Isolement et analyse de vésicules extracellulaires traçables et fonctionnalisées à partir du plasma et des tissus solides

Ce protocole fournit un moyen réalisable d’isoler et de collecter les bonnes vésicules extracellulaires de la plupart des tissus sanguins et solides, en particulier d’analyser leur source et leur contenu protéique, ce qui aide à poursuivre les expériences fonctionnelles. Outre un rendement élevé et une faible contamination, le principal avantage de ce protocole est l’analyse des antigènes de surface et des cargaisons de protéines des VE, ce qui est utile pour les études physiologiques et pathologiques. Il facilite le diagnostic des cancers de maladies, telles que les maladies inflammatoires et l’ostéoporose grâce à la détection de marqueurs de surface des cellules parentales des vésicules extracellulaires avec un cytomètre en flux.

La quantité de vésicule extracellulaire tissulaire est critique pour les expériences suivantes. Assurez-vous que la concentration de vésicule extracellulaire n’est pas élevée. Soyez patient pour effectuer la dilution.

Pour commencer, préparez les échantillons d’os maxillaire en isolant l’os maxillaire avec une pince à épiler et des ciseaux ophtalmiques et lavez-les avec du PBS pour vous débarrasser des tissus mous avec une pince à épiler. Ensuite, mettez l’os maxillaire dans des tubes centrifugés de 1,5 millilitre et coupez l’os en petits morceaux d’un millimètre de diamètre avec des ciseaux. Ajouter une certaine quantité de Liberase pour couvrir le tissu et incuber pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Ensuite, centrifugez l’échantillon à 800 G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius et transférez soigneusement le surnageant avec une pipette dans un tube centrifuge neuf et propre de 1,5 millilitre. Après avoir centrifugé les échantillons de plasma et d’os préparés pendant 15 minutes à 2 500 g et quatre degrés Celsius pour éliminer les gros débris cellulaires et les plaquettes restantes, transférer soigneusement les surnageants dans des tubes à centrifuger neufs et propres de 1,5 millilitre et centrifuger à 16 800 g pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Ensuite, jetez le surnageant et remettez en suspension les granulés dans chaque tube avec un millilitre de PBS.

Après avoir centrifugé et jeté le surnageant comme démontré précédemment, encore une fois, remettre en suspension les pastilles dans chaque tube avec 50 microlitres de PBS et stocker ces échantillons à quatre degrés Celsius pendant moins de 24 heures ou de préférence les utiliser immédiatement pour les analyses. Resuspendre les échantillons avec 500 microlitres de PBS et transférer 50 microlitres dans un nouveau tube à centrifuger propre de 1,5 millilitre en tant que témoin vierge étiqueté comme tube A et 50 microlitres supplémentaires dans un autre tube centrifuge propre de 1,5 millilitre comme un simple tube de coloration pour FITC, étiqueté comme tube B.Ajouter 0,5 microlitre de colorant membranaire au tube primaire pour la coloration de la membrane tout en incubant pendant cinq minutes à température ambiante. Après avoir centrifugé le tube primaire pendant 30 minutes à 16 800 G et jeté le surnageant, remettre les pastilles en suspension avec 200 microlitres de PBS.

Diviser chaque échantillon de 50 microlitres en quatre tubes centrifugés de 1,5 millilitre pour les tubes de coloration simples pour le PE étiqueté comme tube C, la coloration de marqueur de surface étiquetée comme tube D et les témoins d’anticorps secondaires marqués comme tube E.Ajouter l’anticorps primaire des échantillons de récepteurs associés aux ostéoclastes et aux vésicules extracellulaires osseuses ainsi que les échantillons d’anticorps CD-18 et de vésicules extracellulaires plasmatiques au tube B et au tube D séparément, incubation pendant une heure à quatre degrés Celsius. Centrifuger les tubes et jeter le surnageant comme démontré précédemment et remettre les pastilles en suspension avec 500 microlitres de PBS. Encore une fois, centrifuger pendant 30 minutes à 16, 800 G et quatre degrés Celsius pour éliminer les anticorps primaires supplémentaires.

Après avoir jeté le surnageant, remettez les pastilles en suspension avec 50 microlitres de PBS, puis ajoutez respectivement des anticorps secondaires conjugués FITC dans le tube E.Incuber tous les tubes pendant une heure à quatre degrés Celsius dans l’obscurité. Diluer une goutte de suspension de billes de 0,2, 0,5 et un micromètre respectivement dans un millilitre de PBS. Ensuite, exécutez chaque taille de billes pour vous assurer de la porte choisie pour les vésicules extracellulaires et réglez le seuil du cytomètre en flux pour rechercher les billes et la population de vésicules extracellulaires à l’aide d’une dispersion interne appropriée.

