Isolement et identification de cellules endothéliales vasculaires à partir de dépôts adipeux distincts pour des applications en aval

Ce protocole permettra au chercheur de disséquer l’artère d’intérêt et d’isoler des cellules vasculaires pour effectuer un large éventail de tests fonctionnels. Le chercheur peut étudier différents lits vasculaires et types de cellules pour élargir les connaissances sur la biologie cellulaire vasculaire et le mécanisme du dysfonctionnement vasculaire. Cette méthode est particulièrement applicable aux chercheurs qui étudient la biologie cellulaire vasculaire fondamentale, ainsi que le dysfonctionnement des cellules vasculaires dans les modèles animaux de la maladie.

Un soin particulier doit être pris pour optimiser le protocole de digestion, en particulier lorsque les lits vasculaires d’intérêt diffèrent de ceux présentés ici. Pour commencer, fixez la souris à l’aide de broches de dissection et vaporisez la surface ventrale avec de l’éthanol à 70%. Utilisez des forceps pour soulever la peau juste au-dessus des organes génitaux et faites une petite incision d’environ deux millimètres dans la peau.

Insérez la pointe des ciseaux dans le site d’incision et faites une incision médiane de quatre à cinq centimètres de long commençant à l’incision initiale et disséquant crânienne jusqu’à la base du sternum. Faites une incision d’un centimètre s’étendant latéralement à partir de la ligne médiane immédiatement en dessous du membre antérieur. Faites une incision diagonale d’un centimètre entre le membre postérieur et les organes génitaux.

Faites de petites coupures le long des incisions de la peau médiane pour décoller le tissu conjonctif associé et exposer le dépôt adipeux sous-cutané. Identifiez le tissu adipeux sous-cutané en forme de C et l’artère ou la veine perpendiculaire à la cavité abdominale. Commencez par le bas de la forme C près des organes génitaux et saisissez doucement le tissu adipeux pour exposer les tissus conjonctifs.

Faites de petites coupures dans le tissu conjonctif pour séparer la graisse de la peau et éviter de perturber le système vasculaire exposé. Continuez à disséquer le tissu conjonctif jusqu’à ce que le tissu adipeux sous-cutané puisse être retiré intact. Séparez soigneusement l’artère exposée du tissu conjonctif environnant.

Entreposer le tissu adipeux sous-cutané isolé dans un tampon HEPES sur de la glace. Répétez la dissection pour le dépôt adipeux sous-cutané postérieur restant. Pour isoler le dépôt adipeux mésentérique, utilisez des pinces Graefe pour soulever la mince paroi de la cavité péritonéale au-dessus de la vessie et faites une petite incision à l’aide de ciseaux droits.

Soulevez lentement la paroi de la cavité péritonéale et insérez les ciseaux d’iris droits dans le site d’incision. Faites une incision de quatre à cinq centimètres de la vessie au sternum. Ensuite, faites deux incisions horizontales d’un centimètre avec les ciseaux d’iris droits s’étendant latéralement de la ligne médiane à immédiatement au-dessus du membre postérieur et au-dessous du membre antérieur.

Utilisez la pince Graefe pour décoller la musculature abdominale et exposer les viscères péritonéaux. Utilisez une paire de pinces numéro cinq pour soulever les intestins hors de la cavité viscérale afin de révéler le tissu adipeux mésentérique. Utilisez les ciseaux incurvés et la pince numéro cinq pour séparer le tissu adipeux le long du côlon, en commençant par le caecum jusqu’à l’endroit où le côlon descend de la vue.

Ensuite, séparez le tissu adipeux le long de l’intestin grêle jusqu’au pancréas. Retirez une petite partie du pancréas pour isoler complètement le tissu adipeux mésentérique. Entreposer le tissu adipeux mésentérique isolé dans un tampon HEPES sur de la glace.

Pour isoler les artères, transférez d’abord le tissu adipeux dans une boîte de dissection contenant 10 millilitres de tampon HEPES froid. Sous un stéréomicroscope, positionner le tissu adipeux sous-cutané pour exposer la paire de veines artérielles. Positionnez le tissu adipeux viscéral pour exposer la forme du chou-fleur et la paire de veines artérielles respectives.

