Name: Guide d’examen de la formation de graisse intramusculaire et de son origine cellulaire dans le muscle squelettique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Découvrez une méthode de visualisation et de quantification de la graisse intramusculaire dans le muscle squelettique. Ce protocole utilise la fixation PFA et l'imagerie microscopique pour étudier l'origine cellulaire des adipocytes et valider des interventions thérapeutiques contre les maladies musculaires.

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Nous remercions les membres du laboratoire Kopinke d’avoir aidé à la collecte de données et à la lecture critique du manuscrit. Nous remercions également les membres de l’Institut de myologie de l’Université de Floride pour leur précieuse contribution au manuscrit. Le travail a été soutenu par la subvention NIH 1R01AR079449. La figure 2 a été créée avec Biorender.

<ol><li>Milad, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+plasma+lipid+levels+exacerbate+muscle+pathology+in+the+mdx+mouse+model+of+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Increased plasma lipid levels exacerbate muscle pathology in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), 19(2017).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+regional+body+fat+distribution%2C+and+the+metabolic+syndrome+in+older+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Internal+Medicine%22%5BJournal%5D)">Obesity, regional body fat distribution, and the metabolic syndrome in older men and women.</a> Archives of Internal Medicine. 165 (7), 777-783 (2005).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+between+regional+adipose+tissue+distribution+and+both+type+2+diabetes+and+impaired+glucose+tolerance+in+elderly+men+and+women%5BTitle%5D)+AND+%22Diabetes+Care%22%5BJournal%5D)">Association between regional adipose tissue distribution and both type 2 diabetes and impaired glucose tolerance in elderly men and women.</a> Diabetes Care. 26 (2), 372-379 (2003).</li>
<li>Goodpaster, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+loss+of+skeletal+muscle+strength%2C+mass%2C+and+quality+in+older+adults%3A+the+health%2C+aging+and+body+composition+study%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journals+of+Gerontology%2C+Series+A%3A+Biological+Sciences+and+Medical+Sciences%22%5BJournal%5D)">The loss of skeletal muscle strength, mass, and quality in older adults: the health, aging and body composition study.</a> The Journals of Gerontology, Series A: Biological Sciences and Medical Sciences. 61 (10), 1059-1064 (2006).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Thaete, F. L., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thigh+adipose+tissue+distribution+is+associated+with+insulin+resistance+in+obesity+and+in+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Clinical+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Thigh adipose tissue distribution is associated with insulin resistance in obesity and in type 2 diabetes mellitus.</a> American Journal of Clinical Nutrition. 71 (4), 885-892 (2000).</li>
<li>Goodpaster, B. H., Theriault, R., Watkins, S. C., Kelley, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+lipid+content+is+increased+in+obesity+and+decreased+by+weight+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolism%22%5BJournal%5D)">Intramuscular lipid content is increased in obesity and decreased by weight loss.</a> Metabolism. 49 (4), 467-472 (2000).</li>
<li>Burakiewicz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+fat+replacement+of+muscle+by+quantitative+MRI+in+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Quantifying fat replacement of muscle by quantitative MRI in muscular dystrophy.</a> Journal of Neurology. 264 (10), 2053-2067 (2017).</li>
<li>Murphy, W. A., Totty, W. G., Carroll, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MRI+of+normal+and+pathologic+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Roentgenology%22%5BJournal%5D)">MRI of normal and pathologic skeletal muscle.</a> American Journal of Roentgenology. 146 (3), 565-574 (1986).</li>
<li>Willcocks, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicenter+prospective+longitudinal+study+of+magnetic+resonance+biomarkers+in+a+large+duchenne+muscular+dystrophy+cohort%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multicenter prospective longitudinal study of magnetic resonance biomarkers in a large duchenne muscular dystrophy cohort.</a> Annals of Neurology. 79 (4), 535-547 (2016).</li>
<li>Wokke, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+MRI+and+strength+measurements+in+the+assessment+of+muscle+quality+in+Duchenne+muscular+dystrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Neuromuscular+Disorders%22%5BJournal%5D)">Quantitative MRI and strength measurements in the assessment of muscle quality in Duchenne muscular dystrophy.</a> Neuromuscular Disorders. 24 (5), 409-416 (2014).</li>
<li>Contreras, O., Rossi, F. M. V., Theret, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origins%2C+potency%2C+and+heterogeneity+of+skeletal+muscle+fibro-adipogenic+progenitors-time+for+new+definitions%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">Origins, potency, and heterogeneity of skeletal muscle fibro-adipogenic progenitors-time for new definitions.</a> Skeletal Muscle. 11 (1), 16(2021).</li>
<li>El Agha, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stem+cells+in+fibrotic+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stem cells in fibrotic disease.</a> Cell Stem Cell. 21 (2), 166-177 (2017).</li>
<li>Joe, A. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Liu, W., Liu, Y., Lai, X., Kuang, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intramuscular+adipose+is+derived+from+a+non-Pax3+lineage+and+required+for+efficient+regeneration+of+skeletal+muscles%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Intramuscular adipose is derived from a non-Pax3 lineage and required for efficient regeneration of skeletal muscles.</a> Developmental Biology. 361 (1), 27-38 (2012).</li>
<li>Scott, R. W., Arostegui, M., Schweitzer, R., Rossi, F. M. V., Underhill, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hic1+defines+quiescent+mesenchymal+progenitor+subpopulations+with+distinct+functions+and+fates+in+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Hic1 defines quiescent mesenchymal progenitor subpopulations with distinct functions and fates in skeletal muscle regeneration.</a> Cell Stem Cell. 25 (6), 797-813 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrosis+and+adipogenesis+originate+from+a+common+mesenchymal+progenitor+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Fibrosis and adipogenesis originate from a common mesenchymal progenitor in skeletal muscle.</a> Journal of Cell Science. 124, Pt 21 3654-3664 (2011).</li>
<li>Hogarth, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroadipogenic+progenitors+are+responsible+for+muscle+loss+in+limb+girdle+muscular+dystrophy+2B%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Fibroadipogenic progenitors are responsible for muscle loss in limb girdle muscular dystrophy 2B.</a> Nature Communications. 10 (1), 2430(2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Stumm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odd+skipped-related+1+%28Osr1%29+identifies+muscle-interstitial+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+activated+by+acute+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Odd skipped-related 1 (Osr1) identifies muscle-interstitial fibro-adipogenic progenitors (FAPs) activated by acute injury.</a> Stem Cell Research. 32, 8-16 (2018).</li>
<li>Kopinke, D., Roberson, E. C., Reiter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ciliary+Hedgehog+signaling+restricts+injury-induced+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ciliary Hedgehog signaling restricts injury-induced adipogenesis.</a> Cell. 170 (2), 340-351 (2017).</li>
<li>Huang, Y., Das, A. K., Yang, Q. Y., Zhu, M. J., Du, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zfp423+promotes+adipogenic+differentiation+of+bovine+stromal+vascular+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Zfp423 promotes adipogenic differentiation of bovine stromal vascular cells.</a> PLoS One. 7 (10), 47496(2012).</li>
