Fabrication et caractérisation de nano-matrice Janus Base couche par couche pour favoriser la régénération du cartilage

Ce protocole montre comment nous avons assemblé et caractérisé couche par couche JBNm au niveau moléculaire. JBNm encapsule TGF-B1 et empêche sa libération dans les tissus environnants, favorisant ainsi la chondrogenèse localisée. La formation du JBNm est standardisée, ce qui permet de former différents JBNm pour des applications futures.

La structure unique couche par couche permet l’encapsulation du facteur de croissance, créant une libération localisée constante, ce qui évite l’hypertrophie et soutient la croissance. JBNm fournit un microenvironnement homéostatique pour la régénération du tissu cartilagineux, dans un endroit confiné, en raison de son injectabilité, qui peut être utilisé pour différents scénarios, comme les fractures ou les cavités de forme irrégulière. Pour commencer, ajoutez huit microlitres d’un milligramme par millilitre TGF-B1, en suspension dans l’eau à 32 microlitres d’un milligramme par millilitre de Matrilin-3 en suspension dans l’eau.

Pipette pour assurer un bon mélange de ces protéines. Ajouter 80 microlitres d’un milligramme par millilitre. Janus Base Nanotubes, ou JBNts en suspension dans l’eau, à la solution TGF-B1, Matrilin-3.

Pipeter à plusieurs reprises pour assurer un bon mélange. Pour le groupe JBNt, ajoutez cinq microlitres d’un milligramme par millilitre, JBNts à 50 microlitres d’eau pour obtenir une solution de 90,9 microgrammes par millilitre. Pour le groupe Matrilin-3, ajoutez 40 microlitres de 10 microgrammes par millilitre de Matrilin-3 à 15 microlitres d’eau, pour obtenir une solution de 7,3 microgrammes par millilitre.

Pour le groupe TGF-B1, ajoutez 10 microlitres de 10 microgrammes par millilitre, de TGF-B1 à 45 microlitres d’eau, pour obtenir une solution de 1,8 microgramme par millilitre. Pour le groupe Janus Base Nano-Matrix ou JBNm, ajouter 40 microlitres de 10 microgrammes par millilitre, Matrilin-3 à 10 microlitres de 10 microgrammes par millilitre TGF-B1. Agiter pour assurer un bon mélange.

Ensuite, ajoutez cinq microlitres d’un milligramme par millilitre JBNts à la solution, en pipetant à plusieurs reprises pour mélanger l’échantillon. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer le spectre d’absorption de chaque groupe. Étiquetez le TGF-B1 à l’aide d’une trousse de marquage des protéines, en suivant les instructions du fabricant.

Ajouter 20 microlitres de 20 microgrammes par millilitre, étiqueté TGF-B1, à 25 microlitres d’eau, pour obtenir une solution d’essai de 8,9 microgrammes par millilitre. Étiquetez le Matrilin-3 à l’aide d’un kit d’étiquetage séparé. Ajouter 20 microlitres de 80 microgrammes par millilitre marqué Matrilin-3 à 25 microlitres d’eau, pour obtenir une solution de test de 36 microgrammes par millilitre.

Mélangez 20 microlitres de 80 microgrammes par millilitre étiqueté Matrilin-3 avec 20 microlitres de 20 microgrammes par millilitre marqué TGF-B1, et cinq microlitres d’eau, résultant en un composé TGF-B1, Matrilin-3 marqué. Pipeter le mélange plusieurs fois pour mélanger. Ajoutez cinq microlitres d’un milligramme par millilitre JBNts à 40 microlitres d’eau, ce qui donne une solution de 111 microgrammes par millilitre.

Ajoutez ensuite cinq microlitres d’un milligramme par millilitre de JBNts à la solution TGF-B1 et Matrilin-3 étiquetée et pipette répétée pour mélanger le composé. Transférer chaque groupe d’échantillons dans le puits d’une plaque noire de 384 puits. Chargez la plaque dans un lecteur de microplaques multimode et prenez des mesures à des longueurs d’onde d’excitation de 488 et 555 nanomètres en suivant les protocoles du fabricant.

Dans des conditions physiologiques, le spectre de potentiel zêta de Matrilin-3 a été chargé négativement en raison de son point isoélectrique. Après l’ajout du TGF-B1 à la matriline-3, le potentiel zêta du composé TGF-B1 Matrilin-3 a augmenté à une valeur presque neutre. Le potentiel zêta de JBNm était le plus élevé des trois groupes.

Les spectres d’absorption visible UV ont confirmé la formation de la structure interne hiérarchique couche par couche du JBNm, les cycles aromatiques des chaînes latérales de lysine, et les JBNts ont contribué aux pics d’absorption, à 220 et 280 nanomètres respectivement. La TEM a été utilisée pour caractériser la morphologie des JBNts et des JBNm. Après combinaison avec des protéines, d’épais faisceaux de JBNm ont été observés formant une structure d’échafaudage.

La microscopie à fluorescence a confirmé la présence de la structure couche par couche et a démontré la section efficace du JBNm. Après avoir marqué le fluorescent rouge, Matrilin-3 a enveloppé les faisceaux JBNt et a formé la couche externe du JBNm, tandis que le TGF-B1 fluorescent vert a formé une couche interne. Le transfert d’énergie par résonance de fluorescence affichait des pics d’émission à 520 nanomètres pour les groupes TGF-B1 marqués et à 570 nanomètres pour les groupes Matrilin-3.

L’effet du JBNm sur l’adhésion et la prolifération cellulaire du HMSC a été exploré. Le JBNm a montré que les HMSC étaient regroupés avec lui-même, tandis que moins de cellules adhéraient aux JBNts. L’alignement des cellules et la taille des cellules sur le JBNm ont démontré que les JBNt jouaient un rôle dans l’adhésion cellulaire, tandis que les protéines augmentaient l’affinité de l’adhésion cellulaire.

Après le premier jour de culture cellulaire, les groupes JBNm et TGF-B1 ont montré une prolifération cellulaire significative par rapport aux autres groupes. Lorsque la durée de la structure cellulaire a été augmentée à trois et cinq jours, les groupes JBNm et TGF-B1 ont démontré une prolifération cellulaire encore plus accrue. Lors du marquage fluorescent du JBNm, il est important que le TGF-B1 et le Matrilin-3 soient étiquetés et mélangés individuellement avant d’ajouter les JBNts, afin de permettre la formation correcte de la structure couche par couche.

Une évaluation plus approfondie de l’échafaudage peut permettre de comprendre leur efficacité dans les traitements thérapeutiques. Plus précisément, un essai de prolifération à haut débit peut déterminer le dosage optimal in vitro, et plus tard in vivo. Cette nouvelle création de NanoMatriX permet aux chercheurs d’utiliser un échafaudage injectable à base de nanomatériaux pour régénérer le cartilage.

Cette approche de poly-imitation permet d’améliorer l’androgenèse et la prolifération du site de contre-attaque.