Name: Dépistage génétique pour l’identification des suppresseurs multicopies chez Schizosaccharomyces pombe (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 22 s
Description: Découvrez le criblage de suppresseurs multicopies chez Schizosaccharomyces pombe pour identifier des interactions génétiques avec le mutant ell1. Cette méthode révèle des mécanismes conservés et des cibles thérapeutiques potentielles.

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Ce travail a été financé par une subvention de recherche du Département de biotechnologie du gouvernement de l’Inde (Grant No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) à Nimisha Sharma. Les auteurs remercient le professeur Charles Hoffman (Boston College, États-Unis) pour le don de la bibliothèque d’ADNc de S. pombe et le professeur Susan Forsburg pour les plasmides de levure.

1. Transformation de la bibliothèque d’ADNc en la souche mutante de S. pombe pour dépister les suppresseurs multicopies
NOTE: La méthode standard de l’acétatede lithium 27 a été suivie pour transformer la bibliothèque d’ADNc de S. pombe en la souche S. pombe ell1Δ avec quelques modifications:
<ol><li>Cultiver la souche S. pombe ell1 Δà 32 °C sur une plaque de milieu YE (tableau 1) additionnée de 225 μg/mL d’adénine, de leucine et d’uracile. Inoculer une boucle pleine d’inoculum de la souche ell1Δ de la plaque ci-dessus dans 15-20 mL de milieu YE complété par 225 μg/mL d’adénine, de leucine et d’uracile. Incuber pendant une nuit à 32 °C en secouant (200-250 tr/min).</li>
	<li>Le lendemain, diluer la culture de nuit dans 100 mL de milieu YE frais avec les suppléments désirés à une DO 600 nm (densité optique à 600 nm) de 0,3 et l’incuber à 32 °C en agitant à 200-250 tr/min jusqu’à ce que la DO600 nm atteigne la phase logarithmique moyenne.</li>
	<li>Répartir la culture de 100 mL en deux tubes à centrifuger de 50 mL, puis la centrifuger à température ambiante pendant 10 min à 4 000 × g.</li>
	<li>Jeter le surnageant et laver la pastille cellulaire avec 1 mL d’eau stérile, c’est-à-dire remettre les cellules en suspension dans 1 mL d’eau stérile et centrifuger à 4 000 × g pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Jeter le surnageant et laver chaque pastille de cellule avec 1 mL de 1x solution de LiAc-TE (100 mM d’acétate de lithium, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA, pH 7,5) comme décrit à l’étape 1.4.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 250 μL de 1x LiAc-TE. Utilisez ces cellules compétentes de S. pombe (500 μL) pour la transformation avec l’ADN d’intérêt. Transférer 125 μL des cellules compétentes dans quatre tubes de microcentrifugation stériles différents pour les étapes de transformation ultérieures.</li>
	<li>Faire bouillir l’ADN porteur des testicules de saumon ou du sperme de hareng pendant 1 min et le placer immédiatement sur la glace. Pour chaque transformation, ajouter 10 μL d’ADN porteur simple brin dénaturé à 10 mg/mL dans le tube de microcentrifugation contenant 125 μL des cellules compétentes, puis mélanger doucement à l’aide d’une pointe de micropipette. Par la suite, ajouter 50 μg de la banque d’ADNc de S. pombe au tube de microcentrifugation contenant un mélange d’ADN porteur de cellules compétent.</li>
	<li>Incuber les tubes microcentrifugés à température ambiante pendant 10 min, puis ajouter 260 μL de solution de polyéthylèneglycol-acétate de lithium (40 % [p/v] PEG 4 000, acétate de lithium 100 mM, 10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7,5) dans les tubes et mélanger doucement à l’aide d’un embout de micropipette.</li>
	<li>Incuber les tubes de microcentrifugation contenant le mélange de transformation à 32 °C pendant 2 h sans agiter. Ajouter 43 μL de diméthylsulfoxyde (DMSO) préchauffé dans le tube de microcentrifugation et mélanger délicatement. Par la suite, exposer les tubes à un choc thermique à 42 °C pendant 5 min.</li>
	<li>Enduire les cellules à 4 000 × g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant et retirez la solution résiduelle de PEG-LiAc-TE à l’aide d’un embout de micropipette.</li>
	<li>Remettez les cellules en suspension dans 100 μL d’eau stérile et sur une plaque EMM2 (tableau 1) (150 mm) avec les suppléments requis et 0,2 μg/mL de 4-NQO.</li>
	<li>Incuber les plaques à 32 °C pendant 5-6 jours pour permettre aux colonies d’apparaître sur les plaques. Strender les colonies obtenues sur la même plaque moyenne en présence de 0,2 μg/mL de 4-NQO et utiliser pour un criblage plus poussé.</li>
	<li>Pour une expérience de transformation de bibliothèque, utiliser 500 μL de cellules compétentes (125 μL de cellules compétentes x 4 tubes de microcentrifugeuse) pour la transformation décrite aux étapes 1.8 à 1.14 ci-dessus.</li>
	<li>Comme témoin, plaquer 1/10edu mélange de transformation sur une plaque EMM2 (150 mm) avec les suppléments requis, mais sans 4-NQO, pour calculer le nombre total de clones de bibliothèque obtenus après transformation de la bibliothèque et filtrer l’isolement des clones suppresseurs.</li>
</ol>2. Tester et valider le sauvetage/suppression du phénotype associé à la souche mutante de requête par le suppresseur putatif
NOTE: Des tests ponctuels de stress ont été effectués comme décrit ci-dessous pour tester et valider le sauvetage/suppression de la sensibilité au stress 4-NQO associée à la délétion ell1 par le(s) suppresseur(s) putatif(s).
