Name: In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Découvrez un modèle entéroïde apical-out in vitro pour l'entérocolite nécrosante utilisant des entéroïdes intestinaux à polarité inversée. Cette méthode permet d'accéder à la surface apicale pour tester des thérapeutiques orales efficacement.

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Ce contenu relève de la seule responsabilité des auteurs et ne représente pas nécessairement les opinions officielles des National Institutes of Health. SC est soutenu par la subvention P20GM134973 des National Institutes of Health. KB est soutenu par une subvention de la Fondation de l’hôpital pour enfants (CHF) et de la Presbyterian Health Foundation (PHF). Nous remercions le Laboratoire de recherche en biologie moléculaire et cytométrie de l’OUHSC pour l’utilisation de l’installation centrale, qui a fourni l’imagerie confocale.

Toutes les procédures animales de cette étude ont été approuvées par le comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma. Des échantillons de commodité de l’intestin grêle provenant d’un primate non humain prématuré (PSN, gestation à 90%, babouin olive, Papio anubis) ont été obtenus après euthanasie pour une étude distincte (Protocole #101523-16-039-I).
1. Mise en place d’un modèle d’entéroïde à l’apocale NEC dans une boîte
<ol><li>Préparation des milieux et des traitements entéroïdes REMARQUE: Une fois préparé selon la technique aseptique standard, le support peut être conservé à 4 ° C jusqu’à 1 semaine.<ol><li>Préparer des milieux sans antibiotiques (AFM) en mélangeant 50 mL de milieux de croissance organoïdes humains avec 50 mL de supplément organoïde (voir le tableau des matières). Préparer 5 mM d’acide éthylènediaminetétraacétique/1x de solution saline tamponnée au phosphate (EDTA/PBS) en ajoutant 100 μL d’EDTA 0,5 M à 9 900 μL de PBS.</li>
		<li>Refroidir le mélange de jambon d’aigle modifié de Dulbecco F12 + 15 mM HEPES Buffer (DMEM/F12) à 2-8 °C.</li>
		<li>Préparer la solution mère de α TNF en mettant en suspension 100 μg de poudre de α TNF dans 1 mL de 1x PBS. Diluer davantage le stock de TNF-α à des concentrations de 20 ng/mL et 50 ng/mL en utilisant l’AFM comme solvant. Préparer la solution mère de LPS en suspendant 2 mg de LPS dans 1 mL de 1x PBS. Diluer davantage le LPS mère à 100 μg/mL et 200 μg/mL en utilisant l’AFM comme solvant.</li>
	</ol></li>
	<li>Inverser la polarité des entéroïdes 3D REMARQUE : La procédure suivante est destinée à l’inversion d’une seule plaque de culture tissulaire à fond plat de 24 puits en deux plaques de culture tissulaire à très faible fixation à 24 puits. Les plaques de culture tissulaire doivent être chauffées à 37 °C pendant au moins 30 minutes avant utilisation. La dérivation d’entéroïdes 3D basolatéraux-out a été réalisée comme décrit précédemment par de nombreux groupes35,36, avec de légères modifications pour les milieux (détaillé ci-dessus). La procédure générale de dérivation entéroïde ne diffère pas de celle des humains. En bref, les tissus excisés sont lavés, coupés en petits fragments et incubés dans un tampon de perturbation cellulaire. La solution cellulaire est ensuite passée à travers une crépine cellulaire de 70 μM, ce qui donne des cryptes qui sont plaquées à une densité élevée.<ol><li>Aspirer les milieux de chaque puits d’une plaque de 24 puits d’entéroïdes basolatéraux-out 3D établis.</li>
		<li>Ajouter 500 μL d’EDTA/PBS glacé de 5 mM à chaque puits de la plaque de 24 puits et perturber mécaniquement doucement l’extrait de membrane basale / dôme ECM en pipetant de haut en bas avec une pipette p200 d’au moins 5x-6x.</li>
		<li>Transférer le contenu de quatre puits dans un tube conique de 15 ml et ajouter 8 mL d’EDTA/PBS glacé dans le tube conique. Transférer les 20 puits restants de la même manière.</li>
		<li>Incuber des tubes coniques de 15 mL à 4 °C pendant 1 h sur une plate-forme rotative ou un agitateur à 330 tr/min. Après 1 h d’incubation, centrifuger les tubes coniques à 300 x g pendant 3 min à 4 °C. Retirer et jeter le surnageant de chaque tube.</li>
		<li>Combiner et laver les granulés de cellule avec 5 ml de DMEM/F12 et répartir la suspension cellulaire dans deux tubes coniques de 15 mL.</li>
		<li>Enduire les cellules par centrifugation à 300 x g pendant 3 min à 4 °C. Retirez le surnageant et ajoutez 12 ml d’AFM à chaque tube, en veillant à ce que les pastilles de la cellule soient remises en suspension.</li>
		<li>Pipeter 500 μL de la suspension entéroïde dans chaque puits de deux plaques de fixation ultra-basses de 24 puits.</li>
		<li>Incuber les plaques à 37 °C et 5% de CO 2 pendant2 à 5 jours ou jusqu’à ce que les entéroïdes aient inversé la polarité.</li>
