspension les cellules dans DMEM complétées par 10% FBS. Diluer 300 nanogrammes de plasmide Gal3-GFP dans 25 microlitres de milieu sérique réduit. Ajoutez ensuite 0,6 microlitre de réactif P3000.
Et mélanger doucement, puis vortex la solution. Diluer 0,45 microlitre de réactif Lipofectamine 3000 dans 25 microlitres de milieu sérique réduit et mélanger doucement. Incuber pendant cinq minutes à température ambiante.
Ensuite, mélanger l’ADN dilué et la lipofectamine 3000 diluée et incuber pendant 10 minutes à température ambiante. Après avoir mélangé le mélange d’ADN lipofectamine, 300 000 cellules HeLa en suspension et 200 microlitres de DMEM avec 10% FBS, ensemencez les cellules sur la région vitrée centrale d’un plat de bouton en verre de 35 millimètres. Pour permettre la fixation des cellules, incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’incubateur alimenté avec 5% de dioxyde de carbone pendant au moins quatre heures.
Diluer AlPcS2a dans du DMEM complété avec 10% FBS pour obtenir une solution d’AlPcS2a à une micromolaire. Préchauffer le milieu contenant AlPcS2a dans un bain-marie de 37 degrés Celsius et remplacer le milieu de culture par le milieu contenant AlPcS2a. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius dans l’incubateur alimenté avec 5% de dioxyde de carbone pendant la nuit.
Le lendemain, laver les cellules deux fois avec du PBS pour éliminer l’AlPcS2a extracellulaire après avoir remplacé le milieu par un milieu frais. Incuber à 37 degrés Celsius pendant quatre heures pour permettre au colorant résiduel le long de la voie endocytaire de s’accumuler dans les lysosomes. Pour manipuler des cellules individuelles en endommageant les lysosomes, placez la boîte de culture sur la scène d’un microscope confocal.
Utilisez les lasers 488 nanomètres et 561 nanomètres pour exciter GFP et AlPcS2a, respectivement. Encerclez une région carrée d’intérêt de cinq micromètres sur cinq sur les vésicules marquées AlPcS2a qui sont sélectionnées pour être endommagées. Ensuite, les impulsions éclairent la région d’intérêt avec un laser de 633 nanomètres de 0,21 milliwatt, soit 70 répétitions.
Surveiller la formation de Gal3 puncta comme indicateur de perméabilisation de la membrane lysosomale. La coloration lysosomale avec AlPcS2a dans les cellules HeLa a été réalisée à l’aide de marqueurs disponibles dans le commerce et a été colorée positivement avec un colorant fluorescent vert. Les lysosomes dans les cellules HeLa exprimées par TagRFP-Galectine3 ont été colorés avec AlPcS2a.
Suivi d’une illumination focalisée avec de la lumière proche infrarouge, les résultats indiquent que l’inactivation laser assistée par chromophore à base d’AlPcS2a a été capable de contrôler la rupture lysosomale locale dans la région d’intérêt, laissant le reste des lysosomes intacts. Cette étape est importante car le temps d’incubation déterminera les endosomes debout ou les lysosomes. Par exemple, les gens peuvent déterminer la taille de par la libération de colorant imperméable à la membrane.
Peut également utiliser des colorants sensibles au pH tels que le dextran FITC pour différencier les endosomes et les lysosomes. Cette technique est utile pour commencer les effets en aval de la rupture de la membrane des vésicules intracellulaires. Et il y a des effets en aval dans diverses situations.
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Aperçu
L'inactivation assistée par laser assistée par chromophore (CALI) médiée par l'AlPcS 2a est utilisée pour étudier les dommages spatiotemporels des vésicules intracellulaires dans des cellules vivantes. Cette technique permet un contrôle précis des lésions au niveau subcellulaire, offrant des informations sur les conséquences de la rupture des vésicules.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cellulaire
- Neurosciences
- Imagerie de cellules vivantes
Contexte
- L'endocytose conduit à la formation de vésicules intracellulaires.
- La perméabilisation des vésicules active diverses voies de signalisation.
- La CALI est une méthode permettant d'étudier les effets de la rupture des vésicules.
- Un contrôle spatial et temporel est obtenu par illumination lumineuse.
Objectif de l'étude
- Étudier la dynamique des dommages aux vésicules intracellulaires.
- Comprendre les voies de signalisation activées par la rupture des vésicules.
- Affiner les techniques d'étude des interactions cellulaires vivantes.