<ol><li>Ajouter 100-200 μL d’eau stérile dans chacun des différents puits d’une plaque de microtitrage stérile de 96 puits.</li>
	<li>Prélever une petite quantité d’inoculum dans chacune des différentes colonies obtenues après transformation de la bibliothèque d’ADNc sur la plaque contenant du 4-NQO à l’aide d’un cure-dent stérile ou d’un embout de micropipette de 20 à 200 μL. Ajouter l’inoculum de chacune des différentes colonies dans des puits indépendants séparés de la plaque de microtitrage contenant 100-200 μL d’eau stérile. Mélanger.</li>
	<li>Repérez 3 μL de la suspension cellulaire de chaque puits sur des plaques de gélose EMM2 contenant de l’adénine (225 μg/mL) et de l’uracile (225 μg/mL) mais dépourvues de leucine (le marqueur auxotrophe sélectionnable présent sur le vecteur plasmidique utilisé pour la construction de la bibliothèque utilisée dans ce travail). Ajouter les concentrations appropriées de 4-NQO aux plaques, au besoin.</li>
	<li>Incuber les plaques à 32 °C pendant 3-4 jours pour permettre aux cellules de se développer. Identifier les colonies qui montrent une croissance en présence de différentes concentrations de 4-NQO comme suppresseurs putatifs.</li>
	<li>Pour valider davantage les suppresseurs, cultiver les suppresseurs sélectionnés avec les souches témoins appropriées pendant une nuit à 32 °C avec agitation (200-250 tr/min) dans un milieu EMM2 contenant 225 μg/mL chacun d’adénine et d’uracile mais dépourvus de leucine.</li>
	<li>Le lendemain, diluer les cellules à une DO 600 nm de 0,3 dans un milieu EMM2 frais et les faire croître à 32 °C en agitant jusqu’à la phase logarithmique (environ600 nm OD de 0,6-0,8).</li>
	<li>Repérer les dilutions en série appropriées (1:10 ou 1:5) des cultures sur des plaques EMM2 avec les suppléments requis contenant 0,4 μM de 4-NQO ou 0,01 % de MMS. Pour le contrôle, repérez les souches sur une plaque EMM2 avec les suppléments nécessaires, mais dépourvue de tout agent endommageant l’ADN.</li>
	<li>Incuber les plaques à 32 °C pendant 3 à 5 jours pour surveiller la croissance. NOTE: Des tests appropriés basés sur le phénotype associé à la souche mutante de requête doivent être utilisés pour tester le sauvetage ou la suppression du phénotype. Par exemple, si les suppresseurs d’un phénotype sensible au froid d’une souche mutante de requête doivent être identifiés, le test pour tester et valider les clones suppresseurs impliquerait la croissance de transformants à basse température.</li>
	<li>Repérez les souches mutantes transformées avec un gène d’intérêt complet (Spell1 dans ce cas) ou un vecteur vide en tant que témoins positifs et négatifs, respectivement, avec les transformants de la bibliothèque.</li>
</ol>3. Isolement du plasmide à partir des clones suppresseurs de S. pombe 
NOTE: L’isolement plasmidique de S. pombe a été effectué en suivant le protocole décrit dans Fission yeast: a laboratory manual28 avec quelques modifications.
<ol><li>Inoculer une seule colonie de levure dans un milieu EMM2 contenant 225 μg/mL d’adénine et d’uracile et faire croître les cellules pendant une nuit à 32 °C avec agitation à 200-250 rpm. Le lendemain, prélever 5 cellules O.D. (c.-à-d. 10 mL de culture O.D. 0,5) par centrifugation pendant 2 min à 4 000 × g à température ambiante.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 0,2 mL de tampon de lyse (2 % Triton X-100, 1 % SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris HCl (pH 8,0) et 1 mM Na2EDTA).</li>
	<li>Ajouter 0,2 mL de phénol:chloroforme:alcool isoamylique (25:24:1) et 0,3 g de billes de verre lavées à l’acide dans le tube de microcentrifugeuse. Faire tourbillonner le tube de la microcentrifugeuse pendant 2 min à 4 °C et incuber sur la glace pendant 1 min. Répétez cette étape 6x.</li>
	<li>Centrifuger le tube à 10 000 × g pendant 15 min à température ambiante. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube microcentrifuge frais et ajouter 200 μL d’alcool phénol:chloroforme:isoamylique (25:24:1).</li>
	<li>Centrifuger le tube à 10 000 × g pendant 10 min. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube frais et ajouter deux volumes d’éthanol à 100 % (~400 μL) et 1/10 de volume d’acétate de sodium (3 M, pH 5,8) (~20 μL) dans le tube. Incuber le tube de microcentrifugation à -70 °C pendant 1 h.</li>
	<li>Précipiter l’ADN par centrifugation à 10 000 × g pendant 15 min à 4 °C et éliminer le surnageant. Lavez la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 70 % (~500 μL) et maintenez-la à température ambiante pour la sécher à l’air.</li>
	<li>Remettez l’ADN en suspension dans 20 μL d’eau stérile. Utilisez 2-5 μL d’ADN plasmidique pour la transformation des cellules E. coli compétentes. REMARQUE: Le plasmide peut également être isolé à partir de cellules de levure à l’aide de l’un des kits d’isolation plasmidique de levure disponibles dans le commerce.</li>
</ol>4. Identification du gène codé par le clone suppresseur
<ol><li>Transformer les plasmides de levure isolés en souche E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] en utilisant le protocole standard29 et étaler les cellules sur des plaques LB (Luria Broth) avec les antibiotiques nécessaires.</li>
	<li>Isoler le(s) plasmide(s) des transformateurs E. coli en utilisant le protocole de lyse alcalinestandard 29 et suivre les combinaisons appropriées d’enzymes de restriction pour vérifier la libération du fragment d’ADN inséré par digestion de restriction. REMARQUE: Le plasmide suppresseur 84 a été digéré avec l’enzyme de restriction Bam HI, et le plasmide suppresseur 104 a été digéré avec les enzymes de restriction PstI / BamHI.</li>
	<li>Retransformer les plasmides présentant une libération d’insert après digestion de restriction dans la souche ell1 Δ pour vérifier leur capacité à sauver le phénotype génotoxique sensible au stress de la souche ell1Δ. </li>
	<li>Sélectionner les clones plasmidiques montrant la suppression de la sensibilité au stress génotoxique et séquencer le fragment d’ADN inséré présent dans ces clones plasmidiques à l’aide d’amorces directes et inverses spécifiques au vecteur. NOTE: Dans cette étude, l’amorce avant universelle spécifique au promoteur adh1 (5'CATTGGTCTTCCGCTCCG 3') a été utilisée30.</li>
	<li>Pour identifier le gène responsable de la suppression, aligner la séquence obtenue à l’aide de l’explosion nucléotidique NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) ou de l’outil d’alignement de séquence Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Sélectionnez la séquence montrant l’alignement maximal et identifiez-la comme le gène du plasmide suppresseur de multicopie.</li>
</ol>

<ol><li>Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mystery+of+missing+heritability%3A+Genetic+interactions+create+phantom+heritability%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).</li>
