Coloration tridimensionnelle des reins entiers avec CUBIC
18 juillet 2022
Le présent protocole décrit une méthode de nettoyage tissulaire et une coloration immunofluorescente à montage entier pour l’imagerie rénale tridimensionnelle (3D). Cette technique peut offrir des perspectives macroscopiques en pathologie rénale, conduisant à de nouvelles découvertes biologiques.
Ce protocole permet une visualisation des structures tridimensionnelles en rein complet, ce qui peut mener à des découvertes innovantes dans la recherche rénale en fournissant une perspective macroscopique. La coloration des organes entiers est difficile en raison de la difficulté de pénétration des anticorps. Ce protocole a démontré la coloration complète de haute qualité des reins par les anticorps.
Pour commencer, effectuez la fixation par immersion immédiatement après la fixation de perfusion et le prélèvement rénal, en immergeant le rein dans du paraformaldéhyde à 4% à quatre degrés Celsius pendant 16 heures. Donnez trois lavages en utilisant PBS pendant deux heures chacun. Effectuer le processus de décoloration et de délipidation en immergeant le rein fixe dans sept millimètres de 50% CUBIC-L dans un tube à fond rond de 14 millilitres, en agitant doucement à température ambiante.
Après six heures, plongez le rein dans sept millilitres de CUBIC-L dans un tube à fond rond de 14 millimètres, en agitant doucement à 37 degrés Celsius pendant cinq jours. Actualisez CUBIC-L tous les jours. Une fois la décoloration et la délipidation terminées, utilisez une cuillère de distribution pour la manipulation de l’échantillon et lavez le rein trois fois avec du PBS à température ambiante pendant deux heures.
Immunocolorer le rein délipidé dans des anticorps primaires dilués dans une solution tampon de coloration, avec agitation douce dans un agitateur incubateur à 37 degrés Celsius pendant sept jours. Ensuite, lavez le rein avec 0,5% Triton X-100 dans PBS, également connu sous le nom de PBST, à température ambiante pendant une journée. Pour la coloration des anticorps secondaires, traiter le rein avec des anticorps secondaires dans le tampon de coloration, dans l’obscurité, avec une légère agitation à 37 degrés Celsius pendant sept jours.
Fixez la coloration avec un lavage PBST à température ambiante pendant une journée. Après la fixation, immergez le rein dans du formaldéhyde à 1% dans du PB pendant trois heures et lavez-le avec du PBS à température ambiante pendant six heures. Effectuez l’appariement de l’indice de réfraction en immergeant le rein dans sept millilitres de 50% CUBIC-R+ dans un tube à fond rond de 14 millilitres avec agitation pendant une journée, suivi d’un traitement avec sept millilitres de CUBIC-R+ avec agitation à température ambiante pendant deux jours.
Avec l’aide de la méthode de coloration immunitaire, les nerfs sympathiques et les artères d’un rein entier ont été visualisés en imagerie rénale 3D. De plus, des nerfs sympathiques rénaux anormaux ont été visualisés après une lésion d’ischémie-reperfusion. Ce protocole a également facilité la visualisation des nerfs sympathiques dans toute la rate.
Le processus de quantification des données pour la coloration immunofluorescente tridimensionnelle est présenté ici. De plus, les canaux collecteurs, le segment S1 des tubules proximaux et les glomérules ont été visualisés avec succès dans un rein entier. La glomérulomégalie supprimée, résultant de l’administration de médicaments dans les premiers stades de la maladie rénale diabétique, a également été visualisée en imagerie 3D.
Ce protocole peut marquer la molécule spécifique dans un rein entier. Ainsi, les chercheurs peuvent analyser l’altération de la structure dans le système vasculaire ou trouver des événements rares dans les tissus rénaux.
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Aperçu
Ce protocole permet la visualisation de structures tridimensionnelles dans un rein entier, offrant une perspective macroscopique qui peut conduire à des découvertes innovantes en recherche rénale. La méthode comprend un éclaircissement tissulaire et une coloration immunofluorescente en montage entier pour améliorer la qualité d'imagerie.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Biologie
- Pathologie
Contexte général
- La coloration d'organes entiers en montage est difficile en raison des problèmes de pénétration des anticorps.
- Une coloration de haute qualité est essentielle pour une imagerie 3D précise.
- Ce protocole résout les problèmes courants liés à l'imagerie rénale.
- Des perspectives macroscopiques peuvent conduire à de nouvelles découvertes biologiques.
Objectif de l'étude
- Développer une méthode fiable pour l'imagerie tridimensionnelle du rein.
- Améliorer la visualisation des structures rénales.
- Faciliter des découvertes innovantes en pathologie rénale.
Méthodes utilisées
- Fixation par immersion dans du paraformaldéhyde à 4 % à 4 °C pendant 16 heures.
