Name: Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 48 s
Description: Découvrez la différenciation d'adipocytes primaires de souris pour étudier la résistance à l'insuline par western blot. Ce protocole permet d'évaluer la signalisation insulinique dans un modèle physiologique pertinent.

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Nous remercions Daniel Mondragón, Antonio Prado, Fernando López-Barrera, Martín García-Servín, Alejandra Castilla et María Antonieta Carbajo pour leur assistance technique, et Jessica Gonzalez Norris pour l’édition critique du manuscrit. Ce protocole a été soutenu par Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACYT), Fondo Sectorial de Investigación para la Educación Grant 284771 (à Y.M.).

Toutes les expériences sur les rongeurs ont été approuvées par le Comité de bioéthique de l’Institut de neurobiologie de l’UNAM, protocole numéro 075.
1. Isolement de cellules précurseurs adipocytaires de souris
<ol><li>Euthanasier des souris C57BL/6 mâles âgées de 8 à 10 semaines (p. ex. par inhalation de CO2 et luxation cervicale subséquente) (quatre animaux par isolement). Désinfectez les souris en frottant avec de l’éthanol à 70% et obtenez le tissu adipeux immédiatement après le sacrifice. REMARQUE: Après l’euthanasie des rongeurs, isoler immédiatement le tissu adipeux et effectuer toutes les étapes à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire stérile. Les souris sont maintenues sous des cycles lumière/obscurité de 12 h avec un accès gratuit à la nourriture et à l’eau.</li>
	<li>Disséquer le tissu adipeux sous-cutané inguinal de chaque souris. Retirer seulement le tissu adipeux, en évitant l’ablation du muscle, de la peau ou de tout autre tissu, et le recueillir dans un tube conique de 50 mL contenant 15 mL de solution de collagénase de type 1 (1,5 mg/mL) sur de la glace. Dissoudre la collagénase de type 1 dans l’albumine sérique bovine (BSA) à haute teneur en glucose et 1% de Dulbecco Eagle Medium (DMEM) et filtrer à travers des filtres à seringue de 0,2 μm.</li>
	<li>Couper le tissu adipeux en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux stériles et digérer les échantillons par incubation avec une solution de collagénase de type 1 à 37 °C dans un agitateur orbital (150 tr/min) pendant 30 min (placer le tube contenant de la graisse et de la collagénase en position horizontale pour une plus grande surface agitée). Vérifiez la digestion toutes les 10 minutes pour vous assurer qu’elle fonctionne (la dégradation des tissus est visible) et pour éviter la surdigestion (voir la figure supplémentaire S1).</li>
	<li>Filtrer à l’aide d’une seringue à mailles de 200 μm (préalablement autoclavée) pour éliminer les tissus non digérés avec de la collagénase. Passez le filtre sur le bord du tube pour drainer autant de cellules que possible dans la solution. Ajouter 15 mL de DMEM-1% BSA froid pour arrêter la digestion et centrifuger à 400 × g pendant 10 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer la couche supérieure contenant les adipocytes matures et la majeure partie de la couche liquide; Évitez de toucher ou de déranger le granulé. Ajouter 20 mL de sérum de bœuf bovin fœtal (PBS) tamponné au phosphate froid (PBS) à 2 % et remettre le granulé en suspension. Centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Retirez le surnageant, en aspirant d’abord la couche supérieure pour éliminer les adipocytes et la graisse restants. Remettez la pastille en suspension dans 1 mL de tampon de lyse de chlorure d’ammonium potassium (ACK) (pour lyser les globules rouges) et incuber sur de la glace pendant 5 min. Ajouter 10 mL de PBS-2% FBS, mélanger et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 200 μL de solution anti-Fc (CD16/CD32 anti-souris de rat purifié dilué dans du FBS PBS-2% [1:150]) pour réduire la liaison médiée par le récepteur Fc par les anticorps d’intérêt. Incuber sur la glace pendant 5 min. Transférer la suspension cellulaire dans un tube de 5 mL qui s’insère dans les racks prérefroidis d’un séparateur de cellules magnétiques et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Éliminer le surnageant, ajouter 200 μL du mélange d’anticorps monoclonal CD31(PECAM-1) (390)-biotine (1:100) et d’anticorps monoclonal CD45 (30-F11)-biotine (1:100), bien mélanger et incuber sur glace pendant 15 minutes (préparer les dilutions d’anticorps dans une solution anti-Fc; voir Tableau 1). Ajouter 400 μL de PBS-2% FBS et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C. NOTE: CD31 et CD45 sont des marqueurs des cellules endothéliales et des cellules hématopoïétiques, respectivement.</li>
	<li>Aspirer le surnageant et incuber dans 100 μL de microbilles antibiotines (1:5) pendant 15 min sur glace (préparer des dilutions d’anticorps dans une solution anti-Fc, voir le tableau 1). Ajouter 400 μL de PBS-2% FBS et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	<li>Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 350 μL de PBS-2% FBS. Éliminer les agrégats cellulaires ou les grosses particules des suspensions unicellulaires à l’aide d’un filtre de préséparation (70 μm). Tout d’abord, activez le filtre avec 100 μL de PBS-2% FBS, passez la suspension cellulaire à travers le filtre (recueillir dans un tube propre) et enfin lavez le filtre avec 100 μL de PBS-2% FBS.</li>
	<li>Effectuer la séparation magnétique des cellules en utilisant la stratégie de séparation négative avec un séparateur de cellules magnétiques.<ol><li>Placer l’échantillon dans la position A de la grille de refroidissement (s’assurer que la grille est prérefroidie) et deux tubes vides en position B et C pour récupérer les cellules non marquées et étiquetées, respectivement.</li>
		<li>Chargez le tampon de lavage et le tampon de fonctionnement dans les bouteilles correspondantes avant d’allumer l’équipement. Programmer l’équipement pour effectuer la séparation magnétique des cellules avec le protocole DEPLETE . REMARQUE: Ce protocole est pour la déplétion en mode standard pour l’élimination des cellules avec une expression antigénique normale (dans ce cas, les cellules marquées avec anti-CD31 et anti-CD45), si la récupération est la plus haute priorité.</li>
		<li>Dans la section de séparation , sélectionnez le nombre d’échantillons à séparer et sélectionnez le protocole DEPLETE . Appuyez sur Exécuter et démarrez la séparation. À la fin du programme, récupérer les cellules non marquées et centrifuger à 400 × g pendant 5 min à 4 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 500 μL de milieu de croissance (tableau 1).</li>
	<li>Ensemencer les APC dans un puits d’une plaque de 12 puits préalablement recouverte d’une matrice membranaire basale à 2,5 % (environ 50 000 à 75 000 cellules sont obtenues). Ajouter 400 μL de matrice membranaire basale à 2,5 % pour couvrir toute la surface de chaque puits. Immédiatement après avoir retiré l’excès de solution et ne laisser qu’une petite couche, laissez sécher la plaque (sans couvercle) à l’intérieur de la hotte à flux laminaire pendant au moins 1 h. Incuber à 37 °C dans une atmosphère de 5% de CO2 . Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.</li>
	<li>À 80% de confluence, retirer complètement le milieu et laver avec 350 μL de PBS-2% FBS. Récolter les cellules avec 350 μL de trypsine-EDTA à 0,05% pendant 2 min à 37 °C. Ajouter 2 mL de milieu de croissance et recueillir les cellules dans un nouveau tube conique de 50 mL, puis centrifuger à 400 × g pendant 5 min.</li>
	<li>Passage des APC vers des plaques à 12 puits (10 000 à 20 000 cellules par puits) préalablement recouvertes d’une matrice membranaire basale à 2,5 %. Incuber à 37 °C avec 5% de CO2. Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence. REMARQUE: Les APC peuvent être passés une fois. Par la suite, ils perdent leur capacité à proliférer et à se différencier. Voir le workflow pour le processus d’isolation des APC dans la figure supplémentaire S2.</li>
</ol>2. Différenciation des adipocytes et induction de la résistance à l’insuline
REMARQUE : Maintenir les cellules à 37 °C dans 5 % de CO2 et effectuer des étapes impliquant un changement de milieu et des traitements avec du TNF-α et de l’insuline à l’intérieur d’une cagoule stérile.
<ol><li>À 80% de confluence, commencer le processus de différenciation; aspirer tout milieu de croissance et le remplacer par 500 μL de milieu de différenciation (tableau 1) contenant 3,3 nM de protéine morphogénétique osseuse (BMP4) dans chaque puits.</li>
	<li>Après 48 h, remplacer le milieu par le milieu de différenciation (500 μL par puits) et le cocktail de différenciation (tableau 1).</li>
	<li>Retirer le milieu 72 h plus tard et ajouter 100 nM d’insuline dans 500 μL de milieu de différenciation frais. REMARQUE: Les cellules commencent à montrer un aspect rond avec de petites gouttelettes lipidiques à l’intérieur.</li>
	<li>Aspirer tout milieu de différenciation et le remplacer par 500 μL de milieu simple - FBS à 2% (tableau 1) 48 h plus tard. Induire une résistance à l’insuline avec 4 ng/mL de TNF-α. Inclure les puits témoins sans traitement au α au TNF.</li>