<li>Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -L. V., Kruglyak, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+the+sources+of+missing+heritability+in+a+yeast+cross%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Finding the sources of missing heritability in a yeast cross.</a> Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).</li>
<li>Bloom, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+interactions+contribute+less+than+additive+effects+to+quantitative+trait+variation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast.</a> Nature Communications. 6 (1), 8712(2015).</li>
<li>Tong, A. H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+mapping+of+the+yeast+genetic+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Global mapping of the yeast genetic interaction network.</a> Science. 303 (5659), New York, N.Y. 808-813 (2004).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetic+landscape+of+a+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The genetic landscape of a cell.</a> Science. 327 (5964), New York, N.Y. 425-431 (2010).</li>
<li>Costanzo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+genetic+interaction+network+maps+a+wiring+diagram+of+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function.</a> Science. 353 (6306), New York, N.Y. (2016).</li>
<li>Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Requirement+for+three+novel+protein+complexes+in+the+absence+of+the+Sgs1+DNA+helicase+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).</li>
<li>Kaplan, Y., Kupiec, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+role+for+the+yeast+cell+cycle%2Fsplicing+factor+Cdc40+in+the+G1%2FS+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition.</a> Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).</li>
<li>Carlsson, M., Hu, G. -Z., Ronne, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+dosage+effects+in+yeast+support+broader+roles+for+the+LOG1%2C+HAM1+and+DUT1+genes+in+detoxification+of+nucleotide+analogues%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+One%22%5BJournal%5D)">Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues.</a> PLOS One. 13 (5), 0196840(2018).</li>
<li>Sopko, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+pathways+and+phenotypes+by+systematic+gene+overexpression%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression.</a> Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).</li>
<li>Duffy, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overexpression+screens+identify+conserved+dosage+chromosome+instability+genes+in+yeast+and+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).</li>
<li>Appling, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+approaches+to+the+study+of+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+%28San+Diego%2C+Calif%29%22%5BJournal%5D)">Genetic approaches to the study of protein-protein interactions.</a> Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+art+and+design+of+genetic+screens%3A+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">The art and design of genetic screens: yeast.</a> Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).</li>
<li>Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Marker-fusion+PCR+for+one-step+mutagenesis+of+essential+genes+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast+%28Chichester%2C+England%29%22%5BJournal%5D)">Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast.</a> Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).</li>
<li>Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+genetic+interactions+and+networks+with+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Exploring genetic interactions and networks with yeast.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).</li>
<li>Prelich, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+mechanisms%3A+themes+from+variations%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Suppression mechanisms: themes from variations.</a> Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppressors+for+novel+antibacterial+compounds+reveal+targets+and+drug+efflux+susceptibility%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+%26+Biology%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility.</a> Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).</li>
<li>Apfel, C. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peptide+deformylase+as+an+antibacterial+drug+target%3A+Target+validation+and+resistance+development%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).</li>
<li>Tsukahara, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Medicinal+genetics+approach+towards+identifying+the+molecular+target+of+a+novel+inhibitor+of+fungal+cell+wall+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly.</a> Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).</li>
<li>Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+multidrug+efflux+transporter+gene+of+the+major+facilitator+superfamily+from+Candida+albicans+%28FLU1%29+conferring+resistance+to+fluconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole.</a> Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).</li>
<li>Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+genes+mediating+resistance+to+inhibitors+of+nucleoside+and+ergosterol+metabolism+in+leishmania+by+overexpression%2Fselection%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection.</a> Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).</li>
<li>Nodake, Y., Yamasaki, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Some+properties+of+a+macromolecular+conjugate+of+lysozyme+prepared+by+modification+with+a+monomethoxypolyethylene+glycol+derivative%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience%2C+Biotechnology%2C+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative.</a> Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).</li>
<li>Sunnerhagen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospects+for+functional+genomics+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe.</a> Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).</li>
<li>Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancient+yeast+for+young+geneticists%3A+A+primer+on+the+Schizosaccharomyces+pombe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system.</a> Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).</li>
<li>Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+RNA+polymerase+II-mediated+transcriptional+elongation%3A+Implications+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease.</a> IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).</li>
<li>Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amino-terminal+domain+of+ELL+transcription+elongation+factor+is+essential+for+ELL+function+in+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe.</a> Microbiology. 163 (11), Reading, England. 1641-1653 (2017).</li>