<li>Sun, Y. -M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDGFR%CE%B1+regulated+by+miR-34a+and+FoxO1+promotes+adipogenesis+in+porcine+intramuscular+preadipocytes+through+Erk+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Molecular+Sciences%22%5BJournal%5D)">PDGFRα regulated by miR-34a and FoxO1 promotes adipogenesis in porcine intramuscular preadipocytes through Erk signaling pathway.</a> International Journal of Molecular Sciences. 18 (11), 2424(2017).</li>
<li>Te, L. J. I., Doherty, C., Correa, J., Batt, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification%2C+isolation%2C+and+characterization+of+fibro-adipogenic+progenitors+%28FAPs%29+and+myogenic+progenitors+%28MPs%29+in+skeletal+muscle+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Identification, isolation, and characterization of fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) in skeletal muscle in the rat.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (172), e61750(2021).</li>
<li>Lukjanenko, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+disrupts+muscle+stem+cell+function+by+impairing+matricellular+WISP1+secretion+from+fibro-adipogenic+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors.</a> Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446 (2019).</li>
<li>Santini, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue-resident+PDGFRalpha%28%2B%29+progenitor+cells+contribute+to+fibrosis+versus+healing+in+a+context-+and+spatiotemporally+dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Tissue-resident PDGFRalpha(+) progenitor cells contribute to fibrosis versus healing in a context- and spatiotemporally dependent manner.</a> Cell Reports. 30 (2), 555-570 (2020).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+characterization+of+PDGFRalpha%2B+mesenchymal+progenitors+in+human+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Identification and characterization of PDGFRalpha+ mesenchymal progenitors in human skeletal muscle.</a> Cell Death & Disease. 5, 1186(2014).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Soliman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenic+potential+of+Hic1-expressing+cardiac+stromal+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Pathogenic potential of Hic1-expressing cardiac stromal progenitors.</a> Cell Stem Cell. 26 (2), 205-220 (2020).</li>
<li>Chung, M. I., Bujnis, M., Barkauskas, C. E., Kobayashi, Y., Hogan, B. L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Niche-mediated+BMP%2FSMAD+signaling+regulates+lung+alveolar+stem+cell+proliferation+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Niche-mediated BMP/SMAD signaling regulates lung alveolar stem cell proliferation and differentiation.</a> Development. 145 (9), Cambridge, England. (2018).</li>
<li>Hilgendorf, K. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Omega-3+fatty+acids+activate+ciliary+FFAR4+to+control+adipogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Omega-3 fatty acids activate ciliary FFAR4 to control adipogenesis.</a> Cell. 179 (6), 1289-1305 (2019).</li>
<li>Waisman, A., Norris, A. M., Elías Costa, M., Kopinke, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+and+unbiased+segmentation+and+quantification+of+myofibers+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Automatic and unbiased segmentation and quantification of myofibers in skeletal muscle.</a> Scientific Reports. 11 (1), 11793(2021).</li>
<li>Kang, S. H., Fukaya, M., Yang, J. K., Rothstein, J. D., Bergles, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NG2%2B+CNS+glial+progenitors+remain+committed+to+the+oligodendrocyte+lineage+in+postnatal+life+and+following+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">NG2+ CNS glial progenitors remain committed to the oligodendrocyte lineage in postnatal life and following neurodegeneration.</a> Neuron. 68 (4), 668-681 (2010).</li>
<li>Srinivas, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cre+reporter+strains+produced+by+targeted+insertion+of+EYFP+and+ECFP+into+the+ROSA26+locus%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus.</a> BMC Developmental Biology. 1, 4(2001).</li>
<li>Lukjanenko, L., Brachat, S., Pierrel, E., Lach-Trifilieff, E., Feige, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+profiling+reveals+that+transient+adipogenic+activation+is+a+hallmark+of+mouse+models+of+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Genomic profiling reveals that transient adipogenic activation is a hallmark of mouse models of skeletal muscle regeneration.</a> PLoS One. 8 (8), 71084(2013).</li>
<li>Mahdy, M. A., Lei, H. Y., Wakamatsu, J., Hosaka, Y. Z., Nishimura, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+study+of+muscle+regeneration+following+cardiotoxin+and+glycerol+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+Anatomy+%3D+Anatomischer+Anzeiger%3A+Official+Organ+of+the+Anatomische+Gesellscaft%22%5BJournal%5D)">Comparative study of muscle regeneration following cardiotoxin and glycerol injury.</a> Annals of Anatomy = Anatomischer Anzeiger: Official Organ of the Anatomische Gesellscaft. 202, 18-27 (2015).</li>
<li>Pisani, D. F., Bottema, C. D., Butori, C., Dani, C., Dechesne, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+model+of+skeletal+muscle+adiposity%3A+a+glycerol+treatment+approach%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Mouse model of skeletal muscle adiposity: a glycerol treatment approach.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 396 (3), 767-773 (2010).</li>
<li>Kawai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+glycerol+myopathy%3A+a+histological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathologica%22%5BJournal%5D)">Experimental glycerol myopathy: a histological study.</a> Acta Neuropathologica. 80 (2), 192-197 (1990).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+CT+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method.</a> Nature Protocols. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Uezumi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+Bmp3b+expression+maintains+skeletal+muscle+integrity+and+decreases+in+age-related+sarcopenia%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal Bmp3b expression maintains skeletal muscle integrity and decreases in age-related sarcopenia.</a> The Journal of Clinical Investigation. 131 (1), 139617(2021).</li>
<li>Biferali, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prdm16-mediated+H3K9+methylation+controls+fibro-adipogenic+progenitors+identity+during+skeletal+muscle+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Prdm16-mediated H3K9 methylation controls fibro-adipogenic progenitors identity during skeletal muscle repair.</a> Science Advances. 7 (23), 9371(2021).</li>
<li>Biltz, N. K., Meyer, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+the+quantification+of+fatty+infiltration+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Skeletal+Muscle%22%5BJournal%5D)">A novel method for the quantification of fatty infiltration in skeletal muscle.</a> Skeletal Muscle. 7 (1), (2017).</li>
<li>Vieites-Prado, A., Renier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+3D+imaging+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and 3D imaging in developmental biology.</a> Development. 148 (18), Cambridge, England. (2021).</li>
<li>Gómez-Gaviro, M. V., Sanderson, D., Ripoll, J., Desco, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomedical+applications+of+tissue+clearing+and+three-dimensional+imaging+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Biomedical applications of tissue clearing and three-dimensional imaging in health and disease.</a> iScience. 23 (8), 101432(2020).</li>
<li>Ueda, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+clearing+and+its+applications+in+neuroscience%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Tissue clearing and its applications in neuroscience.</a> Nature Reviews Neuroscience. 21 (2), 61-79 (2020).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Ce protocole décrit un protocole complet et détaillé qui permet une visualisation efficace et une quantification rigoureuse de la graisse intramusculaire. En divisant le même muscle en deux parties, l’une utilisée pour l’immunofluorescence et l’autre pour l’analyse RT-qPCR, ce protocole est également très polyvalent. Il peut également être combiné avec le traçage génétique de la lignée des FAP pour étudier leur conversion en adipocytes dans certaines conditions et est très adaptable pour étiqueter et imager plusieurs types de cellules supplémentaires.