	<li>Après 24 heures d’incubation, ajouter 4 ng/mL de TNF-α dans du FBS simple à 0 % (tableau 1). Maintenir les puits de contrôle sans traitement au α TNF.</li>
	<li>Activer la voie de signalisation de l’insuline 24 h plus tard en ajoutant 100 nM d’insuline et incuber pendant 15 min à 37 °C dans une atmosphère de CO2 à 5%. Retirer le milieu et laver avec 500 μL de PBS. Inclure les puits témoins sans traitement à l’insuline.</li>
</ol>3. Évaluation de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western
<ol><li>Extraction et quantification des protéines<ol><li>Lavez chaque puits de cellules avec 500 μL de PBS et conservez-les sur la glace pour lyser les cellules dans 50 μL de tampon RIPA (tableau 1) contenant un cocktail d’inhibiteurs de protéase à 1 % ajouté juste avant l’isolement de l’échantillon. Grattez toute la surface du puits avec une pointe et transférez le lysat dans un tube microcentrifuge de 0,6 mL (garder sur la glace).</li>
		<li>Incuber pendant 1 h à 4 °C dans un agitateur rotatif, mélanger par tourbillon, centrifuger à 8 000 × g pendant 15 min à 4 °C et récupérer le surnageant (garder sur la glace).</li>
		<li>Déterminer la concentration en protéines à l’aide du test de Bradford (ne pas diluer l’échantillon pour quantifier).</li>
		<li>Prélever le volume nécessaire correspondant à 40-60 μg et dénaturer avec 6x tampon Laemmli (tableau 1) en incubant à 97 °C pendant 15 min tout en agitant à 550 tr/min. Congeler jusqu’à utilisation.</li>
	</ol></li>
	<li>Électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS<ol><li>Effectuer une électrophorèse sur gel de polyacrylamide SDS (SDS-PAGE) avec un gel de polyacrylamide à 7,5% d’épaisseur de 1,5 mm. Insérez le gel dans le réservoir et remplissez-le de tampon courant (tableau 1).</li>
		<li>Ajouter 3 μL de protéine étalon précolorée au premier puits du gel et charger chaque échantillon dans les puits suivants.</li>
		<li>Exécutez le gel à 80 V pendant environ 15 minutes pour s’assurer que l’échantillon pénètre dans la matrice de gel du concentrateur de polyacrylamide. Par la suite, augmentez la tension à 90 V pendant 2,5 h ou jusqu’à ce que le marqueur de poids moléculaire de 37 kDa puisse être vu sur le bord inférieur du gel.</li>
		<li>Transférer les protéines du gel vers une membrane de nitrocellulose dans une chambre semi-sèche pendant 35 min à 25 V. Au préalable, immergez le gel, la membrane et les filtres dans un tampon de transfert (tableau 1) pendant quelques minutes.</li>
	</ol></li>
	<li>Western blot<ol><li>Après le transfert, laver la membrane avec une solution saline tamponnée Tris (TBS) contenant 0,1 % de Tween 20 (TBS-T 0,1 %) (tableau 1) pendant 3 min en agitant à 30 tr/min.</li>
		<li>Bloquer la membrane avec une solution de blocage (tableau 1) à 4 °C pendant 1 h en rotation constante.</li>
		<li>Couper la membrane en trois parties selon le marqueur de poids moléculaire à incuber pendant une nuit avec différents anticorps primaires (dilués dans une solution bloquante) à 4 °C en rotation constante : anticorps Phospho-IRS1 (Tyr608) (1:1 000), bande attendue à 180 kDa ; Anticorps β récepteur phospho-insuline (Tyr1150/1151) (1:1 000), bande attendue à 95 kDa; Anticorps Phospho-Akt (Ser473) (1:1 000), bande attendue à 60 kDa.</li>
		<li>Lavez les membranes 5x pendant 5 min chacune avec TBS-T 0,1%.</li>
		<li>Incuber les membranes avec l’anticorps secondaire couplé à la peroxydase correspondant (dilué dans une solution bloquante) pendant 2 h à température ambiante en rotation constante : peroxydase affiniPure ânesse anti-lapin IgG (H+L) (1:5 000).</li>
		<li>Lavez les membranes 5x pendant 5 min chacune avec TBS-T 0,1%.</li>
		<li>Détecter les protéines à l’aide du système de détection par chimiluminescence. Préparez le substrat conformément aux instructions du fabricant.</li>
		<li>Placez le transfert dans un sac en plastique et ajoutez 200 μL de substrat chimioluminescent pour recouvrir complètement la membrane. Vidangez l’excès de substrat et éliminez les bulles d’air.</li>
		<li>Exposez chaque transfert pendant 30-60 s dans un système d’imagerie haute performance compatible avec la chimiluminescence.</li>
		<li>Dénuder les membranes (étapes 10 à 13 de la section Western blot) pour briser les interactions anticorps-antigène et permettre ainsi aux membranes de nitrocellulose d’être regonflées. Récupérer les membranes et laver 3x pendant 5 min chacune avec TBS-T 1% à 50 tr/min.</li>
		<li>Incuber pendant 7 min avec 10 mL de NaOH 0,2 M à 50 rpm.</li>
		<li>Laver 3x pendant 5 min chacun avec de l’eau du robinet à 50 tr/min.</li>
		<li>Laver pendant 10 min avec TBS-T 1 % à 50 tr/min.</li>
		<li>Répéter les étapes 2 à 9 de la section Western blot pour incuber la membrane avec de la tubuline anti-bêta (55 kDa) comme contrôle de charge en utilisant une dilution de 1:1 000.</li>
		<li>Effectuer une analyse densitométrique25 pour chaque protéine à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/).</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Elmus, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+signaling+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Insulin signaling and insulin resistance.</a> Journal of Investigative Medicine. 61 (1), 11-14 (2013).</li>
<li>Kasuga, M., Zick, Y., Blithe, D. L., Crettaz, M., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+stimulates+tyrosine+phosphorylation+of+the+insulin+receptor+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Insulin stimulates tyrosine phosphorylation of the insulin receptor in a cell-free system.</a> Nature. 298 (5875), 667-669 (1982).</li>
<li>Kasuga, M., Karlsson, F. A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+stimulates+the+phosphorylation+of+the+95%2C000-dalton+subunit+of+its+own+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insulin stimulates the phosphorylation of the 95,000-dalton subunit of its own receptor.</a> Science. 215 (4529), 185-187 (1982).</li>
<li>Taniguchi, C. M., Emanuelli, B., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+nodes+in+signalling+pathways%3A+insights+into+insulin+action%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Critical nodes in signalling pathways: insights into insulin action.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 7 (2), 85-96 (2006).</li>
<li>Freeman, A. M., Pennings, N. Insulin Resistance. StatPearls. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/">https://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK507839/</a> (2021).</li>
<li>Petersen, M. C., Shulm, G. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+insulin+action+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of insulin action and insulin resistance.</a> Physiological Reviews. 98 (4), 2133-2223 (2018).</li>
<li>Batista, T. M., Haider, N., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+underlying+defect+in+insulin+action+in+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Defining the underlying defect in insulin action in type 2 diabetes.</a> Diabetologia. 64 (5), 994-1006 (2021).</li>
<li>Unamuno, X., Frühbeck, G., Catalán, V. Adipose Tissue. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aUnamuno%2C+X+%22Encyclopedia+of+Endocrine+Diseases.+Second+edition%22">Encyclopedia of Endocrine Diseases. Second edition</a>. , Academic Press. 370-384 (2019).</li>
<li>Cinti, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pink+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Pink adipocytes.</a> Trends in Endocrinology & Metabolism. 29 (9), 651-666 (2018).</li>
<li>Kahn, B. B., Flier, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Obesity and insulin resistance.</a> The Journal of Clinical Investigation. 106 (4), 473-481 (2000).</li>
<li>Klemm, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin-induced+adipocyte+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Insulin-induced adipocyte differentiation.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (30), 28430-28435 (2001).</li>
<li>Wilcox, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+and+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22The+Clinical+Biochemist.+Reviews%22%5BJournal%5D)">Insulin and insulin resistance.</a> The Clinical Biochemist. Reviews. 26 (2), 19-39 (2005).</li>
<li>Yohannes, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+insulin+resistance%2C+and+type+2+diabetes%3A+associations+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrome+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrome and Obesity: Targets and Therapy. 13, 3611-3616 (2020).</li>
<li>James, D. E., Stöckli, J., Birnbaum, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+etiology+and+molecular+landscape+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The etiology and molecular landscape of insulin resistance.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 22 (11), 751-771 (2021).</li>
<li>Wondmkun, Y. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+insulin+resistance%2C+and+type+2+diabetes%3A+associations+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%2C+Metabolic+Syndrime+and+Obesity%3A+Targets+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Obesity, insulin resistance, and type 2 diabetes: associations and therapeutic implications.</a> Diabetes, Metabolic Syndrime and Obesity: Targets and Therapy. 9 (13), 3611-3616 (2020).</li>
