Capture de la conformation chromosomique à travers les échelles de longueur

Ce protocole détecte avec précision les caractéristiques de repliement des chromosomes sur plusieurs échelles de longueur avec un signal de fond faible. Par exemple, les interactions des amplificateurs promoteurs peuvent être analysées dans le contexte des compartiments chromosomiques. L’utilisation d’endonucléases de restriction contourne l’optimisation du niveau de digestion des matières premières.

Aucune sélection par isolement de gel n’est requise pour capturer les produits de ligature. Le problème le plus courant est la perte de cellules après la fixation du DSG et la capture de suffisamment d’ADN pour produire des bibliothèques de haute qualité. Pour commencer, aspirez le milieu avec une pipette Pasteur couplée à un piège à vide de la plaque de 150 millimètres contenant 5 par 10 aux sixièmes cellules.

Lavez les cellules deux fois avec 10 millilitres de HBSS. Pour réticuler les cellules, versez 23,125 millilitres de la solution de formaldéhyde à 1% dans la plaque de 15 centimètres. Incuber à température ambiante pendant 10 minutes, en berçant doucement l’assiette à la main toutes les deux minutes.

Ensuite, ajoutez 1,25 millilitre de glycine 2,5 molaires et agitez doucement la plaque pour éteindre la réaction de réticulation, avant d’incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Poursuivre l’incubation sur la glace pendant 15 minutes pour arrêter la réticulation. Grattez les cellules de la plaque avec un grattoir de cellule ou un policier en caoutchouc et transférez la suspension cellulaire dans un tube conique de 50 millilitres avec une pipette.

Centrifuger la suspension à 1 000 fois G pendant 10 minutes à température ambiante et éliminer le surnageant par aspiration. Lavez la pastille une fois avec 10 millilitres de solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco, ou DPBS. Ensuite, centrifugez à nouveau avant de procéder à la réticulation DSG.

Pour la réticulation avec DSG, remettre en suspension les cellules granulées dans 9,9 millilitres de DPBS. Ensuite, ajoutez 100 microlitres de DSG 300 millimolaires. Mélanger le tube par inversion et réticuler les cellules à température ambiante pendant 40 minutes sur un rotateur.

Après la réticulation, ajoutez 1,925 millilitre de glycine 2,5 molaire, inversez pour mélanger et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, centrifugez les cellules à 2 000 fois G pendant 15 minutes et remettez la pastille en suspension dans un millilitre d’albumine sérique bovine à 0,05% de DPBS avant de la transférer dans un tube de 1,7 millilitre. Centrifuger les cellules à 2 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius et jeter le surnageant.

Congeler la pastille dans de l’azote liquide avant de procéder à la capture de confirmation chromosomique. Resuspendre l’aliquote cellulaire réticulée dans un millilitre de tampon de lyse glacée contenant 10 microlitres de cocktail d’inhibiteurs de protéase et transférer dans un homogénéisateur Dounce pendant 15 minutes d’incubation sur glace. Déplacez lentement le pilon A de haut en bas 30 fois pour homogénéiser les cellules et incuber pendant une minute pour permettre aux cellules de refroidir avant 30 autres coups.

Après le dernier coup, transférez le lysat dans un tube de 1,7 millilitre. Centrifuger la suspension lysée à 2 500 fois G pendant cinq minutes. Jeter le surnageant et agiter ou vortex pour remettre en suspension la pastille humide.

Retirez autant de surnageant que possible pour obtenir une substance semblable à celle du yogourt avec un minimum de gruteaux. Remettez la pastille en suspension dans 500 microlitres de tampon de restriction glacé avant la centrifugation. Après le deuxième lavage, remettre en suspension la pastille dans 360 microlitres de tampon de restriction par pipetage après avoir ajouté environ 340 microlitres au volume de transfert de la pastille, selon la taille de la cellule.

