Dépistage génétique pour l’identification des suppresseurs multicopies chez Schizosaccharomyces pombe

Les cribles suppresseurs identifient les interactions génétiques qui permettraient de faire la lumière sur les fonctions du gène d’intérêt ainsi que sur les voies et les processus biologiques dans lesquels ils peuvent être impliqués in vivo. Cette technique permet d’identifier une relation génétique entre deux produits géniques qui n’a peut-être pas été démontrée à l’aide d’autres approches. Les résultats de tels criblages chez la levure peuvent être étendus aux organismes hautement eucaryotes, car la plupart des voies et processus biologiques fondamentaux sont conservés tout au long de l’évolution.

Le succès du programme dépend de la disponibilité, de la haute qualité et de la grande efficacité de sa transformation en cellules de levure. Ainsi, le protocole de transformation avec le plasmide avant Cultiver la souche de délétion Schizosaccharomyces pombe ell1 à 32 degrés Celsius sur plaque moyenne YE. Prélevez une boucle pleine de souche mutante ell1 de la plaque, inoculez cinq millilitres de milieu YE supplémenté, puis incuber le flacon en agitant à 32 degrés Celsius pendant la nuit.

Après l’incubation, diluer la culture de croissance pendant la nuit dans 100 millilitres de milieu YE frais contenant les suppléments souhaités pour atteindre une densité optique de 0,3 à 600 nanomètres. Incuber le milieu à 32 degrés Celsius tout en agitant à 200 à 550 tr / min jusqu’à ce que la densité optique à 600 nanomètres atteigne la phase logarithmique moyenne. Après avoir divisé les 100 millilitres de culture en deux tubes à centrifuger de 50 millilitres, enduire les cellules à 4 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante.

Une fois le surnageant jeté, remettez en suspension la pastille cellulaire dans un millilitre d’eau stérile. Centrifuger et jeter à nouveau le surnageant, puis remettre en suspension la pastille de cellule dans un millilitre d’acétate de lithium TE. Encululer la cellule par centrifugation et remettre en suspension chaque pastille de cellule dans 250 microlitres d’acétate de lithium TE. Ensuite, transférez 125 microlitres des cellules compétentes dans quatre tubes de microcentrifugation stériles différents pour les étapes de transformation suivantes. Faites bouillir l’ADN porteur des testicules de saumon ou du sperme de hareng pendant une minute et placez immédiatement le tube sur de la glace.

Pour chaque transformation, ajouter 10 microlitres d’ADN porteur simple brin dans le tube de microcentrifugation contenant 125 microlitres des cellules compétentes et mélanger délicatement par pipetage. Par la suite, ajoutez 50 microgrammes de la bibliothèque d’ADNc Schizosaccharomyces pombe au tube contenant les cellules compétentes et le mélange d’ADN porteur. Après avoir incubé le tube à température ambiante pendant 10 minutes, ajouter 260 microlitres de solution de polyéthylène glycol-acétate de lithium et mélanger par pipetage.

Incuber le tube contenant le mélange de transformation à 32 degrés Celsius pendant deux heures sans agiter. Ajouter 43 microlitres de diméthylsulfoxyde préchauffé dans le tube et mélanger délicatement. Maintenant, exposez le tube à un choc thermique à 42 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Enduire les cellules et jeter le surnageant comme démontré précédemment, puis pipeter la solution résiduelle d’acétate de lithium polyéthylèneglycol TE. Remettez les cellules en suspension dans 100 microlitres d’eau stérile et placez-les sur une plaque EMM2 contenant les suppléments requis et 0,2 microgramme par millilitre de 4-NQO. Ensuite, laissez les colonies apparaître sur les plaques en incubant les plaques à 32 degrés Celsius pendant cinq à six jours.

Pour un criblage plus approfondi, strier les colonies obtenues sur la même plaque moyenne en présence de 0,2 microgramme par millilitre de 4-NQO. Pour une expérience de transformation de bibliothèque, utiliser 500 microlitres de cellules compétentes pour la transformation et plaquer 1 x 10e du mélange de transformation sur une plaque EMM2 avec les suppléments requis manquant de 4-NQO pour calculer le nombre total de clones de bibliothèque obtenus après transformation et dépister les clones suppresseurs. Ajouter 100 à 200 microlitres d’eau stérile à chaque puits d’une plaque de microtitrage stérile de 96 puits.

À l’aide d’un cure-dent stérile ou d’une pointe de micropipette de 20 à 200 microlitres, prélever une petite quantité d’inoculum dans chaque colonie obtenue après transformation de la bibliothèque d’ADNc sur la plaque contenant du 4-NQO. Ajouter l’inoculum de chacune des différentes colonies dans chaque puits de la plaque contenant de l’eau stérile et bien mélanger. Repérez trois microlitres de la suspension cellulaire de chaque puits sur des plaques de gélose EMM2 et ajoutez des concentrations appropriées de 4-NQO aux plaques.