<li>Hardy, O. T., Czech, M. P., Corvera, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+causes+the+insulin+resistance+underlying+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Endocrinology%2C+Diabetes%2C+and+Obesity%22%5BJournal%5D)">What causes the insulin resistance underlying obesity.</a> Current Opinion in Endocrinology, Diabetes, and Obesity. 19 (2), 81-87 (2012).</li>
<li>Klein, S., Gastaldelli, A., Yki-Järvinen, H., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+does+obesity+cause+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Why does obesity cause diabetes.</a> Cell Metabolism. 34 (1), 11-20 (2022).</li>
<li>Lo, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+in+vitro+insulin-resistance+models+and+their+physiological+relevance+to+in+vivo+diet-induced+adipose+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Analysis of in vitro insulin-resistance models and their physiological relevance to in vivo diet-induced adipose insulin resistance.</a> Cell Reports. 5 (1), 259-270 (2013).</li>
<li>Asterholm, I. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+inflammation+is+essential+for+healthy+adipose+tissue+expansion+and+remodeling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Adipocyte inflammation is essential for healthy adipose tissue expansion and remodeling.</a> Cell Metabolism. 20 (1), 103-118 (2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., Murray, D. L., Choy, L. N., Spiegelman, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor+alpha+inhibits+signaling+from+the+insulin+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor alpha inhibits signaling from the insulin receptor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 91 (11), 4854-4858 (1994).</li>
<li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Parijs, L. V., Lodish, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+necrosis+factor-%CE%B1+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activates+expression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes.+Nuclear+factor-%CE%BAB+activation+by+TNF-%CE%B1+is+obligatory%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Tumor necrosis factor-α suppresses adipocyte-specific genes and activates expression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes. Nuclear factor-κB activation by TNF-α is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li>
<li>Boucher, J., Kleinridders, A., Kahn, C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+receptor+signaling+in+normal+and+insulin-resistant+states%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Insulin receptor signaling in normal and insulin-resistant states.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 6 (1), 009191(2014).</li>
<li>Hotamisligil, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IRS-1-mediated+inhibition+of+insulin+receptor+tyrosine+kinase+activity+in+TNF-alpha-+and+obesity-induced+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">IRS-1-mediated inhibition of insulin receptor tyrosine kinase activity in TNF-alpha- and obesity-induced insulin resistance.</a> Science. 271 (5249), 665-668 (1996).</li>
<li>Copps, K. D., White, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+insulin+sensitivity+by+serine%2Fthreonine+phosphorylation+of+insulin+receptor+substrate+proteins+IRS1+and+IRS2%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetologia%22%5BJournal%5D)">Regulation of insulin sensitivity by serine/threonine phosphorylation of insulin receptor substrate proteins IRS1 and IRS2.</a> Diabetologia. 55 (10), 2565-2582 (2012).</li>
<li>Gassmann, M., Grenacher, B., Rohde, B., Vogel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+western+blots%3A+pitfalls+of+densitometry%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Quantifying western blots: pitfalls of densitometry.</a> Electrophoresis. 30 (11), 1845-1855 (2009).</li>
<li>Skurk, T., Hauner, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+human+adipocyte+precursor+cells%3A+expansion+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Primary culture of human adipocyte precursor cells: expansion and differentiation.</a> Methods in Molecular Biology. 806, 215-226 (2012).</li>
<li>Hausman, D. B., Park, H. J., Hausman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+preadipocytes+from+rodent+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of preadipocytes from rodent white adipose tissue.</a> Methods in Molecular Biology. 456, 201-219 (2008).</li>
<li>Macotela, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+adipocyte+precursor+cells+from+different+white+fat+depots%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in adipocyte precursor cells from different white fat depots.</a> Diabetes. 61 (7), 1691-1699 (2012).</li>
<li>Rodeheffer, M. S., Birsoy, K., Friedman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+white+adipocyte+progenitor+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of white adipocyte progenitor cells in vivo.</a> Cell. 135 (2), 240-249 (2008).</li>
<li>Hausman, D. B., DiGirolamo, M., Bartness, T. J., Hausman, G. J., Martin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology+of+white+adipocyte+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Obesity+Reviews%22%5BJournal%5D)">The biology of white adipocyte proliferation.</a> Obesity Reviews. 2 (4), 239-254 (2001).</li>
<li>Kirkland, I. M., Tchkonia, T., Pirtskhalava, T., Han, J., Karagiannides, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipogenesis+and+aging%3A+does+aging+make+fat+go+MAD%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Geronotology%22%5BJournal%5D)">Adipogenesis and aging: does aging make fat go MAD.</a> Experimental Geronotology. 37 (6), 757-767 (2002).</li>
<li>Guo, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+results+in+paradoxical+susceptibility+of+fat+cell+progenitors+to+lipotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Endocrinology+and+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Aging results in paradoxical susceptibility of fat cell progenitors to lipotoxicity.</a> American Journal of Physiology. Endocrinology and Metabolism. 292 (4), 1041-1051 (2007).</li>
<li>Ruan, H., Hacohen, N., Golub, T. R., Van Parijs, L., Lodish, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F.Tumor+necrosis+factor-a+suppresses+adipocyte-specific+genes+and+activatesexpression+of+preadipocyte+genes+in+3T3-L1+adipocytes%3A+nuclear+factor-kappaB+activation+by+TNF-a+is+obligatory%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes%22%5BJournal%5D)">F.Tumor necrosis factor-a suppresses adipocyte-specific genes and activatesexpression of preadipocyte genes in 3T3-L1 adipocytes: nuclear factor-kappaB activation by TNF-a is obligatory.</a> Diabetes. 51 (5), 1319-1336 (2002).</li>
<li>Jager, J., Gre ́meaux, T., Cormont, M., Le Marchand-Brustel, Y., Tanti, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-1b-induced+insulin+resistance+in+adipocytes+throughdown-regulation+of+insulin+receptor+substrate-1+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Interleukin-1b-induced insulin resistance in adipocytes throughdown-regulation of insulin receptor substrate-1 expression.</a> Endocrinology. 148 (1), 241-251 (2007).</li>
<li>Rotter, V., Nagaev, I., Smith, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interleukin-6+%28IL-6%29+induces+insulinresistance+in+3T3-L1+adipocytes+and+is%2C+like+IL-8+and+tumor+necrosis+factor-a%2Coverexpressed+in+human+fat+cells+from+insulin-resistant+subjects%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Interleukin-6 (IL-6) induces insulinresistance in 3T3-L1 adipocytes and is, like IL-8 and tumor necrosis factor-a,overexpressed in human fat cells from insulin-resistant subjects.</a> The Journal of Biological Chemistry. 278 (46), 45777-45784 (2003).</li>
<li>Isidor, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insulin+resistance+rewires+the+metabolic+gene+program+and+glucose+utilization+in+human+white+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Obesity%22%5BJournal%5D)">Insulin resistance rewires the metabolic gene program and glucose utilization in human white adipocytes.</a> International Journal of Obesity. 46 (3), 535-543 (2021).</li>
<li>Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reactive+oxygen+species+have+a+causal+role+in+multiple+forms+of+insulin+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance.</a> Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Cet article fournit une méthode pour étudier la résistance à l’insuline qui utilise des adipocytes primaires dans la culture traitée avec le TNF-α. Ce modèle présente l’avantage que les adipocytes primaires peuvent être cultivés dans des conditions définies pendant de longues périodes avec un contrôle étroit des facteurs environnementaux cellulaires26. La durée du test est de 15 à 20 jours, bien que des variations dans le pourcentage d’adipocytes différenciés puissent se produire entre les expérie...