Les moyens les plus couramment utilisés pour visualiser la graisse intramusculaire sont les sections de paraffine suivies de la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine ou des sections congelées colorées pour les colorants lipophiles tels que l’huile rouge O (ORO). Cependant, alors que les tissus traités à la paraffine conservent la meilleure histologie, le même processus extrait également tous les lipides empêchant l’utilisation de colorants lipophiles. Bien que les méthodes de coloration lipophile fonctionnent à la fois sur les sections de tissus fixes et non fixées par PFA, les gouttelettes lipidiques sont facilement déplacées en appliquant une pression sur le couvercle, déformant ainsi la distribution spatiale de la graisse intramusculaire. Pour contourner ce problème, une étude récente a établi un protocole rigoureux pour visualiser les adipocytes ORO+ en utilisant une approche globale. Pour cela, les auteurs ont décellularisé l’AT pour visualiser la distribution spatiale de la graisse intramusculaire dans l’ensemble du TA41. Aussi puissante que soit cette technique, elle empêche également l’utilisation d’autres co-taches pour marquer des structures cellulaires supplémentaires. L’approche d’immunofluorescence globale présentée ici peut être utilisée pour co-colorer les adipocytes avec une variété de marqueurs permettant une cartographie fine de l’environnement cellulaire. Un défi majeur, cependant, est la pénétration tissulaire des anticorps. Plus les fibres sont maintenues ensemble, plus il sera difficile pour les anticorps de pénétrer et de lier également tous les antigènes disponibles. Ainsi, cette méthode est plus efficace lorsque l’on regarde de petits groupes de fibres. Dans le même temps, il s’agit également d’une limitation car l’emplacement anatomique global de la graisse intramusculaire est perdu en se concentrant uniquement sur de petits faisceaux de fibres décollées. Cependant, avec le développement actuel de nouvelles méthodes de nettoyage des tissus et de nouvelles technologies d’imagerie, une plus grande pénétration et visualisation des tissus sera possible à l’avenir 42,43,44.
Bien que la fixation préalable du tissu musculaire préserve la morphologie des adipocytes, il est également difficile d’évaluer la taille des myofibres, une mesure importante de la santé musculaire. La taille des myofibers est déterminée en mesurant la section transversale des myofibres. Nous avons déjà signalé qu’une fixation antérieure du tissu musculaire entraînera l’échec de la plupart des marqueurs disponibles pour décrire les myofibres31. Pour surmonter cet obstacle, nous avons développé un nouveau pipeline de segmentation d’image, qui permet de mesurer la taille du myofibre même dans les sections musculaires fixes31. Ainsi, nous avons établi un pipeline de traitement des tissus robuste et efficace qui, combiné à ce protocole, surmonte la plupart des inconvénients causés par la fixation préalable du tissu musculaire.
Un autre avantage majeur de cette approche est la polyvalence. En divisant l’AT en deux parties, la quantité d’informations pouvant être obtenues à partir d’un muscle est maximisée. Cela réduit non seulement le nombre d’animaux, mais ajoute également une couche supplémentaire de contrôle en confirmant l’histologie par l’expression des gènes et vice versa. En outre, de nombreux gènes différents peuvent être examinés au-delà des gènes adipogéniques. L’ARN isolé peut également être utilisé pour une expérience RNAseq musculaire entière. Enfin, le morceau musculaire surgelé peut également être utilisé pour le travail des protéines. L’une des limites de ce protocole est la possibilité que la blessure ne soit pas uniforme sur toute la longueur de l’AT. Cela pourrait conduire à un scénario où les deux parties musculaires divergent dans la quantité de graisse intramusculaire qu’elles contiennent et peut justifier l’exclusion d’un tel échantillon de toute analyse en aval. Il est donc recommandé de ne pas simplement s’appuyer sur la RT-qPCR pour tirer des conclusions majeures sur la quantité de graisse intramusculaire, mais plutôt comme données de soutien aux quantifications histologiques.
Ensemble, ce protocole décrit un pipeline de traitement tissulaire robuste, efficace et rigoureux qui permettra la visualisation et la quantification de la graisse intramusculaire, la première étape dans le développement de nouvelles options de traitement pour lutter contre la fibrose graisseuse. En même temps, il est polyvalent et peut être adapté à de nombreux types de cellules différentes dans le muscle ainsi que les adipocytes dans d’autres tissus.