Après avoir cultivé les cellules à 32 degrés Celsius pendant trois à quatre jours, identifiez les colonies qui montrent une croissance à différentes concentrations de 4-NQO comme suppresseurs putatifs. Pour valider davantage les suppresseurs, cultivez les suppresseurs sélectionnés et les souches de contrôle appropriées dans un milieu EMM2 contenant 225 microgrammes par millilitre d’adénine et d’uracile à 32 degrés Celsius pendant la nuit avec agitation. Après la fin de l’incubation, diluer les cellules à une densité optique de 0,3 dans un milieu EMM2 frais et les faire croître en agitant à 32 degrés Celsius jusqu’à la phase logarithmique moyenne.

Repérer les dilutions en série appropriées de cultures sur des plaques EMM2 avec les suppléments requis contenant 0,4 micromolaire 4-NQO ou 0,01% MMS. Pour le contrôle, repérez les souches sur une plaque EMM2 avec les suppléments nécessaires, mais dépourvue de tout agent endommageant l’ADN. Incuber les plaques à 32 degrés Celsius pendant trois à cinq jours pour surveiller la croissance.

Repérez les souches mutantes transformées avec le gène d’intérêt sur toute la longueur ou le vecteur vide en tant que témoins positifs et négatifs, respectivement, ainsi que les transformants de la bibliothèque. Inoculer une seule colonie de levure dans un milieu EMM2 contenant 225 microgrammes par millilitre d’adénine et d’uracile et faire croître les cellules à 32 degrés Celsius pendant la nuit en agitant à 200 à 250 tr / min. En fin d’incubation, récolter 10 millilitres de culture de densité optique 0,5 par centrifugation à 4 000 fois G pendant deux minutes à température ambiante.

Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 0,2 millilitre de tampon de lyse. Ajouter 0,2 millilitre d’alcool isoamylique chloroforme phénolique et 0,3 gramme de billes de verre lavées à l’acide dans le tube microcentrifugeux. Mélanger en faisant tournoyer le tube pendant deux minutes, puis en incubant sur la glace pendant une minute.

Centrifuger le tube à 10 000 fois G pendant 15 minutes à température ambiante. Transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube microcentrifuge frais et ajouter 200 microlitres d’alcool isoamylique phénolique chloroforme. Après avoir centrifugé à nouveau à 10 000 fois G pendant 10 minutes, transférer la couche aqueuse supérieure dans un tube frais.

Ensuite, ajoutez deux volumes d’éthanol à 100% et 1 volume sur 10e d’acétate de sodium dans le tube et incuber à moins 70 degrés Celsius pendant une heure. Précipiter l’ADN par centrifugation à 10 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et enlever le surnageant. Lavez la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 70% et séchez-la à l’air libre à température ambiante.

Remettez l’ADN en suspension dans 20 microlitres d’eau stérile et utilisez trois à cinq microlitres d’ADN plasmidique pour transformer les cellules compétentes d’Escherichia coli. En utilisant le protocole standard, transformer les plasmides de levure isolés en souche TOP10 d’Escherichia coli et étaler les cellules sur des plaques LB avec les antibiotiques nécessaires. Après avoir isolé le plasmide des transformants d’Escherichia coli à l’aide du protocole de lyse alcaline standard, suivre les combinaisons appropriées d’enzymes de restriction pour vérifier la libération du fragment d’ADN inséré par digestion de restriction.

Ensuite, retransformez les plasmides montrant la libération d’insert après digestion de restriction dans la souche de délétion ell1 pour vérifier leur capacité à sauver le phénotype génotoxique sensible au stress de la souche de délétion ell1. La souche de pombe Schizosaccharomyces supprimée ell1 a montré une sensibilité au 4-NQO par rapport à la souche de type sauvage. Un grand nombre de colonies sont obtenues sur la plaque dépourvue de 4-NQO.

Cependant, moins de transformants ont été obtenus sur la plaque 4-NQO car ils agissent comme suppresseurs punitifs de la sensibilité 4-NQO du mutant nul ell1. Sur les 620 transformants, 74 ont montré une croissance sur 0,4-micromolaire 4-NQO. Il a été observé que seulement 16 sur 74 ont montré une croissance en présence de 4-NQO 0,8 micromolaire.

La souche de délétion ell1 transformée avec un vecteur vide et les 16 transformants ont montré une croissance sur la plaque dépourvue de 4-NQO. Le mutant de délétion ell1 contenant uniquement le vecteur vide n’a montré aucune croissance à 0,8-micromolaire 4-NQO et six transformants ont montré une croissance à 0,8-micromolaire 4-NQO, suggérant que les clones de bibliothèque présents dans ceux-ci pourraient supprimer le phénotype de stress génotoxique du mutant nul ell1. La digestion de restriction des plasmides suppresseurs 84 et 104 a libéré un insert d’une kilobase et 800 paires de bases, respectivement.

La réintroduction des clones plasmidiques suppresseurs dans le mutant nul ell1 a entraîné la suppression de la sensibilité de croissance associée au 4-NQO. Cependant, en présence de MMS, les plasmides suppresseurs contenant le mutant de délétion ell1 ont montré plus de croissance que ceux à vecteur vide. Ces criblages génétiques peuvent délimiter les mécanismes de résistance potentiels et identifier les cibles protéiques de nouveaux composés antibactériens, antifongiques, antiparasitaires ou anticancéreux.

Ils peuvent également identifier le mécanisme d’action des médicaments pharmaceutiques.