L’insuline est une hormone anabolique produite par les β-cellules des îlots pancréatiques et le régulateur clé du métabolisme du glucose et des lipides. Parmi ses nombreuses fonctions, l’insuline régule l’absorption du glucose, la synthèse du glycogène, la gluconéogenèse, la synthèse des protéines, la lipogenèse et la lipolyse1. Le signal moléculaire initial après interaction de l’insuline avec son récepteur (IR) est l’activation de l’activité intrinsèque de la protéine tyrosine kinase de l’IR2, entraînant son autophosphorylation3 et l’activation ultérieure d’une famille de protéines connues sous le nom de substrats des récepteurs de l’insuline (PID), qui se lie aux protéines adaptatrices conduisant à l’activation d’une cascade de protéines kinases4 . L’insuline active deux voies de signalisation principales: la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)-protéine kinase B (AKT) et la protéine kinase activée par Ras-mitogène (MAPK). Le premier constitue un point de branche ou nœud majeur 4,5 pour l’activation de nombreux effecteurs en aval impliqués dans diverses fonctions physiologiques, y compris la régulation de l’homéostasie du carburant, tandis que le second régule la croissance et la différenciation cellulaires 4,6. Les actions de l’insuline dépendent en fin de compte du type cellulaire et du contexte physiologique7.
L’un des principaux tissus métaboliques sensibles à l’insuline est le tissu adipeux. Le tissu adipeux blanc est le type de graisse le plus abondant chez les humains et les rongeurs, distribué dans la graisse sous-cutanée (entre la peau et les muscles) et la graisse viscérale (autour des organes de la cavité abdominale). Compte tenu de leur grand volume, les adipocytes ou cellules graisseuses sont le type de cellule le plus abondant dans le tissu adipeux. Ces cellules graisseuses peuvent être brunes/beiges (thermogéniques), roses (dans la glande mammaire) et blanches 8,9. Les adipocytes blancs conservent les principales réserves d’énergie dans le corps sous forme de triglycérides, un processus insulino-dépendant. L’insuline favorise le transport du glucose et la lipogenèse, tout en inhibant la lipolyse ou la dégradation des lipides 7,10. Il facilite également la différenciation des préadipocytes en adipocytes – les cellules matures stockant les graisses11.
La résistance à l’insuline se produit lorsqu’un taux d’insuline normal produit une réponse biologique atténuée, entraînant une hyperinsulinémie compensatoire12. La résistance à l’insuline est une affection associée au surpoids et à l’obésité5 qui, lorsqu’elle est combinée, entraîne le diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies métaboliques13. L’hyperinsulinémie compense la résistance à l’insuline dans les tissus périphériques pour maintenir une glycémie normale14. Cependant, la perte ou l’épuisement éventuel de cellules β, ainsi qu’une résistance exacerbée à l’insuline, entraînent une glycémie élevée compatible avec le DT25. Par conséquent, la résistance à l’insuline et l’hyperinsulinémie peuvent contribuer au développement de maladies métaboliques dérivées de l’obésité15. En outre, l’obésité peut provoquer une inflammation locale chronique de bas grade favorisant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux15,16,17. En outre, les altérations du tissu adipeux dérivées de l’obésité, telles que la fibrose, l’inflammation et la réduction de l’angiogenèse et de l’adipogenèse, entraînent une baisse des taux sériques d’adiponectine (un sensibilisant à l’insuline) et une augmentation de la sécrétion de facteurs tels que l’inhibiteur de l’activateur du plasminogène 1 (PAI-1), les acides gras libres et les exosomes dans la circulation sanguine, exacerbant la résistance à l’insuline17.
De nombreux aspects sous-jacents à la résistance à l’insuline restent inconnus. Des modèles in vitro et in vivo ont été développés pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans les principaux tissus cibles, y compris le tissu adipeux. L’avantage des modèles in vitro est que les chercheurs ont plus de contrôle sur les conditions environnementales et peuvent évaluer la résistance à l’insuline dans des types cellulaires spécifiques. En particulier, les cellules précurseurs adipocytaires (APC) ont le phénotype individuel du tissu donneur, ce qui pourrait mieux refléter la physiologie que les lignées cellulaires adipocytes. L’un des principaux facteurs induisant la résistance à l’insuline in vitro est le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α). Le TNF-α est une cytokine pro-inflammatoire sécrétée par les adipocytes et les macrophages dans le tissu adipeux18. Bien qu’elle soit nécessaire pour un remodelage et une expansion appropriés du tissu adipeux19, l’exposition à long terme au TNF-α induit une résistance à l’insuline dans le tissu adipeux in vivo et dans les adipocytes in vitro20. Le traitement chronique par le TNF-α de plusieurs types cellulaires entraîne une augmentation de la phosphorylation de la sérine de l’IR et de l’IRS-1, favorisant ainsi une diminution de la phosphorylation de la tyrosine21. L’augmentation de la phosphorylation de l’IRS-1 sur les résidus de sérine inhibe l’activité de la tyrosine kinase IR et peut être l’un des principaux mécanismes par lesquels le traitement chronique par le TNF-α altère l’action de l’insuline22,23. Le TNF-α active des voies impliquant l’inhibiteur de la sérine/thréonine kinase du facteur nucléaire ĸB kinase β (IKKβ) et de la kinase terminale c-Jun N (JNK)24. JNK induit un programme transcriptionnel pro-inflammatoire complexe mais phosphoryle aussi directement IRS-16.
Comprendre la pathogenèse de la résistance à l’insuline est devenu de plus en plus important pour guider le développement de futures thérapies contre le DT2. Les APC se sont révélés être un excellent modèle pour l’étude de la biologie des cellules adipeuses, y compris la sensibilité et la résistance à l’insuline, et pour identifier les propriétés intrinsèques des adipocytes indépendamment de l’environnement systémique. Les APC peuvent être facilement obtenus à partir de différents dépôts adipeux et, dans les conditions appropriées, différenciés en adipocytes matures. Avec cette méthode, les effets directs sur la résistance / sensibilité à l’insuline peuvent être évalués dans les adipocytes.