L’infiltration de tissus musculaires sains avec fibrose graisseuse est une caractéristique importante de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et d’autres maladies neuromusculaires, ainsi que de la sarcopénie, de l’obésité et du diabète 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10 . Bien que l’augmentation de l’infiltration de graisse dans ces conditions soit fortement associée à une diminution de la fonction musculaire, notre connaissance du pourquoi et de la façon dont la graisse intramusculaire se forme est encore limitée. Les FAP sont une population de cellules stromales mésenchymateuses multipotentes présentes dans la plupart des organes adultes, y compris le muscle squelettique11,12. Avec l’âge et dans les maladies chroniques, cependant, les FAP produisent du tissu cicatriciel fibrotique et se différencient en adipocytes, qui sont situés entre les myofibres individuels et forment de la graisse intramusculaire 13,14,15,16,17,18,19,20.
Pour commencer à lutter contre la formation de graisse intramusculaire, les mécanismes de transformation des PAF en adipocytes doivent être définis. PDGFRα est le marqueur « de référence » dans le domaine pour identifier les FAP dans le muscle de plusieurs espèces 13,16,17,18,20,21,22,23,24,25,26,27. En conséquence, plusieurs lignées Cre murines inductibles au tamoxifène, sous le contrôle du promoteur Pdgfrα, ont été générées, permettant de manipuler génétiquement les PAF in vivo à l’aide du système Cre-LoxP 27,28,29. Par exemple, en combinant cette lignée Cre inductible avec un rapporteur génétique, le traçage de la lignée des PAF peut être effectué, une stratégie que nous avons appliquée avec succès à la carte du destin des PAP dans le tissu adipeux musculaire et blanc20,30. Outre le traçage de la lignée, ces lignes Cre fournissent des outils précieux pour étudier la conversion FAP en graisse.
Un obstacle majeur dans la définition du mécanisme de conversion adipogénique des FAP en graisse intramusculaire est la capacité de quantifier rigoureusement et de manière reproductible la quantité de graisse intramusculaire qui s’est formée dans différentes conditions. La clé est d’équilibrer la préservation des tissus musculaires et adipeux et de l’associer aux méthodes de coloration disponibles pour visualiser les adipocytes. Par exemple, le muscle squelettique est souvent congelé sans fixation préalable, préservant les myofibres mais perturbant la morphologie des adipocytes (Figure 1). En revanche, la fixation suivie de l’incorporation de paraffine, tout en affichant la meilleure histologie tissulaire, y compris les adipocytes, élimine tous les lipides, rendant ainsi la plupart des colorants lipophiles, tels que le colorant couramment utilisé Oil Red O, inutilisables.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2.jpg"> Figure 1 : Images représentatives de la graisse intramusculaire dans les tissus musculaires congelés par rapport aux tissus musculaires fixes. (A) Aperçu schématique de la configuration expérimentale. Images immunofluorescentes montrant des adipocytes (jaunes), des myofibres (gris) et des noyaux (cyan) dans les AT (B) congelés et (C) fixes 21 jours après une lésion au glycérol. Barres d’échelle : 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig1v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Le protocole décrit ici préserve la morphologie des myofibres et des adipocytaires et permet la visualisation et l’analyse de plusieurs types de cellules. Cette approche est basée sur la coloration par immunofluorescence des adipocytes dans le tissu musculaire fixé au paraformaldéhyde (PFA), ce qui permet une co-coloration avec plusieurs anticorps. Il peut également être facilement adapté pour afficher spatialement la graisse intramusculaire dans les tissus intacts en utilisant l’imagerie à montage entier, fournissant ainsi des informations sur le microenvironnement cellulaire de la graisse dans le muscle. De plus, ce protocole peut être combiné avec notre approche récemment publiée pour déterminer la section transversale des myofibres dans les tissus musculaires fixes31, une mesure importante pour évaluer la santé musculaire. La combinaison de cette approche avec le traçage de la lignée génétique pour cartographier le destin de la différenciation des FAP en adipocytes est également décrite ici. Ainsi, le protocole polyvalent décrit ici permet une évaluation rigoureuse et reproductible des PAF et de leur différenciation en graisse intramusculaire dans les coupes de tissus et les tissus intacts.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2.jpg"> Figure 2 : Vue d’ensemble du protocole schématique. Vue d’ensemble schématique du traitement tissulaire dans lequel un tiers de l’AT est retiré, congelé et homogénéisé pour l’isolement ultérieur de l’ARN et l’analyse de transcription via RT-qPCR. Les deux autres tiers de l’AT sont fixés par PFA et traités pour l’immunocoloration sur des sections congelées ou des fibres à montage entier. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig2v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>

<table><tbody><tr><td>16 % PFA (paquet de 12 bouteilles de 10 ml)</td><td>Electron Miscroscopy Sciences</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>2.0 mL Microcentrifuge Tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-138</td><td>microcentrifugeuses pour la congélation/le battage des billes</td></tr><tr><td>2-Methylbutane (4 L)</td><td>Fisher Chemical</td><td>O3551-4</td><td>isopentane</td></tr><tr><td>Absolute Ethanol (200 proof)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BP2818100</td><td></td></tr><tr><td>AffiniPure Fab fragment âne anti-souris</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-007-003</td><td>blocage souris sur souris</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-poulet anticorps secondaire</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-545-155</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-souris anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 âne anti-lapin anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 âne anti-chèvre anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A11057</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 âne anti-lapin anticorps secondaire</td><td>Invitrogen</td><td>A11037</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 568 Anticorps contre la phalloïdine</td><td>Invitrogen</td><td>A12380</td><td>Dissous dans 1,5 mL de méthanol (~66 &micro ; Solution de travail M)</td></tr><tr><td>BioLite Multidishes 24 puits</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>930186</td><td>Plaque à 24 puits pour l’incubation de tissus PFA</td></tr><tr><td>Biometra TOne</td><td>analytikjena</td><td>8462070301</td><td>Thermocycleur</td></tr><tr><td>Anticorps anti-GFP de poulet</td><td>Aves Labs</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Alcool chloroforme/isoamylique 24:1(v/v) pour la biologie moléculaire, sans DNAse, ARNASE et Protéase</td><td>ThermoFisher Scientifique</td><td>AC327155000</td><td></td></tr><tr><td>Huile de maïs</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8267</td><td></td></tr><tr><td>DAPI coloration</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>150 &micro ; M solution de travail en dH2O</td></tr><tr><td>Sérum d’âne (100 mL)</td><td>Millipore Sigma</td><td>5058837</td><td>pour solution de blocage</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11251-20</td><td>Pince à épiler à pointe