<li>Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Schizosaccharomyces+pombe%3A+Lithium+acetate%2Fdimethyl+sulfoxide+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969(2016).</li>
<li>Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagan%2C+I+%22Fission+yeast%3A+a+laboratory+manual%22">Fission yeast: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli+using+calcium+chloride%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932(2006).</li>
<li>Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulators+of+the+Schizosaccharomyces+pombefbp1+gene+include+two+redundant+Tup1p-like+corepressors+and+the+CCAAT+binding+factor+activation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex.</a> Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+plasmid+DNA+by+alkaline+lysis+with+SDS%3A+Maxipreparation%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation.</a> CSH Protocols. 2006 (1), 4090(2006).</li>
<li>Choi, E., Lee, K., Song, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+rax2p+in+the+polarized+growth+of+fission+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules+and+Cells%22%5BJournal%5D)">Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast.</a> Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).</li>
<li>Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osh6+revisited%3A+Control+of+PS+transport+by+the+concerted+actions+of+PI4P+and+Sac1+phosphatase%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601(2021).</li>
<li>Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+as+a+model+organism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Yeast as a model organism.</a> Science. 277 (5330), New York, N.Y. 1259-1260 (1997).</li>
<li>Forsburg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeasts+Saccharomyces+cerevisiae+and+Schizosaccharomyces+pombe%3A+models+for+cell+biology+research%5BTitle%5D)+AND+%22Gravitational+and+Space+Biology+Bulletin%3A+Publication+of+the+American+Society+for+Gravitational+and+Space+Biology%22%5BJournal%5D)">The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research.</a> Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).</li>
<li>Botstein, D., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast%3A+an+experimental+organism+for+21st+Century+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast: an experimental organism for 21st Century biology.</a> Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).</li>
<li>Jones, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+systematic+library+for+comprehensive+overexpression+screens+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).</li>
<li>Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multicopy+suppressor+gene+of+the+Saccharomyces+cerevisiae+G1+cell+cycle+mutant+gene+dbf4+encodes+a+protein+kinase+and+is+identified+as+CDC5%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5.</a> Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).</li>
<li>Melnykov, A. V., Elson, E. L. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMelnykov%2C+AV+%22MCH4+is+a+multicopy+suppressor+of+glycine+toxicity+in+Saccharomyces+cerevisiae%22">MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae</a>. , 653444(2019).</li>
<li>Kosodo, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppressors+of+the+sly1+temperature-sensitive+mutation+in+the+ER-Golgi+vesicular+transport+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).</li>
<li>Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppression+of+oxidant-sensitive+eos1+mutation+by+IZH2+in+Saccharomyces+cerevisiae+and+the+involvement+of+Eos1+in+zinc+homeostasis%3A+Eos1+involvement+in+zinc+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis.</a> FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).</li>
<li>Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicopy+suppression+screening+of+Saccharomyces+cerevisiae+identifies+the+ubiquitination+machinery+as+a+main+target+for+improving+growth+at+low+temperatures%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures.</a> Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).</li>
<li>Sweta, K., Sharma, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+interaction+between+ELL+transcription+elongation+factor+and+Epe1+reveals+the+role+of+Epe1+in+the+regulation+of+transcription+outside+heterochromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin.</a> Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).</li>
<li>Kim, D. -U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+a+genome-wide+set+of+gene+deletions+in+the+fission+yeast+Schizosaccharomyces+pombe%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe.</a> Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).</li>
<li>Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genetic+interaction+screens+in+the+age+of+CRISPR%2FCas%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Genetics%22%5BJournal%5D)">Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas.</a> Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Les levures ont été largement utilisées pour étudier les processus biologiques de base et les voies qui sont conservées au cours de l’évolution dans les organismes eucaryotes. La disponibilité d’outils génétiques et génomiques ainsi que leur aptitude à diverses procédures biochimiques, génétiques et moléculaires font des levures un excellent organisme modèle pour la recherche génétique34,35,36. Au fil des ans, divers criblages g...

Les réseaux d’interactions génétiques fournissent des informations fonctionnelles sur les gènes et délimitent les voies et les processus biologiques dans lesquels ces gènes peuvent être impliqués in vivo. En outre, ils peuvent également fournir des informations sur la façon dont différents gènes interagissent les uns avec les autres, ce qui donne un phénotype spécifique 1,2,3. Au fil des ans, divers criblages génétiques ont été conçus par les chercheurs pour répondre à des questions biologiques fondamentales et étudier les maladies humaines. Les cribles pour l’identification des interactions génétiques peuvent être effectués de plusieurs façons. Les interactions génétiques identifiées dans différents criblages génétiques peuvent représenter des relations mécanistes distinctes entre les gènes. De plus, des études ont révélé qu’un ensemble commun d’interactions génétiques est partagé par des gènes qui codent pour des protéines appartenant à la même voie ou complexe 4,5. Ainsi, les réseaux d’interaction génétique peuvent être utilisés pour établir l’organisation fonctionnelle dans une cellule, dans laquelle les gènes partageant les profils les plus similaires appartiennent au même complexe ou voie, les gènes partageant des profils un peu moins similaires appartiennent au même processus biologique, et les gènes présentant des profils qui se chevauchent mais plus divers reflètent des membres appartenant au même compartiment cellulaire6.