Mettez de côté 18 microlitres de lysat pour tester l’intégrité de la chromatine, ou CI.To le lysat restant, ajoutez 38 microlitres de dodécylsulfate de sodium à 1% dans un tube de hi-C pour obtenir un volume total de 380 microlitres et mélangez soigneusement par pipetage sans introduire de bulles. Incuber les échantillons à 65 degrés Celsius sans agiter pendant 10 minutes pour ouvrir la chromatine. Ensuite, placez immédiatement le tube sur de la glace.

Après avoir préparé le mélange de digestion avec Triton X-100, ajoutez 107 microlitres de ce mélange dans le tube hi-C pour obtenir un volume total de 487 microlitres et digérez la chromatine pendant une nuit à 37 degrés Celsius dans un thermomélangeur avec agitation par intervalle. Le lendemain, transférer les échantillons à 65 degrés Celsius pendant 20 minutes pour désactiver l’activité endonucléase restante. Après avoir placé l’échantillon sur de la glace, mettez de côté 10 microlitres de contrôle de la digestion, ou DC, et conservez-les à quatre degrés Celsius.

Retirez la condensation du couvercle à l’aide d’une pipette ou en faisant tourner. Ensuite, ajoutez 58 microlitres de mélange de remplissage de biotine pour obtenir un volume total de 535 microlitres. Pipeter doucement sans former de bulles avant d’incuber à 23 degrés Celsius pendant quatre heures dans un thermomélangeur.

Après l’incubation, ajoutez 665 microlitres de mélange de ligature, ce qui fait que le volume de l’échantillon est de 1 200 microlitres. Mélanger l’échantillon par pipetage et incuber à 16 degrés Celsius pendant quatre heures dans un thermomélangeur. Ensuite, ajoutez 50 microlitres de protéinase-K en deux fractions dans le tube d’échantillon hi-C et incuber pendant la nuit à 65 degrés Celsius avec agitation par intervalle.

Pour la purification de l’ADN, ajoutez de l’éthanol glacé à 100% et centrifugez les tubes à 18 000 fois G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Retirer complètement le surnageant du côté non granulé et sécher l’échantillon à l’air pendant 10 minutes ou jusqu’à ce que les granulés soient visiblement secs. Une fois les granulés secs, solubilisez-les dans 450 microlitres de Tris à faible teneur en EDTA par pipetage ou tourbillonnage.

Transférer la suspension solubilisée dans une unité de filtration centrifuge de 0,5 millimètre, ou UFC, avec une coupure de poids moléculaire de trois kilodaltons. Centrifuger le CFU à la vitesse maximale pendant 10 minutes et jeter l’écoulement. Après le deuxième lavage, ajoutez 80 microlitres de Tris à faible EDTA dans la colonne.

Transformez la colonne en un nouveau tube de collecte pour deux minutes de centrifugation à vitesse maximale. Enfin, chargez les échantillons sur un gel d’agarose à 0,8%. Le gel d’agarose avec les résultats du titrage PCR a démontré que la plupart des bibliothèques nécessitent cinq à huit cycles d’amplification finale de la PCR.

La digestion cellulaire de la bibliothèque finale de PCR amplifiée, observée par des fragments plus petits sur un gel d’agarose, confirme la présence de jonctions de ligature appropriées et sert de contrôle de qualité avant le séquençage. Après séquençage, les données cartographiées ont montré que la combinaison de DpnII et de DdeI augmente considérablement les contacts à courte portée, comme l’ajout de DSG à la réticulation conventionnelle du formaldéhyde. Un signal amélioré a également pu être observé à de longues et courtes distances directement à partir de matrices d’interaction 2D.

Les signaux compartimentés sont CRISPR à longue distance et les points formés par les boucles de chromatine sont plus importants à courte distance. En plus du formaldéhyde, la réticulation avec le DSG diminue les ligatures aléatoires, améliorant ainsi la couverture relative dans le cis. Il est important de ne pas perdre de cellules pendant et après la réticulation.

Les granulés cellulaires peuvent être lâches ou invisibles, et les cellules peuvent adhérer aux extrémités des pipettes dans certains tampons.