pointue</td></tr><tr><td>Ciseaux fins Droit 9 cm</td><td>Fine Science Tools</td><td>14060-09</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-01</td><td>support de montage</td></tr><tr><td>Glycérol, 99,5 %, pour la biologie moléculaire (500 mL)</td><td>Acros Organics</td><td>327255000</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-PDGFR&alpha ; anticorps</td><td>R& D</td><td>AF1062</td><td></td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td><td>VWR</td><td>230301V</td><td>pour l’incubation du tamoxifène</td></tr><tr><td>ImmEdge Barrière hydrophobe PAP Pen</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Stylo hydrophobe</td></tr><tr><td>Seringue à insuline avec aiguille IV micro-fine (28 G)</td><td>BD</td><td>329461</td><td></td></tr><tr><td>Seringue à insuline avec embout coulissant, 1 mL</td><td>BD</td><td>329654</td><td>Seringue à insuline sans aiguille, pour orale gavaging</td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1708890</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson Vétérinaire 78938441</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé Leica DMi8</td><td>Micrscope Leica utilisé pour l’imagerie IF à grand champ et l’imagerie confocale</td><td></td> Micro Lames de microscope VWR 48311-703 Lames de microscope chargées positivement Anticorps anti-MYOD de souris <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>MA1-41017</td><td></td></tr><tr><td>anticorps anti-PAX7 de souris (surnageant)</td><td>DSHB</td><td>AB 428528</td><td></td></tr><tr><td>MX35 Premier+ Lames de microtome</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>3052835</td><td>lames de microtome</td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop 2000 Spectrophotomètre</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND2000</td><td>pour le rendement en ARN</td></tr><tr>Pâte de modelage<td>Play-Doh</td><td>Hasbro</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerUp SYBR Green Master Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25742</td><td>colorant vert PCR master mix</td></tr><tr><td>Puralube Vet Ointment</td><td>Puralube</td><td>17033-211-38</td><td>vet ophtalmique</td></tr><tr><td>QuantStudi 6 Flex Real-Time 384-well PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>4485694</td><td>qPCR Machine</td></tr><tr><td>Rabbit anti-perilipin Anticorps Technology</td><td>de signalisation cellulaire</td><td>9349S</td><td></td></tr><tr><td>Agitateur Red-Rotor</td><td>Hoefer Scientific</td><td>PR70-115V</td><td>pour coloration IF</td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Slip-Rite Cover Glass</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>152460</td><td>lamelles</td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td>contient des mini colonnes de centrifugation</td></tr><tr><td>Safe-Lock Tubes 1,5 ml, naturel</td><td>Eppendorf</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>Sample Tubes RB (2 mL)</td><td>QIAGEN</td><td>990381</td><td></td></tr><tr><td>Azoture de sodium</td><td>Alfa Aesar</td><td>14314</td><td></td></tr><tr><td>Perles en acier inoxydable, 2,8 mm</td><td>Precellys</td><td>KT03961-1-101. BK</td><td>petites perles</td></tr><tr><td>Perles en acier inoxydable, 5 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69989</td><td>perles moyennes</td></tr><tr><td>Perles en acier inoxydable, 7 mm</td><td>QIAGEN</td><td>69990</td><td>grandes perles</td></tr><tr><td>Scalpels jetables en acier inoxydable</td><td>Scalpel Miltex</td><td>327-4102</td><td>Tube</td></tr><tr><td>d’alimentation en acier inoxydable, 20 G x 38 mm, droit</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Instech Laboratories FTSS-20S-3 aiguille à gavageTamoxifène</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>T006000</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Plus O.C.T. Compound</td><td>Fisher HealthCare</td><td>4585</td> milieu <td>d’enrobage</td></tr><tr><td>TissueLyser LT</td><td>QIAGEN</td><td>85600</td><td>batteur de perles</td></tr><tr><td>TissueLyser LT Adaptateur, 12 tubes</td><td>QIAGEN</td><td>69980</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td>moules à échantillons</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Alfa Aesar</td><td>A16046</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Réactif</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15596026</td><td>thiocyanate de guanidium</td></tr><tr><td>Tween20 (500 mL)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>VWR Micro Slides - Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311703</td><td></td></tr><tr><td>Wheaton Coplin pots de coloration</td><td>Millipore Sigma</td><td>S6016</td><td>Coplin</td></tr></tbody></table>

guide d’examen de la formation de graisse intramusculaire et de son origine cellulaire dans le muscle squelettique

A Guide to Examining Intramuscular Fat Formation and its Cellular Origin in Skeletal Muscle

Les progéniteurs fibro-adipogènes (PAF) sont des cellules stromales mésenchymateuses qui jouent un rôle crucial lors de l’homéostasie et de la régénération des muscles squelettiques. Les PAF construisent et maintiennent la matrice extracellulaire qui agit comme un échafaudage de myofibre moléculaire. De plus, les PAF sont indispensables à la régénération des myofibres car ils sécrètent une multitude de facteurs bénéfiques détectés par les cellules souches musculaires (MuSC). Dans les états malades, cependant, les FAP sont l’origine cellulaire de la graisse intramusculaire et du tissu cicatriciel fibrotique. Cette fibrose graisseuse est une caractéristique de la sarcopénie et des maladies neuromusculaires, telles que la dystrophie musculaire de Duchenne. Une barrière importante pour déterminer pourquoi et comment les PAF se différencient en graisse intramusculaire est la préservation efficace et la visualisation ultérieure des adipocytes, en particulier dans les sections de tissus congelés. Les méthodes conventionnelles de traitement des tissus musculaires squelettiques, telles que la congélation instantanée, ne préservent pas correctement la morphologie des adipocytes individuels, empêchant ainsi une visualisation et une quantification précises. Pour surmonter cet obstacle, un protocole rigoureux a été développé qui préserve la morphologie des adipocytes dans les sections musculaires squelettiques permettant la visualisation, l’imagerie et la quantification de la graisse intramusculaire. Le protocole décrit également comment traiter une partie du tissu musculaire pour la RT-qPCR, permettant aux utilisateurs de confirmer les changements observés dans la formation de graisse en observant les différences dans l’expression des gènes adipogènes. De plus, il peut être adapté pour visualiser les adipocytes par immunofluorescence de montage entier d’échantillons musculaires. Enfin, ce protocole décrit comment effectuer un traçage génétique de la lignée des FAP exprimant Pdgfrα pour étudier la conversion adipogénique des FAP. Ce protocole produit systématiquement des images immunofluorescentes à haute résolution et morphologiquement précises des adipocytes, ainsi qu’une confirmation par RT-qPCR, permettant une visualisation et une quantification robustes, rigoureuses et reproductibles de la graisse intramusculaire. Ensemble, le pipeline d’analyse décrit ici est la première étape pour améliorer notre compréhension de la façon dont les PAF se différencient en graisse intramusculaire et fournit un cadre pour valider de nouvelles interventions visant à prévenir la formation de graisse.