Les tests d’interaction génétique basés sur la suppression de la dose (« suppression à haute copie ou à plusieurs copies ») sont l’une des approches couramment utilisées. Ces criblages peuvent être effectués en transformant une souche mutante de requête avec une bibliothèque génomique ou d’ADNc à nombre élevé de copies, suivie de tests / techniques de sélection appropriés pour identifier la suppression ou l’amélioration des interactions génétiques 7,8,9. Pour assurer une couverture complète à l’échelle du génome, ces criblages ont également été effectués en surexprimant un gène spécifique d’intérêt dans une collection de mutants de perte de fonction à l’échelle du génome ou en surexprimant une bibliothèque génomique ou d’ADNc codée par un plasmide à nombre élevé dans une requête mutante de perte de fonction 9,10,11,12,13,14,15 . La stratégie multicopie pourrait également fonctionner en utilisant une approche dominante/surexpression utilisant un promoteur régulatable.
Les principaux avantages de l’utilisation de criblages à base de suppresseurs sont que la suppression d’un phénotype préexistant dans une souche mutante par un autre gène établit une relation génétique entre ces deux produits géniques qui n’a peut-être pas été démontrée par d’autres approches. Deuxièmement, il a été observé que la présence d’une mutation préexistante sensibilise une voie particulière, ce qui permet d’identifier des composants supplémentaires de cette voie par l’isolement de suppresseurs, qui n’ont peut-être pas été identifiés par des sélections génétiques plus directes. De plus, cet écran peut être utilisé pour identifier les suppresseurs qui ont différents mécanismes de suppression16. Les interactions suppressives se produisent généralement entre des gènes qui sont fonctionnellement liés et peuvent être utilisées pour élucider les hiérarchies dans les voies. Le mécanisme sous-jacent exact de suppression peut différer en fonction de plusieurs facteurs, notamment le type de mutant de requête utilisé dans le criblage, les conditions expérimentales et le niveau d’expression des gènes. L’un des mécanismes courants de suppression du dosage implique des gènes codant pour des produits qui fonctionnent ensemble dans le même complexe ou en parallèle dans le même processus cellulaire / biologique. Les résultats de tels criblages dans des organismes modèles plus simples tels que la levure peuvent être étendus à des organismes eucaryotes supérieurs puisque la plupart des voies et processus biologiques fondamentaux sont conservés tout au long de l’évolution.
Ces criblages génétiques peuvent également être modifiés de plusieurs façons pour répondre à différentes questions biologiques. Par exemple, des gènes orthologues de différents organismes qui peuvent supprimer le phénotype de la souche mutante de requête peuvent être identifiés. Il a également été utilisé pour délimiter les mécanismes de résistance potentiels et déterminer les cibles protéiques de nouveaux composés antibactériens17,18, antifongiques19,20, antiparasitaires 21 et anticancéreux 22. Ce criblage a également été exploité pour identifier les suppresseurs de l’activité des médicaments pharmaceutiques dont le mécanisme d’action n’est pas connu. Ainsi, en principe, ces écrans suppresseurs multicopies peuvent être optimisés et utilisés dans une variété d’applications dans différents organismes. Bien que la plupart des dépistages génétiques utilisés par les chercheurs sur les levures aient été initialement développés chez S. cerevisiae, S. pombe est apparu comme un système modèle complémentaire pour la réalisation de divers criblages et dosages génétiques23. De plus, l’organisation génomique et les processus biologiques chez S. pombe, tels que l’apparition d’introns dans un plus grand nombre de gènes, la complexité des origines de la réplication de l’ADN, la structure du centromère, l’organisation du cycle cellulaire et la présence de la machinerie ARNi, montrent une plus grande ressemblance entre S. pombe et les eucaryotes supérieurs23,24, soulignant l’importance de la conception et de l’utilisation d’outils génétiques chez S. pombe. 
Cet article décrit un protocole d’identification des interacteurs génétiques basé sur la « suppression de dosage » d’un phénotype mutant de perte de fonction chez S. pombe. La base de ce protocole est qu’il s’agit d’une méthode rapide et efficace pour cribler une banque d’ADNc surexprimant des gènes de type sauvage soit sur un plasmide multicopie et / ou à partir d’un promoteur fort. Ce protocole comporte quatre étapes principales : transformation de la bibliothèque en une souche mutante de requête, sélection de clones plasmidiques qui suppriment le phénotype souhaité de la souche mutante requête, récupération du ou des plasmides de ces clones suppresseurs et identification du gène responsable de la suppression du phénotype. Comme c’est le cas pour toute méthode basée sur la sélection et l’identification d’ADNc à partir d’une bibliothèque, le succès de l’écran dépend de l’utilisation d’une bibliothèque de haute qualité et de haute complexité car l’écran ne peut récupérer que les clones d’ADNc présents dans la bibliothèque.