<table><tbody><tr><td><fort>1. Cellules précurseurs adipocytaires de souris d’isolement</tampon de lyse ACK></td><td></td><td></td><td></td>ACK</tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>LONZA</td><td>10-548E</td><td></td></tr><tr><td>Microbilles anti-biotine&nbsp ;</td><td>Miltenyi</td><td>130-090-485</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD31</td><td>eBioscience</td><td>13-0311-85</td><td></td></tr><tr><td>Séparateur AutoMACS Pro</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Matrice de membrane basale (matrigel)</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>Facteur</td></tr><tr><td>de croissance BSA</td><td>Equitech-Bio, Inc.</td><td>BAC63-1000</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Anticorps monoclonal (30-F11) - Biotine&nbsp ;</td><td>eBioscience</td><td>13-0451-85</td><td></td></tr><tr><td>Colgénase de type 1</td><td>Worthington Biochem</td><td>LS004197</td><td></td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>DMEM faible teneur en glucose</td><td>GIBCO</td><td>31600-034</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Peprotech</td><td>315-09</td><td>Facteur</td></tr><tr><td>de croissance FBS</td><td>GIBCO</td><td>26140-079</td><td></td></tr><tr><td>ITS mix</td><td>Sigma</td><td>I3146</td><td></td></tr><tr><td>Acide L-ascorbique 2-phosphate</td><td>Sigma</td><td>A8960</td><td></td></tr><tr><td>LIF</td><td>Millipore</td><td>ESG1107</td><td>Facteur de croissance</td></tr><tr><td>Acide linoléique-albumine</td><td>Sigma</td><td>L9530</td><td></td></tr><tr><td>MCDB 201 moyen</td><td>Sigma</td><td>M6770</td><td></td></tr><tr><td>Normocin</td><td>InvivoGen</td><td>ant-nr-2</td><td></td></tr><tr><td>PDGF-BB&nbsp ;</td><td>Peprotech</td><td>315-18</td><td>Facteur de croissance</td></tr><tr><td>Péniciline-Streptomycine</td><td>BioWest</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>Filtres de pré-séparation (70 &micro ; m)</td><td>Miltenyi</td><td>130-095-823</td><td></td></tr><tr><td>Anti-souris pour rat purifié CD16 / CD32&nbsp ;</td><td>BD Pharmingen</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA&nbsp ;</td><td>GIBCO</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>2. Différenciation adipocytaire et induction de la résistance à l’insuline </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthine [IBMX]</td><td>Sigma</td><td>I5879</td><td>Cocktail de différenciation</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>R& D Systems</td><td>5020-BP-010</td><td>Cocktail de différenciation</td></tr><tr><td>Dexaméthasone</td><td>Sigma</td><td>D1756</td><td>Cocktail de différenciation</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>Rosiglitazone</td><td>Cayman</td><td>71742</td><td>Cocktail de différenciation</td></tr><tr><td>TNF&alpha ;</td><td>R& D Systems</td><td>210-TA-005&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td><fort>3. Évaluation de la voie de signalisation de l’insuline par western blot</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-tubuline</td><td>bêta Abcam</td><td>ab6046</td><td></td></tr><tr><td>Bleu de bromophénol</td><td>BioRad</td><td>161-0404</td><td>Tampon Laemmli</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td>Tampon RIPA</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E4378</td><td>Tampon RIPA</td></tr><tr><td>Système FluorChem E</td><td>ProteinSimple</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sigma</td><td>G6279</td><td>Tampon Laemmli</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>G7126</td><td>Tampon de fonctionnement et de transfert</td></tr><tr><td>Igepal</td><td>Sigma</td><td>I3021</td><td>Tampon RIPA</td></tr><tr><td>2- mercaptoethanol</td><td>Sigma</td><td>M3148</td><td>Tampon Laemmli</td></tr><tr><td>Méthanol</td><td>JT Baker</td><td>907007</td><td>Tampon</td></tr> <tr><td>de transfertNaCl</td><td>JT Baker</td><td>3624-05</td><td>TBS-T</td></tr><tr><td>NaF</td><td>Sigma</td><td>77F-0379</td><td>Tampon RIPA</td></tr><tr><td>NaOH&nbsp ;</td><td>JT Baker</td><td>3722-19</td><td></td></tr><tr><td>Na4P2O7</td><td>Sigma</td><td>114F-0762</td><td>Tampon RIPA</td></tr><tr><td>Na3VO4</td><td>Sigma</td><td>S6508</td><td>Tampon RIPA</td></tr><tr><td>Membrane nitrocellulosique&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1620112</td><td></td></tr><tr><td>Lait écrémé en poudre</td><td>BioRad</td><td>1706404</td><td>Solution bloquante</td></tr><tr><td>Étalon protéique précoloré&nbsp ;</td><td>BioRad</td><td>1610395</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td><td>Sigma</td><td>P8340-5ML</td><td></td></tr><tr><td>Peroxydase AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-035-132</td><td></td></tr><tr><td>Récepteur phospho-insuline &bêta ; &nbsp ;</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>3024</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Akt (Ser473) Anticorps</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>9271</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-IRS1 (Tyr608) Anticorps</td><td>Millipore</td><td>9432</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose&nbsp ;</td><td>JT Baker</td><td>407205</td><td>Tampon RIPA</td></tr><tr><td>SDS</td><td>BioRad</td><td>1610302</td><td>Tampon de course et laemmli</td></tr><tr><td>SuperSignal West Pico PLUS Substrat chimiluminescent</td><td>Thermo Scientific</td><td>34577</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Promega</td><td>H5135</td><td>Tampon de course, de transfert et laemmli</td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>JT Baker</td><td>4103-02</td><td>Tampon RIPA - TBS</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td>TBS-T</td></tr></tbody></table>

adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline

Differentiated Mouse Adipocytes in Primary Culture: A Model of Insulin Resistance

La résistance à l’insuline est un effet réduit de l’insuline sur ses cellules cibles, généralement dérivé d’une diminution de la signalisation des récepteurs de l’insuline. La résistance à l’insuline contribue au développement du diabète de type 2 (DT2) et d’autres maladies dérivées de l’obésité à forte prévalence dans le monde entier. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents à la résistance à l’insuline est d’une grande pertinence. Plusieurs modèles ont été utilisés pour étudier la résistance à l’insuline in vivo et in vitro; Les adipocytes primaires représentent une option intéressante pour étudier les mécanismes de la résistance à l’insuline et identifier les molécules qui contrecarrent cette condition et les cibles moléculaires des médicaments sensibilisants à l’insuline. Ici, nous avons établi un modèle de résistance à l’insuline en utilisant des adipocytes primaires en culture traités avec le facteur de nécrose tumorale α (TNF-α).
Les cellules précurseurs adipocytaires (APC), isolées du tissu adipeux sous-cutané de souris digéré par collagéase par la technologie de séparation cellulaire magnétique, sont différenciées en adipocytes primaires. La résistance à l’insuline est ensuite induite par un traitement au TNF-α, une cytokine pro-inflammatoire qui réduit la phosphorylation / activation de la tyrosine des membres de la cascade de signalisation de l’insuline. La diminution de la phosphorylation du récepteur de l’insuline (IR), du substrat du récepteur de l’insuline (IRS-1) et de la protéine kinase B (AKT) est quantifiée par transfert Western. Cette méthode fournit un excellent outil pour étudier les mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux.

Au cours des dernières années, la prévalence accrue de l’obésité et du DT2 a suscité une recherche intense des mécanismes médiant la résistance à l’insuline dans le tissu adipeux. Avec le protocole décrit ici, les APC peuvent être différenciés en adipocytes matures pour évaluer la résistance et la sensibilité à l’insuline. Une fois que les APC atteignent la confluence, il faut 10 jours pour compléter leur différenciation en adipocytes matures et leur induction de résistance à l’insuline médiée par le TNF α (<strong class...