Visualisation immunofluorescente de la graisse intramusculaire En suivant les étapes ci-dessus et en regardant la figure 1A, des coupes de tissu TA ont été prélevées à partir d’une blessure au glycérol de 21 jours après avoir été congelées immédiatement après la récolte dans de l’isopentane refroidi par LN2 ou ont été fixées dans du PFA à 4 % pendant 2,5 h. Après cryosection et coloration des deux échantillons, des images ont été prises à mi-ventre, la plus grande zone de l’AT. Les adipocytes PERILIPIN+ des AT non fixés (Figure 1B) ont une morphologie significativement modifiée par rapport aux sections fixes (Figure 1C), ce qui rend leur identification, leur visualisation et leur quantification ultérieure beaucoup plus difficiles et potentiellement inexactes. À noter, les premières gouttelettes lipidiques PERILIPIN+ ont été détectées environ 5 jours après la blessure, la plupart des adipocytes s’étant formés au jour 7. 21 jours après la blessure, les adipocytes avaient complètement mûri.
Comme la quantité de graisse par AT est fortement corrélée à la gravité de la blessure induite, les AT doivent être blessés de manière significative pour observer et étudier efficacement la formation de graisse intramusculaire. Pratiquer des injections d’encre dans des TAs de cadavre est un excellent moyen d’améliorer la gravité des blessures. Les blessures réussies ont tendance à être supérieures à 50% du muscle. À noter, les zones blessées du muscle représentent des zones dépourvues de fibres musculaires ou des zones peuplées de fibres musculaires contenant au moins un noyau situé au centre, une caractéristique connue d’une fibre musculaire régénérante.
Ce protocole peut être facilement adapté à la coloration des FAP et des graisses en 3D. Pour cela, plusieurs myofibres de la post-fixation de l’AT ont été soigneusement séparés, suivis d’une immunofluorescence de montage entier. La clé est de fixer correctement les fibres à la lame de verre et, en même temps, d’éviter la surcompression du tissu. En utilisant des pieds en argile moulables, l’utilisateur peut ajuster l’épaisseur requise et fixer le couvercle à la glissière, permettant même l’utilisation d’un microscope inversé (Figure 4A). Cette méthode a été utilisée avec succès pour étiqueter les PAP PDGFRα+ , les myofibers phalloïdine+ et les adipocytes exprimant la PERILIPINE (Figure 4B, Vidéo supplémentaire 1 et Vidéo supplémentaire 2). Après avoir obtenu des images à plusieurs plans Z s’étendant jusqu’à 150 μm d’épaisseur, le module de rendu 3D du logiciel de microscope a été utilisé pour créer une reconstruction 3D.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3.jpg"> Figure 4 : Coloration immunofluorescente à montage entier. (A) Vue de dessus et de côté de la façon de monter l’échantillon et d’ajouter une lèvre de couverture pour la coloration à montage entier. (B) Reconstructions 3D représentatives des FAP (vert; à gauche) et des adipocytes (rouge; à droite) ainsi que des myofibres (gris) et des noyaux (bleu). Barres d’échelle : 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig4v3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Quantification de la graisse intramusculaire Une fois que des images ont été prises de graisse intramusculaire, la fonction Compteur cellulaire dans ImageJ/FIJI a été utilisée pour compter manuellement le nombre d’adipocytes PERLIPIN+ (Figure 5A). Ensuite, la surface totale de la section musculaire ainsi que la zone blessée, définie par des noyaux situés au centre dans les myofibres, ont été déterminées. Pour contrôler la gravité de la blessure, le nombre total d’adipocytes a été divisé par la zone blessée, ce qui a entraîné le nombre de cellules graisseuses pour 1 mm2 de muscle blessé. Habituellement, les AT qui présentent &lt;30 % de blessures sont exclus des quantifications. À noter, bien que les adipocytes soient rares sans blessure, allant de zéro à huit par section transversale, le nombre total d’adipocytes est toujours normalisé par zone totale. Comme le montre la figure 5B, une blessure au glycérol provoque des quantités massives de graisse intramusculaire par rapport à un muscle TA non blessé. Alternativement, comme la coloration à la perilipine est très propre avec un rapport signal/bruit élevé, il est également possible d’utiliser la fonction Analyser les particules pour déterminer la surface totale occupée par la perilipine. Cependant, cette méthode ne sera pas en mesure de faire la distinction entre les adipocytes plus petits et moins nombreux. Jusqu’à trois sections d’un minimum de quatre animaux individuels ont été imagées et quantifiées, et le nombre moyen de cellules graisseuses présentes par souris a été rapporté.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2.jpg"> Figure 5: Quantifications de la graisse intramusculaire. (A) Image représentative de la façon de compter les adipocytes PERILIPIN+ (blanc) à l’aide de la fonction Compteur de cellules dans ImageJ. Barre d’échelle: 50 μm. (B) Quantifications des adipocytes TA entiers 21 jours après l’injection de glycérol normalisée à 1 mm2 de la zone lésée. Chaque point représente la moyenne d’une souris. Barres d’erreur affichées comme SEM. **** = p &lt; 0,0001. (C) La couche d’ARN après homogénéisation et séparation de phase subséquente par chloroforme est utilisée pour l’analyse RT-qPCR. (D) Replier les changements dans les niveaux d’expression de Pparg et Cepbα, gènes adipogéniques précoces, et Plin1 et Adipoq, deux marqueurs adipocytaires matures, à différents moments après une lésion du glycérol. Chaque point représente la moyenne d’une souris. Barres d’erreur affichées sous la forme SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig5v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour afficher une version agrandie de cette figure.</a>
Pour confirmer indépendamment la quantité de graisse intramusculaire présente, les niveaux d’expression génique de divers marqueurs adipogéniques peuvent être déterminés. Pour cela, l’ARN peut être isolé d’une partie du même muscle TA utilisé pour l’immunofluorescence (voir les étapes ci-dessus) à différents points après la blessure. Un batteur de billes a été utilisé en combinaison avec le thiocyanate de guanidium pour homogénéiser le tissu. Après l’ajout de chloroforme suivi d’une centrifugation, la couche supérieure contenant de l’ARN a été soigneusement extraite et des mini-colonnes de spin ont été utilisées pour le nettoyage de l’ARN (figure 5C). Cette méthode produit régulièrement une qualité et une quantité élevées d’ARN adaptées à toutes les analyses en aval telles que la RT-qPCR et l’ARNiq. Pour la RT-qPCR, les niveaux d’expression relatifs des gènes adipogéniques à l’entretien ménager ont été déterminés, et tout changement relatif a été évalué selon la méthode ΔΔCT38. Comme décrit à la figure 5D, par rapport au muscle TA non blessé, la lésion au glycérol induit l’expression de marqueurs adipogènes précoces tels que Pparg et Cebpα dès 3 jours après la blessure. Les marqueurs matures, tels que l’adiponectine (Adipoq) et la perilipine (Plin1), peuvent être détectés dès 5 jours après une lésion au glycérol.