En utilisant ce protocole, nous avons identifié avec succès deux nouveaux suppresseurs du phénotype génotoxique sensible au stress de la requête S. pombe ell1 null mutant. La famille ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) de facteurs d’élongation de la transcription supprime la pause transitoire de l’ARN polymérase II sur les modèles d’ADN dans les essais biochimiques in vitro et est conservée dans divers organismes, de la levure de fission à l’homme25. Des travaux antérieurs ont fourni des preuves qu’un mutant nul de S. pombe ell1 présente une sensibilité au stress génotoxique en présence de 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4-NQO) et de méthanesulfonate de méthyle (MMS)26. Par conséquent, nous avons transformé une bibliothèque d’ADNc multicopie codée par le plasmide de S. pombe en la requête S. pombe ell1 null mutant et identifié deux clones putatifs qui présentaient la capacité de supprimer la sensibilité au stress génotoxique du mutant nul S. pombe ell1 en présence de 4-NQO, un composé qui induit des lésions de l’ADN. Le séquençage ultérieur de l’insert présent dans les clones plasmidiques a permis d’identifier que les gènes codant pour rax2+ et osh6+ étaient responsables de la suppression de la sensibilité au stress génotoxique du mutant nul ell1 lorsqu’il était surexprimé dans le mutant nul ell1.

<table><tbody><tr><td>4-NQO</td><td>Sigma</td><td>N8141</td><td></td></tr><tr><td>Acide acétique, glacial</td><td>Sigma</td><td>1371301000</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate d’adénine</td><td>Himedia</td><td>GRM033</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Himedia</td><td>GRM026</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004L</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium</td><td>Himedia</td><td>MB054</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>Fermentas</td><td>ER0051</td><td></td></tr><tr><td>Biotine</td><td>Himedia</td><td>RM095</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Himedia</td><td>MB007</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de calcium&nbsp ;</td><td>Sigma</td><td>C4901</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme :Alcool isoamylique 24:1</td><td>Sigma</td><td>C0549</td><td></td></tr><tr><td>Acide citrique</td><td>Himedia</td><td>RM1023</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogène phospahte disodique anhydre</td><td>Himedia</td><td>GRM3960</td><td></td></tr><tr><td>ADN simple brin de testicules de saumon</td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td></td></tr><tr><td>EDTA disodique</td><td>Sigma</td><td>324503</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure ferrique hexahydraté</td><td>Himedia</td><td>RM6353</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Amresco</td><td>188</td><td></td></tr><tr><td>Ionositol</td><td>Himedia</td><td>GRM102</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Qualigen</td><td>Q26897</td><td></td></tr><tr><td>Leucine</td><td>Himedia</td><td>GRM054</td><td></td></tr><tr><td>Lithium Acetatae</td><td>Sigma</td><td>517992</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté</td><td>Himedia</td><td>MB040</td><td></td></tr><tr><td>Acide molybdique</td><td>Himedia</td><td>RM690</td><td></td></tr><tr><td>Acide nicotinique</td><td>Himedia</td><td>CMS177</td><td></td></tr><tr><td>PEG, MW 4000</td><td>Sigma</td><td>81240</td><td></td></tr><tr><td>Acide pentothinique</td><td>Himedia</td><td>TC159</td><td></td></tr><tr><td>Phénol</td><td>Himedia</td><td>MB082</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de plasmide</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de potassium Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>Hydrogène de potassium Pthallate</td><td>Merc</td><td>DDD7D670815</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de potassium</td><td>Himedia</td><td>RM1086</td><td></td></tr><tr><td>RNAse</td><td>Fermentas</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Himedia</td><td>GRM205</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium</td><td>Himedia</td><td>GRM1183</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de sodium</td><td>Himedia</td><td>RM1037</td><td></td></tr><tr><td>Base sans tris</td><td>Himedia</td><td>MB209</td><td></td></tr><tr><td>Uracil</td><td>Himedia</td><td>GRM264</td><td></td></tr><tr><td>Poudre d’extrait de levure</td><td>Himedia</td><td>RM668</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de zinc Heptahydrate</td><td>Merc</td><td>DJ9D692580</td><td></td></tr></tbody></table>

dépistage génétique pour l’identification des suppresseurs multicopies chez schizosaccharomyces pombe

Genetic Screen for Identification of Multicopy Suppressors in Schizosaccharomyces pombe

L’identification des interactions génétiques est un outil puissant pour déchiffrer les fonctions des gènes en fournissant des informations sur leurs relations fonctionnelles avec d’autres gènes et leur organisation en voies et processus biologiques. Bien que la majorité des criblages génétiques aient été initialement développés chez Saccharomyces cerevisiae, une plateforme complémentaire pour la réalisation de ces criblages génétiques a été fournie par Schizosaccharomyces pombe. L’une des approches couramment utilisées pour identifier les interactions génétiques consiste à surexprimer des clones d’une bibliothèque plasmidique à haut nombre de copies à l’échelle du génome dans un mutant de perte de fonction, suivie de la sélection de clones qui suppriment le phénotype mutant.
Cet article décrit un protocole pour effectuer ce dépistage génétique basé sur la « suppression multicopie » chez S. pombe. Ce criblage a permis d’identifier le(s) suppresseur(s) multicopie du phénotype génotoxique sensible au stress associé à l’absence du facteur d’élongation de la transcription Ell1 chez S. pombe. Le criblage a été initié par la transformation de la souche mutante nulle ell1 de requête avec une bibliothèque de plasmides d’ADNc S. pombe à nombre élevé de copies et en sélectionnant les suppresseurs sur des plaques EMM2 contenant du 4-nitroquinoléine 1-oxyde (4-NQO), un composé génotoxique induisant le stress. Par la suite, le plasmide a été isolé à partir de deux colonies suppressives présélectionnées et digéré par des enzymes de restriction pour libérer l’ADN de l’insert. Les plasmides libérant un fragment d’ADN inséré ont été retransformés en souche de délétion ell1 pour confirmer la capacité de ces clones plasmidiques suppresseurs à restaurer la croissance du mutant de délétion ell1 en présence de 4-NQO et d’autres composés génotoxiques. Les plasmides montrant un sauvetage du phénotype de délétion ont été séquencés pour identifier le(s) gène(s) responsable(s) de la suppression du phénotype génotoxique sensible au stress associé à la délétion ell1.