- Lavage avec du PBS pendant deux heures chacun, trois fois.
- Décoloration et délipidation à l'aide de CUBIC-L à 50 %.
- Agitation douce à température ambiante pendant le processus de délipidation.
Résultats principaux
- Coloration de rein entier de haute qualité démontrée.
- Pénétration améliorée des anticorps obtenue.
- Visualisation 3D claire des structures rénales fournie.
- Perspectives macroscopiques permises pour une meilleure compréhension de la pathologie rénale.
Conclusions
- Le protocole améliore avec succès les techniques d'imagerie rénale.
- Il ouvre la voie à de nouvelles découvertes dans la recherche sur le rein.
- Des études futures pourront s'appuyer sur cette méthode afin d'obtenir des connaissances supplémentaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les professionnels
La coloration tridimensionnelle du rein entier avec CUBIC permet une visualisation complète des microstructures rénales, surmontant ainsi les limites de la pathologie conventionnelle. Cette capacité permet une cartographie à haute résolution des vaisseaux sanguins, des tubules, des glomérules et des nerfs sympathiques, offrant des informations essentielles pour la découverte précoce et la réduction des risques mécanistiques dans la recherche sur les maladies rénales. La méthode renforce la confiance prédictive aux points critiques de progression du portefeuille préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse de l'architecture rénale et des réseaux cellulaires à une résolution unicellulaire.
- Prend en charge la détection biologique des risques en visualisant les altérations structurelles après une lésion ou une intervention.
- Facilite la validation fonctionnelle des cibles grâce à une cartographie complète des nerfs sympathiques et des glomérules.
- Améliore la confiance prédictive pour le classement par ordre de priorité des cibles thérapeutiques dans les maladies rénales.
Développement de criblages et de tests
- Prépare des systèmes biologiques tridimensionnels validés pour des flux de travail d'imagerie et de quantification en aval.
- Standardise la coloration d'organes entiers pour obtenir des résultats reproductibles et quantitatifs entre les études.
- Permet une imagerie évolutive des événements rares et des modifications structurelles dans le tissu rénal.
- Facilite une évaluation fiable des effets des composés sur la microanatomie rénale.
Recherche translationnelle et préclinique
- Aligne les résultats d'imagerie 3D avec des biomarqueurs pertinents pour la maladie, tels que la glomérulomégalie.
- Assure une continuité allant de la découverte à la validation préclinique en visualisant les effets des interventions.
- Permet des décisions d'avancement ajustées au risque sur la base d'une analyse tissulaire complète.
- Offre une détection prédictive des risques pour les programmes de recherche rénale translationnelle.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole de marquage 3D sur rein entier s'intègre dans la continuité découverte-préclinique, soutenant la vérification d'hypothèses, la validation de cibles et l'alignement de biomarqueurs translationnels dans la recherche rénale.
- Biologie de la découverte : Facilite la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques en cartographiant les structures rénales et les réponses aux lésions.
- Criblage : Fournit des images tridimensionnelles prêtes à l'analyse et reproductibles pour la comparaison quantitative de conditions expérimentales.
- Analytique : Permet la mesure et la quantification des modifications structurelles, soutenant ainsi une analyse statistique rigoureuse.
- Recherche translationnelle : Relie les résultats d'imagerie à des modèles de maladies et à l'identification précoce de biomarqueurs.
- Réutilisation en milieu professionnel : Met en place une plateforme réutilisable pour l'imagerie d'organes entiers dans les études rénales et les recherches sur des tissus connexes.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles rénales.
- Valeur opérationnelle : Fournit des protocoles d'imagerie 3D standardisés, évolutifs et reproductibles.
- Valeur stratégique : Améliore les décisions de poursuite ou d'abandon et l'efficacité du capital en permettant une analyse tissulaire complète.
- Impact sur le portefeuille : Soutient la priorisation et l'avancement, ajustés au risque, des programmes de maladies rénales.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en clarification tissulaire, en immunomarquage et en analyse d'images 3D.
- Exige un accès à des instruments d'imagerie avancés et à des outils d'analyse informatique.
- Implique une standardisation interéquipes pour assurer la reproductibilité et la comparabilité des données.
- Peut nécessiter des adaptations selon les différents systèmes d'organes ou les panels d'anticorps.
- La pénétration des anticorps et la durée du marquage constituent des limites pratiques pour l'imagerie d'organes entiers.
F.A.Q. sur la bio-industrie pharmaceutique
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:37
Kidney Fixation, Decolorization, and De-Lipidation
1:45
Whole-Mount Immunofluorescent Staining and Refractive Index (RI) Matching
3:03
Results: Whole-Mount Immunofluorescent Staining for Three-Dimensional (3D) Kidney Imaging
4:00
Conclusion