Traçage génétique de la lignée des adipocytes Le protocole de coloration des adipocytes présenté ici peut être facilement adapté pour inclure le traçage génétique de la lignée des FAP afin de cartographier et de suivre leur destin en adipocytes. Nous avons, par exemple, déjà démontré que la recombinaison pouvait être induite par l’administration de tamoxifène dans PdgfrαCreERT2; Rosa26souris EYFP 2 semaines avant la blessure, éliminant efficacement le codage d’arrêt floxé et activant de manière indélébile l’expression de l’EYFP dans les FAPs (Figure 6A). Nous avons atteint des rendements de recombinaison élevés avec le régime de tamoxifène présenté ici, avec environ 75% des PAP PDGFRα+ exprimant EYFP20, similaire à ce que d’autres laboratoires ont rapporté 27,39,40. Démontrant que les PAF sont bien l’origine cellulaire de la graisse intramusculaire, la majorité des PAP se sont transformées en adipocytes exprimant l’EYFP+ PERILIPINE 7 jours après une lésion du glycérol (Figure 6B).
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3.jpg"> Figure 6 : Traçage de la lignée des PAF. (A) Vue d’ensemble schématique de la configuration expérimentale. (B) Images immunofluorescentes représentatives montrant une recombinaison et une activation réussies de l’EYFP (jaune) dans les FAP PDGFRα+ (rouges, pointes de flèche) et les adipocytes PERILIPIN+ (rouges, astérisques). Barres d’échelle : 25 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig6v3large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Détection de plusieurs types de cellules Ce protocole peut également être utilisé pour visualiser le compartiment myogénique. En utilisant des anticorps contre PAX7 et MYOD1, les cellules souches musculaires (MuSC) et les myoblastes, respectivement, peuvent être facilement détectés 5 jours après une lésion au glycérol, même dans une section de tissu musculaire fixée par PFA (Figure 7). Ainsi, le protocole présenté est polyvalent et adaptable non seulement pour étiqueter et imager les adipocytes et les PAF, mais aussi pour d’autres types de cellules de la lignée myogénique.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2.jpg"> Figure 7 : Coloration immunofluorescente des cellules souches musculaires et des myoblastes. (A) Aperçu schématique de la configuration expérimentale. (B) Images immunofluorescentes représentatives montrant une coloration réussie des cellules souches musculaires (MuSC) (jaune, à gauche) avec PAX7 et des myoblastes (jaune, à droite) avec MYOD1. LAMININ décrit les myofibres (blancs) et les noyaux sont en cyan. Barres d’échelle : 50 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/63996fig7v2large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
Vidéo supplémentaire 1: rendu 3D des FAP. Reconstruction tridimensionnelle des myofibres, des PAP et des noyaux colorés pour la PHALLOIDIN (grise), la PDGFRα (verte) et la DAPI (bleue), respectivement, 21 jours après la blessure. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAPs.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>
Vidéo supplémentaire 2: Rendu 3D de la graisse intramusculaire. Rendu volumétrique des faisceaux de myofibères (gris, PHALLOIDIN) et de la graisse intramusculaire (rouge, PERILIPIN), qui a remplacé un myofiber 21 jours après une lésion au glycérol. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63996/FAT.mp4" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.</a>

Le remplacement du tissu musculaire sain par de la graisse intramusculaire est une caractéristique importante des maladies et affections humaines. Ce protocole décrit comment visualiser, imager et quantifier la graisse intramusculaire, permettant l’étude rigoureuse des mécanismes sous-jacents à la formation de graisse intramusculaire.

Guide d’examen de la formation de graisse intramusculaire et de son origine cellulaire dans le muscle squelettique

Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) are mesenchymal stromal cells that play a crucial role during skeletal muscle homeostasis and regeneration. FAPs build ...