Criblage de suppresseurs multicopies de sensibilité au stress génotoxique associé à la délétion ell1 chez S. pombe Nous avons effectué le dépistage génétique en utilisant le protocole décrit ci-dessus pour identifier les suppresseurs multicopies du phénotype de perte de fonction de la souche mutante de délétion ell1. La sensibilité liée à la croissance de la souche de délétion ell1 observée en présence de l’agent g...

Ce travail décrit un protocole pour un dépistage génétique suppresseur multicopie chez Schizosaccharomyces pombe. Ce criblage utilise une bibliothèque plasmidique pangénomique pour identifier le(s) clone(s) suppresseur(s) d’un phénotype de perte de fonction associé à une souche mutante de requête. De nouveaux suppresseurs génétiques du mutant nul ell1 ont été identifiés à l’aide de ce criblage.

Dépistage génétique pour l’identification des suppresseurs multicopies chez Schizosaccharomyces pombe

Identification of genetic interactions is a powerful tool to decipher the functions of gene(s) by providing insights into their functional relationships ...

Les cribles suppresseurs identifient les interactions génétiques qui permettraient de faire la lumière sur les fonctions du gène d’intérêt ainsi que sur les voies et les processus biologiques dans lesquels ils peuvent être impliqués in vivo. Cette technique permet d’identifier une relation génétique entre deux produits géniques qui n’a peut-être pas été démontrée à l’aide d’autres approches. Les résultats de tels criblages chez la levure peuvent être étendus aux organismes hautement eucaryotes, car la plupart des voies et processus biologiques fondamentaux sont conservés tout au long de l’évolution.Le succès du programme dépend de la disponibilité, de la haute qualité et de la grande efficacité de sa transformation en cellules de levure. Ainsi, le protocole de transformation avec le plasmide avant Cultiver la souche de délétion Schizosaccharomyces pombe ell1 à 32 degrés Celsius sur plaque moyenne YE. Prélevez une boucle pleine de souche mutante ell1 de la plaque, inoculez cinq millilitres de milieu YE supplémenté, puis incuber le flacon en agitant à 32 degrés Celsius pendant la nuit.Après l’incubation, diluer la culture de croissance pendant la nuit dans 100 millilitres de milieu YE frais contenant les suppléments souhaités pour atteindre une densité optique de 0,3 à 600 nanomètres. Incuber le milieu à 32 degrés Celsius tout en agitant à 200 à 550 tr / min jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne la phase logarithmique moyenne. Après avoir divisé les 100 millilitres de culture en deux tubes à centrifuger de 50 millilitres, enduire les cellules à 4 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.Une fois le surnageant jeté, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre d’eau stérile. Centrifuger et jeter à nouveau le surnageant, puis remettre en suspension la pastille de cellule dans un millilitre d’acétate de lithium TE. Encululer la cellule par centrifugation et remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 250 microlitres d’acétate de lithium TE. Ensuite, transférez 125 microlitres des cellules compétentes dans quatre tubes de microcentrifugation stériles différents pour les étapes de transformation suivantes. Faites bouillir l’ADN porteur des testicules de saumon ou du sperme de hareng pendant une minute et placez immédiatement le tube sur de la glace.Pour chaque transformation, ajouter 10 microlitres d’ADN porteur simple brin dans le tube de microcentrifugation contenant 125 microlitres des cellules compétentes et mélanger délicatement par pipetage. Par la suite, ajoutez 50 microgrammes de la bibliothèque d’ADNc Schizosaccharomyces pombe au tube contenant les cellules compétentes et le mélange d’ADN porteur. Après avoir incubé le tube à température ambiante pendant 10 minutes, ajouter 260 microlitres de solution de polyéthylène glycol-acétate de lithium et mélanger par pipetage.Incuber le tube contenant le mélange de transformation à 32 degrés Celsius pendant deux heures sans agiter. Ajouter 43 microlitres de diméthylsulfoxyde préchauffé dans le tube et mélanger délicatement. Maintenant, exposez le tube à un choc thermique à 42 degrés Celsius pendant cinq minutes.Enduire les cellules et jeter le surnageant comme démontré précédemment, puis pipeter la solution résiduelle d’acétate de lithium polyéthylèneglycol TE. Remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres d’eau stérile et placez-les sur une plaque EMM2 contenant les suppléments requis et 0,2 microgramme par millilitre de 4-NQO. Ensuite, laissez les colonies apparaître sur les plaques en incubant les plaques à 32 degrés Celsius pendant cinq à six jours.Pour un criblage plus approfondi, strier les colonies obtenues sur la même plaque moyenne en présence de 0,2 microgramme par millilitre de 4-NQO. Pour une expérience de transformation de bibliothèque, utiliser 500 microlitres de cellules compétentes pour la transformation et plaquer 1 x 10e du mélange de transformation sur une plaque EMM2 avec les suppléments requis manquant de 4-NQO pour calculer le nombre total de clones de bibliothèque obtenus après transformation et dépister les clones suppresseurs. Ajouter 100 à 200 microlitres d’eau stérile à chaque puits d’une plaque de microtitrage stérile de 96 puits.