Ce protocole décrit l’isolement des préadipocytes de souris de la graisse sous-cutanée, leur différenciation en adipocytes matures et l’induction de la résistance à l’insuline. L’action de l’insuline est évaluée par la phosphorylation/activation des membres de la voie de signalisation de l’insuline par transfert Western. Cette méthode permet de déterminer directement la résistance/sensibilité à l’insuline dans les adipocytes primaires.

Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline

Insulin resistance is a reduced effect of insulin on its target cells, usually derived from decreased insulin receptor signaling. Insulin resistance ...

La résistance à l’insuline peut être évaluée dans les adipocytes primaires, ce qui permet d’étudier des donneurs dans différents contextes physiopathologiques, tels que maigre versus obèse, ou des cellules provenant de différents dépôts graisseux. Les adipocytes primaires conservent bon nombre de leurs propriétés intrinsèques et peuvent être cultivés dans des conditions définies pendant une longue période, avec un contrôle étroit des facteurs environnementaux cellulaires. Pour démarrer le processus de différenciation, les cellules doivent être à 80% de confluence.Si la différenciation commence à une confluence plus ou moins élevée, les cellules se différencient moins ou perdront leur capacité de différenciation. Après avoir sacrifié l’animal, désinfectez les souris en frottant avec de l’éthanol à 70%. Disséquez le tissu adipeux sous-cutané inguinal de chaque souris et recueillez-le dans un tube conique de 15 millilitres, contenant 15 millilitres de solution de collagénase de type un sur de la glace.Couper le tissu adipeux en petits morceaux avec des ciseaux chirurgicaux stériles et digérer les échantillons par incubation avec une solution de collagénase de type un à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital à 150 RPM pendant 30 minutes. Vérifiez la digestion toutes les 10 minutes pour vous assurer qu’elle fonctionne et pour éviter la surdigestion. Filtrez à l’aide d’une seringue à mailles de 200 micromètres pour éliminer le tissu non digéré avec la collagénase, et passez le filtre sur le bord du tube pour drainer autant de cellules que possible dans la solution.Ajouter 15 millilitres de DMEM froid 1% BSA pour arrêter la digestion, et centrifuger à 400 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Aspirer la couche supérieure contenant les adipocytes matures et la majeure partie de la couche liquide. Ajoutez 20 millilitres de PBS froid à 2% FBS et remettez la pastille en suspension.Après avoir centrifugé à nouveau pendant cinq minutes, retirez le surnageant en aspirant la couche supérieure pour éliminer les adipocytes et les graisses restants. Remettez la pastille en suspension dans un millilitre de tampon lysant ACK. Incuber sur la glace pendant cinq minutes.Ajoutez 10 millilitres de PBS 2% FBS et mélangez-le. Après avoir centrifugé pendant cinq minutes et aspiré le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 200 microlitres de solution anti-FC. Incuber sur de la glace pendant cinq minutes et transférer la suspension cellulaire dans un tube de cinq millilitres qui s’insère dans les racks pré-refroidis d’un séparateur de cellules magnétiques.Après avoir centrifugé pendant cinq minutes et éliminé le surnageant, ajoutez-y 200 microlitres du mélange d’anticorps monoclonaux biotine CD 31 et d’anticorps monoclonal CD-45. Bien mélanger et incuber sur glace pendant 15 minutes. Ajoutez ensuite 400 microlitres de PBS 2% FBS et centrifugez à nouveau à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.Aspirez le surnageant et incuberez-le dans 100 microlitres de microbilles anti-biotine pendant 15 minutes sur de la glace. Ajouter 400 microlitres de PBS 2% FBS et centrifuger à nouveau à 400 G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius, comme indiqué précédemment. Après avoir jeté le surnageant, remettre en suspension la pastille dans 350 microlitres de PBS 2%FBS.Pour éliminer les agrégats cellulaires, ou grosses particules, des suspensions monocellulaires avec un filtre de pré-séparation de 70 micromètres, activez le filtre avec 100 microlitres de PBS 2%FBS. Passez la suspension cellulaire à travers le filtre et recueillez-la dans un tube propre. Lavez ensuite le filtre avec 100 microlitres de PBS 2%FBS.Pour effectuer la séparation magnétique des cellules en utilisant la stratégie de séparation négative, placez l’échantillon dans la position A de la grille réfrigérée et deux tubes vides dans les positions B et C pour récupérer les cellules non marquées et marquées. Ensuite, chargez le tampon de lavage et le tampon de passage dans les bouteilles correspondantes. Dans la section séparation, sélectionnez le nombre d’échantillons à séparer et sélectionnez le protocole d’épuisement.Appuyez sur exécuter et démarrez la séparation. À la fin du programme, récupérez les cellules non étiquetées. Ensuite, enduisez une plaque de 12 puits avec une matrice membranaire basale en ajoutant 400 microlitres de matrice membranaire de base à 2,5% pour couvrir toute la surface de chaque puits.Retirez l’excès de solution et laissez la plaque sécher à l’intérieur de la hotte à flux laminaire pendant au moins une heure. Après avoir centrifugé pendant cinq minutes et jeté le surnageant, remettre la pastille en suspension dans 500 microlitres de milieu de croissance. Ensemencer les cellules précurseurs des adipocytes, ou APC, dans un puits de la plaque de 12 puits préalablement recouverte d’une matrice membranaire basale à 2,5 %.Incuber à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5% et changer le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence. Après avoir complètement retiré le milieu, lavez les cellules avec 350 microlitres de PBS 2%FBS. Récoltez les cellules avec 350 microlitres de 0,05% de trip dans l’EDTA pendant deux minutes à 37 degrés Celsius, et ajoutez deux millilitres de milieu de croissance.Recueillir les cellules dans un nouveau tube conique de 50 millilitres et centrifuger à 400 g pendant cinq minutes. Passer les APC sur des plaques à 12 puits, préalablement recouvertes d’une matrice membranaire de base à 2,5 %, et incuber à 37 degrés Celsius avec 5 % de dioxyde de carbone. Changez le milieu toutes les 48 heures jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% de confluence.À 80% de confluence, aspirer tout milieu de croissance et le remplacer par 500 microlitres de milieu de différenciation, contenant 3,3 nanomolaires protéines morphogénétiques osseuses dans chaque puits. Après 48 heures, remplacer le milieu par 500 microlitres par milieu de différenciation de puits, et le cocktail de différenciation. Retirez le milieu 72 heures plus tard et ajoutez 100 nanomolaires d’insuline dans 500 microlitres de milieu de différenciation frais.48 heures plus tard, induire une résistance à l’insuline avec quatre nanogrammes par millilitre de facteur de nécrose tumorale alpha, ou TNF alpha. Aspirez tout milieu de différenciation et remplacez-le par 500 microlitres de milieu simple 2%FBS avec TNF alpha. Après avoir incubé pendant 24 heures, ajouter quatre nanogrammes par millilitre de TNF alpha dans un milieu simple 0%FBS.Activez la voie de signalisation de l’insuline 24 heures plus tard en ajoutant 100 nanomolaires d’insuline et incuber pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius dans une atmosphère de dioxyde de carbone à 5%, comme indiqué précédemment. Après l’incubation, retirer le milieu et laver avec 500 microlitres de PBS, inclure un puits de contrôle sans le traitement à l’insuline. Extraire les protéines et mesurer la phosphorylation des marqueurs de signalisation de l’insuline par transfert Western.Les cellules précurseurs adipocytaires sous-cutanées à 80% de confluence avant d’induire la différenciation dans les plaques de culture à 12 puits, et les adipocytes primaires après sept jours d’induction de la différenciation sont représentés dans cette figure. La résistance à l’insuline induite par le TNF alpha dans les adipocytes primaires sous-cutanés a été démontrée par une diminution de la phosphorylation induite par l’insuline du récepteur de l’insuline, du substrat un du récepteur de l’insuline et de la protéine kinase B ou AKT. La membrane a été sondée avec un récepteur d’insuline anti-phosphorylé, un substrat de récepteur de l’insuline anti-phosphorylé, un AKT anti-phosphorylé, et la tubuline anti-bêta a été utilisée comme contrôle de charge.Le signal a été visualisé avec détection par chimiluminescence. Les taches représentatives et la quantification de trois expériences indépendantes sont présentées ici. Lors de la tentative de cette procédure, une chose qui doit être prise en compte est que l’induction de la résistance à l’insuline avec TNF alpha est avec 2% FBS pendant 24 heures et avec 0% FBS pour les dernières 24 heures.