Une barrière importante dans l’étude de la graisse intramusculaire, une caractéristique de la sarcopénie et des maladies neuromusculaires, est la préservation efficace et la visualisation ultérieure des adipocytes, en particulier dans les sections de tissus congelés. Le protocole préserve la morphologie des adipocytes et les sections musculaires squelettiques alignées pour une visualisation et une quantification robustes, rigoureuses et reproductibles de la graisse intramusculaire. Notre pipeline d’analyse fournit un cadre pour valider de nouvelles interventions visant à prévenir la formation de graisse dans des maladies telles que la dystrophie musculaire de Duchenne La démonstration de la procédure sera assurée par Connor Johnson, un technicien de recherche de mon laboratoire.Pour commencer, nettoyez la jambe à injecter avec une lingette d’alcool frais pour désinfecter. Aspirer 30 à 50 microlitres de glycérol à 50% dans la seringue à insuline. Brossez doucement les cheveux sur le tibia pour exposer l’emplacement de l’AT. Après avoir localisé l’AT, insérez l’aiguille dans l’AT distalement près de la cheville.Insérez complètement l’aiguille dans le muscle et injectez lentement du glycérol, tout en retirant progressivement l’aiguille, ce qui aide à blesser la majeure partie du muscle. Vaporisez généreusement toutes les zones de la souris à couper avec de l’éthanol à 70% pour aider à empêcher les cheveux de disséquer la zone et les instruments. Utilisez des ciseaux pour couper la peau autour du haut de la jambe près du bassin.Tirez doucement la peau de la jambe du haut vers le bas jusqu’à la cheville. Tout d’abord, retirez la couche externe de tissu conjonctif à l’aide d’une pince à épiler à pointe pointue avant de prélever l’AT. Faites glisser la pince à épiler sous le TA du bas du muscle, en commençant par le tendon distal et tirez doucement vers le haut vers le genou. Arrêtez-vous à la fin du muscle.Ne poussez pas au-delà de la résistance ressentie au niveau du genou inférieur. S’il y a une résistance importante avant d’atteindre le genou inférieur, arrêtez et continuez à enlever les couches restantes de tissu conjonctif. Une fois que l’AT a été partiellement soulevée de la jambe avec la pince à épiler, utilisez le même mouvement avec un scalpel pour couper la connexion de l’AT au genou inférieur.Videz le tendon à la cheville avec des ciseaux pour enlever complètement le TA. Ne manipulez le muscle qu’au niveau du tendon pour éviter d’endommager les fibres. Coupez un tiers de l’AT à la fin, en face du tendon. Mettez-le dans le tube de microcentrifugation et congelez-le en le laissant tomber dans de l’azote liquide.Immergez les deux autres tiers du tissu dans un puits marqué avec 4% de PFA pour l’histologie. Assurez-vous de garder une trace du moment où le premier et le dernier tissu ont été placés en fixateur. Placer sur un nutateur pendant deux à deux heures et demie à quatre degrés Celsius.Après la fixation, retirez le PFA des puits. Rincez les mouchoirs avec un PBS X froid deux à trois fois, puis lavez deux à trois fois avec du PBS 1X froid pendant cinq minutes par lavage. Retirez le PBS des puits et ajoutez suffisamment de saccharose à 30% dans 1X PBS pour permettre au tissu de flotter.Placer sur le nutator à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Allumez le microscope et lancez le logiciel d’imagerie. Fixez la diapositive sur la scène.Utilisez n’importe quel canal pour identifier la zone à imager. Dans le logiciel d’imagerie, ajustez le gain et le temps d’exposition pour chaque canal. Prenez des images de l’ensemble du tissu dans chaque canal et fusionnez des carreaux individuels pour former un composite de la section transversale TA complète.Avant de commencer, préchauffez l’eau sans RNase à 45 degrés Celsius et préparez de l’éthanol frais à 70%. Ajouter 1000 microlitres de thiocyanate de guanidinium à chaque tube contenant l’échantillon. Il est important que des tubes approuvés par Bead Beater soient utilisés.Ajoutez trois perles moyennes, ou une grande et une petite perle, à chaque tube. Homogénéiser le tissu à 50 Hertz pendant deux à quatre minutes à l’aide d’un batteur de perles. Selon le type de tissu et la taille de l’échantillon, cela peut prendre jusqu’à 10 minutes.ajouter 200 microlitres de chloroforme. Secouez les échantillons pendant 15 secondes. Incuber pendant deux à trois minutes à température ambiante.Centrifuger pendant 15 minutes à 12 000 fois G.Pipette 350 microlitres du surnageant clair et ajouter à un nouveau tube de microcentrifugation contenant 350 microlitres d’éthanol à 70%. Veillez à ne pas aspirer les couches inférieures de protéines et/ou d’ADN. Transférez jusqu’à 700 microlitres de ce mélange dans une mini colonne de spin placée dans un tube de collecte de deux millilitres.Poursuivez avec l’isolement de l’ARN en suivant les instructions du fabricant. Elute avec 30 à 50 microlitres d’eau sans RNase, selon le rendement attendu. Gardez l’ARN sur la glace et mesurez le rendement à l’aide d’un spectrophotomètre.Gardez l’ARN stocké à moins 80 degrés Celsius. Utilisez jusqu’à un microgramme d’ARN pour synthétiser l’ADNc avec un kit de synthèse d’ADNc, en suivant les instructions du fabricant. Une fois la course terminée, ajoutez 80 microlitres d’eau libre de RNase.Conservez les échantillons à moins 20 degrés Celsius. À l’aide d’un format de puits 384, ajoutez un microlitre d’apprêt au fond de chaque puits. Les apprêts de séchage gratuits permettent d’obtenir des répliques techniques plus serrées.Laisser couvert jusqu’à ce que les amorces se soient complètement évaporées. Mettre en place des réactions d’échantillon avec quatre à huit répétitions techniques. Une fois l’exécution de la PCR terminée, normalisez les valeurs seuils du cycle brut aux niveaux de gènes d’entretien ménager et déterminez les changements de plis en calculant le delta-delta Ct.La perilipine et les adipocytes positifs des AT non fixés ont considérablement modifié la morphologie par rapport aux sections fixes, ce qui rend leur identification, leur visualisation et une quantification ultérieure beaucoup plus difficiles et potentiellement inexactes.En revanche, la fixation PFA préserve la morphologie des adipocytes, permettant une détection précise de la graisse intramusculaire. Par rapport au muscle TA non blessé, la lésion au glycérol induit l’expression de marqueurs adipogènes précoces, tels que le PPAR gamma et le CEBP alpha dès trois jours après la blessure. Les marqueurs matures tels que l’adiponectine et la périilline peuvent être détectés dès cinq jours après une lésion au glycérol.En utilisant le traçage génétique de la lignée, la majorité des FAP alpha du récepteur PDGF expriment le marqueur de lignée EYFP. Sept jours après une lésion au glycérol, les PAF positives à l’EYFP se sont transformées en adipocytes exprimant la périlipine positive à l’EYFP, démontrant que les PAF sont en effet l’origine cellulaire de la graisse intramusculaire. Le protocole peut également être adapté pour visualiser le compartiment myogénique.L’utilisation d’anticorps contre PAX7 et MYOD1, les marqueurs de cellules souches musculaires et de myoblastes, respectivement, peut être facilement détectée cinq jours après une lésion au glycérol, même dans les sections de tissu musculaire fixe PFA. Ce protocole peut également être adapté pour visualiser et quantifier les adipocytes et autres tissus adultes. De plus, notre technique de préservation des tissus est compatible avec la variété des différentes techniques debout.

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