Définissez l’état terminal comme calculant 100 000 particules colorées sur membrane et analysez l’échantillon via un cytomètre en flux comme décrit dans le manuscrit. Remettez les pastilles en suspension dans 50 microlitres de tampon de lyse RIPA et incuber pendant 30 minutes sur de la glace. Pour quantifier les concentrations de protéines de tous les échantillons dans la microplaque à 96 puits par le dosage des protéines BCA, diluer les deux milligrammes par millilitre de BSA avec 0,9% de solution saline normale dans 0,5 milligrammes par millilitre.

À 0,5 milligramme par millilitre de BSA et 0,9% de solution saline normale dans trois puits dupliqués avec certains volumes. Ensuite, déposez deux microlitres des échantillons et ajoutez 18 microlitres de solution saline normale dans trois puits dupliqués séparément. Après avoir préparé une solution de travail en mélangeant le réactif BCA A avec le réactif B, ajoutez 200 microlitres de la solution de travail à chaque puits et agitez doucement pendant 30 secondes.

Incuber ensuite la microplaque de 96 puits pendant 20 à 25 minutes à 37 degrés Celsius et mesurer la densité optique à 596 nanomètres avec le spectrophotomètre. Ensuite, exportez les données, tracez une courbe standard et calculez la concentration en protéines des échantillons. Selon les résultats, diluer les échantillons à un microgramme par microlitre avec 0,9% de solution saline normale et cinq fois la concentration du tampon de chargement SDS-PAGE et sceller hermétiquement les tubes avec un film et chauffer pendant cinq minutes à 100 degrés Celsius.

Chargez les échantillons dans l’échelle des protéines dans une concentration de gradient de quatre à 20% du tris gel de HEPy. Faites passer le gel dans le tampon courant à 80 volts jusqu’à ce que les protéines forment une ligne. Ensuite, passez à 120 volts pendant une heure jusqu’à ce que le colorant de chargement soit au fond du gel.

Transférer le gel sur la membrane de fluorure de polyvinylidène pré-incubée dans de l’alcool méthylique pendant 20 secondes à l’aide d’un système de transfert humide pour transférer pendant une heure à 200 milliampères. Préparez un tampon de blocage à 5% BSA en ajoutant 2,5 grammes de BSA et 50 millilitres de TBST dans un tube à centrifuger de 50 millilitres. Bloquer les membranes dans ce tampon pendant deux heures à température ambiante avec agitation.

Incuber les membranes avec des anticorps primaires spécifiques dilués avec TBST à une concentration appropriée pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Laver les membranes dans le tampon de lavage quatre fois et incuber les membranes avec des anticorps secondaires appropriés pendant une heure à température ambiante avec agitation. Après avoir lavé les membranes dans le tampon de lavage quatre fois, imagez les membranes à l’aide du kit de chimiluminescence dans un système d’imagerie par gel.

L’analyse de la microscopie électronique à transmission et du suivi des nanoparticules a révélé que les caractéristiques morphologiques typiques des vésicules extracellulaires étaient rondes et en forme de coupe avec un diamètre allant de 500 à 300 nanomètres. L’analyse par cytométrie de flux montre les pourcentages de marqueurs membranaires spécifiques exprimés sur les vésicules extracellulaires, ce qui implique leur origine à partir des cellules mères. L’analyse par transfert Western montre l’expression du DPI et de la PKM2 respectivement comme représentative de la teneur en protéines et des vésicules extracellulaires plasmatiques et des vésicules extracellulaires osseuses, indiquant l’état métabolique.

L’expression négative de Golgin-84 dans les vésicules extracellulaires a été détectée avec la présence de mitofiline, d’alpha-actinine-4, de flottilline-1, de caveolin-1 et de bêta-actine, ainsi que du marqueur CD9 des vésicules, tandis que l’expression de CD81 est faible ou absente avec un manque d’existence d’APO-A-1 dans les vésicules extracellulaires plasmatiques. Les chercheurs, en gardant à l’esprit que l’étape 2.2, la préparation et la digestion des échantillons de tissus doivent être effectuées suffisamment. Sinon, le nombre de vésicules extracellulaires extracellulaires extraites des tissus est limité.

Le marqueur marqué par coloration fluorescente des vésicules extracellulaires peut être injecté dans la bouche pour traiter la phase liée à la fonction potentielle.