À l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de micropipette de 20 à 200 microlitres, prélever une petite quantité d’inoculum dans chaque colonie obtenue après transformation de la bibliothèque d’ADNc sur la plaque contenant du 4-NQO. Ajouter l’inoculum de chacune des différentes colonies dans chaque puits de la plaque contenant de l’eau stérile et bien mélanger. Repérez trois microlitres de la suspension cellulaire de chaque puits sur des plaques de gélose EMM2 et ajoutez des concentrations appropriées de 4-NQO aux plaques.Après avoir cultivé les cellules à 32 degrés Celsius pendant trois à quatre jours, identifiez les colonies qui montrent une croissance à différentes concentrations de 4-NQO comme suppresseurs putatifs. Pour valider davantage les suppresseurs, cultivez les suppresseurs sélectionnés et les souches de contrôle appropriées dans un milieu EMM2 contenant 225 microgrammes par millilitre d’adénine et d’uracile à 32 degrés Celsius pendant la nuit avec agitation. Après la fin de l’incubation, diluer les cellules à une densité optique de 0,3 dans un milieu EMM2 frais et les faire croître en agitant à 32 degrés Celsius jusqu’à la phase logarithmique moyenne.Repérer les dilutions en série appropriées de cultures sur des plaques EMM2 avec les suppléments requis contenant 0,4 micromolaire 4-NQO ou 0,01% MMS. Pour le contrôle, repérez les souches sur une plaque EMM2 avec les suppléments nécessaires, mais dépourvue de tout agent endommageant l’ADN. Incuber les plaques à 32 degrés Celsius pendant trois à cinq jours pour surveiller la croissance.Repérez les souches mutantes transformées avec le gène d’intérêt sur toute la longueur ou le vecteur vide en tant que témoins positifs et négatifs, respectivement, ainsi que les transformants de la bibliothèque. Inoculer une seule colonie de levure dans un milieu EMM2 contenant 225 microgrammes par millilitre d’adénine et d’uracile et faire croître les cellules à 32 degrés Celsius pendant la nuit en agitant à 200 à 250 tr / min. En fin d’incubation, récolter 10 millilitres de culture de densité optique 0,5 par centrifugation à 4 000 fois G pendant deux minutes à température ambiante.Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 0,2 millilitre de tampon de lyse. Ajouter 0,2 millilitre d’alcool isoamylique chloroforme phénolique et 0,3 gramme de billes de verre lavées à l’acide dans le tube microcentrifugeux. Mélanger en faisant tournoyer le tube pendant deux minutes, puis en incubant sur la glace pendant une minute.Centrifuger le tube à 10 000 fois G pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube microcentrifuge frais et ajouter 200 microlitres d’alcool isoamylique phénolique chloroforme. Après avoir centrifugé à nouveau à 10 000 fois G pendant 10 minutes, transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube frais.Ensuite, ajoutez deux volumes d’éthanol à 100% et 1 volume sur 10e d’acétate de sodium dans le tube et incuber à moins 70 degrés Celsius pendant une heure. Précipiter l’ADN par centrifugation à 10 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et enlever le surnageant. Lavez la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 70% et séchez-la à l’air libre à température ambiante.Remettez l’ADN en suspension dans 20 microlitres d’eau stérile et utilisez trois à cinq microlitres d’ADN plasmidique pour transformer les cellules compétentes d’Escherichia coli. En utilisant le protocole standard, transformer les plasmides de levure isolés en souche TOP10 d’Escherichia coli et étaler les cellules sur des plaques LB avec les antibiotiques nécessaires. Après avoir isolé le plasmide des transformants d’Escherichia coli à l’aide du protocole de lyse alcaline standard, suivre les combinaisons appropriées d’enzymes de restriction pour vérifier la libération du fragment d’ADN inséré par digestion de restriction.Ensuite, retransformez les plasmides montrant la libération d’insert après digestion de restriction dans la souche de délétion ell1 pour vérifier leur capacité à sauver le phénotype génotoxique sensible au stress de la souche de délétion ell1. La souche de pombe Schizosaccharomyces supprimée ell1 a montré une sensibilité au 4-NQO par rapport à la souche de type sauvage. Un grand nombre de colonies sont obtenues sur la plaque dépourvue de 4-NQO.Cependant, moins de transformants ont été obtenus sur la plaque 4-NQO car ils agissent comme suppresseurs punitifs de la sensibilité 4-NQO du mutant nul ell1. Sur les 620 transformants, 74 ont montré une croissance sur 0,4-micromolaire 4-NQO. Il a été observé que seulement 16 sur 74 ont montré une croissance en présence de 4-NQO 0,8 micromolaire.La souche de délétion ell1 transformée avec un vecteur vide et les 16 transformants ont montré une croissance sur la plaque dépourvue de 4-NQO. Le mutant de délétion ell1 contenant uniquement le vecteur vide n’a montré aucune croissance à 0,8-micromolaire 4-NQO et six transformants ont montré une croissance à 0,8-micromolaire 4-NQO, suggérant que les clones de bibliothèque présents dans ceux-ci pourraient supprimer le phénotype de stress génotoxique du mutant nul ell1. La digestion de restriction des plasmides suppresseurs 84 et 104 a libéré un insert d’une kilobase et 800 paires de bases, respectivement.La réintroduction des clones plasmidiques suppresseurs dans le mutant nul ell1 a entraîné la suppression de la sensibilité de croissance associée au 4-NQO. Cependant, en présence de MMS, les plasmides suppresseurs contenant le mutant de délétion ell1 ont montré plus de croissance que ceux à vecteur vide. Ces criblages génétiques peuvent délimiter les mécanismes de résistance potentiels et identifier les cibles protéiques de nouveaux composés antibactériens, antifongiques, antiparasitaires ou anticancéreux.Ils peuvent également identifier le mécanisme d’action des médicaments pharmaceutiques.

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