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Cette vidéo démontre la différenciation des cellules stromales de la moelle osseuse (BMSC) en adipocytes. Dans le processus en deux étapes, en présence de facteurs de croissance et d’hormones spécifiques, les BMSC indifférenciés se différencient d’abord en préadipocytes. La deuxième étape impliquant un traitement au glucose et à l’insuline conduit à la formation d’adipocytes matures avec plusieurs gouttelettes lipidiques.

Différenciation in vitro des cellules stromales de la moelle osseuse de souris en adipocytes

Préadipocytes primaires blanches isolées à partir de tissus adipeux blancs chez la souris peuvent être différenciées en cellules beige / brite. Présenté ici est un système modèle cellulaire fiable pour étudier la régulation moléculaire de "brunissement" de graisse blanche.

L&#39;isolement et la différenciation des cellules stromales vasculaires de cellules Beige / Brite

La culture d’agrégats d’adipocytes matures de membrane (MAAC) est une nouvelle méthode pour la culture des adipocytes humains mûrs. Ici, nous détaillons comment isoler les adipocytes de l’adipose humain et comment mettre en place MAAC.

Isolement et culture des adipocytes matures humains utilisant les cultures agrégées d’adipocytemûr mûr de membrane (MAAC)

Présenté ici est un protocole pour délivrer des oligonucléotides tels que l’ARN interférent petit (siRNA), les imitations de micro-ARN (miRs) ou les anti-micro-ARN (anti-miR) dans les adipocytes matures pour moduler l’expression des protéines et des micro-ARN.

Un modèle de culture de cellules adipocytaires pour étudier l’impact de la modulation des protéines et des micro-ARN sur la fonction des adipocytaires

Ce rapport décrit un protocole pour l’isolement simultané des preadipocytes bruns et blancs primaires des souris nouveau-nées. Les cellules isolées peuvent être cultivées en culture et induites pour se différencier en adipocytes blancs et bruns complètement matures. La méthode permet la caractérisation génétique, moléculaire et fonctionnelle des cellules graisseuses primaires en culture.

Isolement et différenciation des préadipocytes primaires blancs et bruns de souris nouveau-nées

Les préadipocytes sont isolés de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux brun interscapulaire de souris nouveau-nées et différenciés en cellules qui accumulent des gouttelettes lipidiques, expriment des marqueurs moléculaires et montrent la morphologie mitochondriale des adipocytes bruns matures. Ces cellules sont analysées par immunofluorescence et microscopie électronique à transmission.

Différenciation et imagerie des adipocytes bruns de la fraction vasculaire stromale du tissu adipeux interscapulaire de souris nouveau-nées

Ce protocole décrit l’isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale (SVF) du tissu adipeux murin pour obtenir des préadipocytes et obtenir une différenciation adipocytaire in vitro. L’utilisation d’un dissociateur tissulaire pour la digestion de la collagénase réduit la variation expérimentale et augmente la reproductibilité.

Isolement semi-automatisé de la fraction vasculaire stromale à partir de tissu adipeux blanc murin à l’aide d’un dissociateur tissulaire

La taille et la fragilité des adipocytes matures ont limité les techniques et les outils disponibles pour leur étude et leur isolement. Ici, un protocole est décrit pour l’isolement des adipocytes murins matures, qui peuvent être facilement adaptés à différents dépôts adipeux et régimes alimentaires de souris.

Isolement et culture d’adipocytes murins primaires à partir de souris maigres et obèses

Cette procédure décrit une méthode pour l'isolement et la culture de l'organe de Corti murin avec ou sans le limbe en spirale et les neurones du ganglion spiral. Nous démontrons également une méthode pour l'expression d'un gène rapporteur exogènes dans l'organe de Corti explant par électroporation.

Culture primaire et l&#39;électroporation plasmidique de l&#39;Organe de Corti murin.

Modèles animaux orthotopique de cancer ovarien de reproduire la maladie humaine de mieux et donc améliorer notre compréhension de la progression du cancer et de la réponse tumorale au traitement. Un modèle de souris reçoit une injection intrabursal de la luciférase cellules tumorales exprimant l'ovaire. Le traitement est administré par gavage. La croissance tumorale est contrôlée...

L&#39;imagerie in vivo et des traitements thérapeutiques dans un modèle de souris orthotopique de cancer des ovaires

Découvrez la différenciation d'adipocytes primaires de souris pour étudier la résistance à l'insuline par western blot. Ce protocole permet d'évaluer la signalisation insulinique dans un modèle physiologique pertinent.

Adipocytes de souris différenciés en culture primaire: un modèle de résistance à l’insuline

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