Méthodes utilisées
- Culture de cellules HeLa dans du DMEM contenant 10 % de SFB.
- Lavage des cellules avec du PBS avant l'expérimentation.
- Tripсинisation des cellules pour analyse.
- Application de la CALI pour induire des lésions localisées.
Résultats principaux
- Démontré un contrôle efficace des dommages aux vésicules.
- Identifié les voies de signalisation clés activées après la rupture.
- Validé l'utilisation de la CALI dans des études sur cellules vivantes.
- Fourni des aperçus sur les mécanismes de fonctionnement des vésicules.
Conclusions
- CALI est un outil précieux pour l'étude de la dynamique intracellulaire.
- Les résultats améliorent la compréhension des voies de signalisation liées aux vésicules.
- Les études futures pourront s'appuyer sur ces méthodes afin d'obtenir des connaissances plus approfondies.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
L'inactivation assistée par chromophore au laser (CALI) permet une induction précise et spatiotemporelle de la rupture des vésicules intracellulaires, offrant un système contrôlé pour analyser les événements de perméabilisation membranaire. Cette approche facilite la détection mécanistique des risques et la validation des cibles en permettant une manipulation et une surveillance sélectives de l'intégrité des endosomes et des lysosomes dans des cellules vivantes. La méthode améliore la fiabilité prédictive en phase de découverte précoce en reliant la rupture des vésicules aux voies de signalisation en aval et au recrutement moléculaire.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'interrogation directe de l'intégrité de la membrane des vésicules et de son rôle dans les voies de signalisation.
- Permet la validation fonctionnelle du recrutement de protéines liant les glycanes, comme la galectine-3, suite à la rupture des vésicules.
- Facilite la réduction des risques mécanistiques en isolant les effets de la perméabilisation ciblée des organites.
Développement de criblages et de tests
- Offre une plateforme pour développer des tests quantitatifs basés sur l'imagerie afin de surveiller la rupture des vésicules et le recrutement moléculaire.
- Permet la standardisation des tests grâce à une induction contrôlée et localisée de la perméabilisation membranaire.
- Permet une évaluation reproductible des effets des composés sur la stabilité endosomale et lysosomale.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur des modèles pertinents pour la maladie où l'intégrité des vésicules influence la signalisation cellulaire et la pathologie.
- Permet une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en facilitant l'étude des effets en aval de la rupture des vésicules.
- Facilite les décisions d'avancement ajustées au risque en fournissant un éclairage mécanistique sur les réponses cellulaires.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Cette approche photodynamique s'intègre à la continuité découverte-préclinique en permettant la manipulation et la détection fondées sur des hypothèses d'événements de rupture de vésicules.
- Biologie de la découverte : Permet de tester des hypothèses sur le rôle de la perméabilisation des vésicules dans la signalisation et le recrutement des protéines.
- Criblage : Fournit des résultats d'imagerie quantitatifs et reproductibles pour le développement de tests et l'évaluation de composés.
- Analytique : Offre des paramètres mesurables tels que la formation de points de galectine-3 et la libération de colorant pour des analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Relie les découvertes mécanistiques à des modèles cellulaires pertinents pour les maladies dans lesquels la rupture des vésicules est impliquée.
- Réutilisation en entreprise : Propose une plateforme modulaire et réutilisable pour l'étude de la dynamique membranaire dans divers types cellulaires et conditions.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans les études sur la signalisation liée aux vésicules.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'induction et la mesure de la rupture vésiculaire afin d'obtenir des résultats reproductibles.
- Valeur stratégique : Éclaire les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin en précisant les conséquences fonctionnelles de la perméabilisation membranaire.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des cibles et des voies influencées par l'intégrité vésiculaire.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en imagerie de cellules vivantes et en manipulation photodynamique.
- Requiert un accès à une infrastructure de microscopie confocale et d'éclairage laser.
- Exige une standardisation interéquipes des protocoles d'imagerie et d'analyse.
- Adaptable à diverses lignées cellulaires et marqueurs d'organites, avec des contrôles appropriés.
- Dépend d'un calibrage précis des paramètres laser et des concentrations de colorant pour assurer la reproductibilité.
Foire aux questions en biopharmacie
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Transfection and AlPcS2a Staining
3:00
Sample Imaging and Light Illumination
3:47
Results: AlPcS2a-Mediated Chromophore‐Assisted Laser Inactivation for Studying patiotemporal Damage of Intracellular Vesicles in Live Cells
4:25
Conclusion