Utilisez la pince numéro 55 pour retirer délicatement le parenchymateux adipeux de l’artère. Enlevez les petits morceaux de tissu adipeux à la fois sans endommager le système vasculaire d’intérêt. Continuez jusqu’à ce que les artères soient complètement dépourvues de tissu adipeux parenchymateux.

Utilisez la pince numéro cinq pour transférer les artères nettoyées dans un nouveau tube avec un tampon HEPES frais et conservez-les sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour la digestion. Tout d’abord, ajoutez un milligramme de dispase et d’élastase à un tube microcentrifuge de deux millilitres. Ajouter deux millilitres de solution de dissociation, vortex, et incuber à 37 degrés Celsius jusqu’à dissolution complète.

Utilisez la pince numéro cinq pour transférer les artères nettoyées dans les tubes d’échantillonnage respectifs. Incuber les tubes à 37 degrés Celsius pendant une heure en agitant doucement par inversion toutes les 10 à 15 minutes. En attendant, ajoutez un milligramme de collagénase de type un par échantillon à de nouveaux tubes.

Après l’incubation, laissez les artères se déposer au fond du tube et transférez 500 microlitres du tampon du haut dans les tubes contenant de la collagénase. Vortex et retourner cette solution dans les tubes d’échantillonnage respectifs. Incuber les échantillons à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Assurez-vous que les artères se séparent en morceaux en secouant le tube à échantillon. À l’aide d’une pipette en verre, triturer vigoureusement le tissu digéré 10 à 15 fois pour dissocier mécaniquement les cellules. Passez les échantillons digérés à travers une passoire à cellules de 70 microns ou une crépine à tube de cytométrie en flux pour obtenir des suspensions unicellulaires.

Centrifuger la suspension unicellulaire et retirer le surnageant. Re-suspendre la pastille de cellule dans un millilitre de PBS avec 5% de BSA pendant 30 minutes. Ajouter un microlitre de coloration de viabilité cellulaire et incuber dans l’obscurité pendant 30 minutes.

Centrifuger la suspension cellulaire et remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 microlitres de PBS avec 1% de BSA. Ajouter les anticorps primaires conjugués à CD31 et CD45 et incuber sur une bascule au réfrigérateur pendant 15 minutes. Lavez les cellules en ajoutant un millilitre de PBS avec 1% de BSA directement à la suspension cellulaire.

Centrifuger la suspension cellulaire et remettre en suspension la pastille dans 200 microlitres de formaldéhyde à 1% avec 0,1% de BSA. Couvrir les tubes avec du papier d’aluminium et conserver au réfrigérateur jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la cytométrie en flux. Des préparations cellulaires obtenues à partir d’artères adipeuses sous-cutanées digérées ont été utilisées pour identifier les populations de cellules endothéliales à l’aide de la cytométrie en flux.

Les cellules CD45 négatives CD31 positives ont été identifiées comme des cellules endothéliales. La coloration de viabilité cellulaire n’a permis d’identifier que les cellules viables qui ont survécu au protocole d’isolement et de digestion avant la fixation. Pour identifier les différences dans l’expression des protéines membranaires et les cellules endothéliales du système vasculaire dépôt adipeux distinct, les cellules isolées ont été sondées pour détecter la présence d’acides gras translocase CD36.

Des cellules endothéliales CD36 positives ont été identifiées dans les cellules adipeuses sous-cutanées et mésentériques. La quantification de l’expression de CD36 et des cellules endothéliales sous-cutanées et mésentériques a révélé que le pourcentage de cellules endothéliales exprimant CD36 et l’intensité de l’expression de CD36 étaient plus élevés dans les cellules endothéliales sous-cutanées. Il est crucial de disséquer, d’identifier et de nettoyer soigneusement les artères.

Plus important encore, le protocole de digestion devrait produire un rendement suffisant de cellules viables pour les applications en aval. Après cette procédure, la population cellulaire isolée peut être utilisée pour des applications comprenant, mais sans s’y limiter, l’électrophysiologie, le profilage moléculaire et la génération de lignées cellulaires primaires pour le criblage de médicaments in vitro.