		<li>Pour vérifier l’inversion entéroïde, établissez d’abord la coloration immunofluorescente de confirmation et le délai moyen d’inversion (~ 3 jours), puis confirmez l’inversion de polarité à l’aide d’une visualisation de base au microscope optique. Les entéroïdes de sortie apicole sont très cellulaires en apparence, tandis que les entéroïdes de sortie basolatérale sont souvent dominés par la présence d’une grande lumière centrale ou bourgeonnement (voir la figure supplémentaire 1). REMARQUE: Une fois la procédure normalisée, le taux de conversion en apical-out dépasse généralement 95%. L’utilisation d’entéroïdes à sortie apicale est conçue comme une expérience terminale, bien qu’il soit théoriquement possible de faire passer des entéroïdes à sortie apicale dans un petit nombre d’entéroïdes à sortie basolatérale.</li>
	</ol></li>
	<li>Apical-out NEC-in-a-dish REMARQUE: Une fois que les entéroïdes ont inversé la polarité, utilisez rapidement les cultures dans des expériences ultérieures, car leur longévité dans la conformation apicale n’a pas été confirmée au-delà de 3-4 jours. Pour le modèle NEC-in-dish suivant, les entéroïdes ont été traités pendant 24 heures, puis collectés immédiatement après et conservés pour des expériences en aval.<ol><li>Une fois que les entéroïdes ont visuellement inversé la polarité avec une efficacité d’au moins 95%, retirez les plaques de l’incubateur et recueillez huit puits d’une plaque de 24 puits dans un tube conique de 15 mL. Comme les entéroïdes à élimination apicale sont en suspension, il suffit de pipeter la solution entéroïde/média. Centrifuger le tube de 15 mL à 300 x g pendant 5 min à 4 °C.</li>
		<li>Une fois les cellules enrobées, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 4 mL d’AFM mélangé au volume désiré (10 μL ici pour correspondre au volume de traitement le plus élevé ajouté) de 1x PBS (témoin).</li>
		<li>Pipeter 500 μL de suspension entéroïde/PBS/AFM dans huit puits d’une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits et incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
		<li>Répétez les étapes 1.3.1.-1.3.3. pour les traitements au TNF-α (20 ng/mL et 50 ng/mL) et au LPS (100 μg/mL et 200 μg/mL) à la normoxie. Pour tous les traitements contre l’hypoxie, répéter les étapes 1.3.1.-1.3.3., mais placer la plaque dans un incubateur séparé à 37 °C, 5 % de CO2 et 1 % d’O2 pendant 24 h. NOTE: Étape 1.3.4. peut être effectuée simultanément avec les étapes 1.3.1.-1.3.3, mais, pour plus de clarté, la procédure ci-dessus a été séparée par traitement afin de réduire la complexité.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Coloration par immunofluorescence et microscopie confocale
<ol><li>Préparation de solutions de coloration<ol><li>Préparer le Triton X-100 à 0,1 % en mélangeant 7 μL de Triton X-100 dans 1 PBS jusqu’à obtenir un volume final de 7 mL. Préparer le PBST (PBS-Tween) en ajoutant 30 μL de Tween-20 à 1x PBS pour obtenir un volume final de 30 mL.</li>
		<li>Préparer 10 % de sérum normal d’âne (PDN)/PBST en ajoutant 700 μL de NDS à 6,3 mL de PBST. Préparer 1 % de PDN/PBST en ajoutant 70 μL de NDS au PBST jusqu’à un volume final de 7 mL. REMARQUE: Le sérum d’âne a été utilisé ici pour établir une corrélation avec l’hôte anticorps secondaire. Cependant, les espèces de sérum bloquant doivent correspondre aux espèces d’anticorps secondaires afin de bloquer correctement la liaison non spécifique.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration (Jour 1)<ol><li>Transférer le contenu de quatre puits d’une plaque de 24 puits dans un tube microcentrifuge de 1,5 mL. Répéter pour tous les puits/traitements souhaités, chaque traitement étant effectué dans un tube séparé. Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Une fois les entéroïdes enrobés, retirez le surnageant.</li>
		<li>Resuspendre les pastilles de la cellule dans 300 μL de fixateur de formaldéhyde à 4% pendant 30 min à température ambiante (RT). Après 30 min, centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C, retirer le surnageant et laver la pastille avec 500 μL de RT 1x PBS stérile.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Retirer le surnageant et ajouter 500 μL de Triton X-100 à 0,1%, et laisser reposer pendant 1 h à TA.</li>
		<li>Après 1 h, centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant. Laver avec 500 μL de 1x PBS et placer les tubes sur un rotateur ou un agitateur à 200 tr/min pendant 15 min à 2-8 °C. Répétez cette opération un total de 4x.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant. Ajouter 500 μL de NDS/PBST à 10 % et incuber à TA pendant 45 min. Pendant l’incubation, préparer des solutions d’anticorps primaires en combinant 20 μL d’anticorps anti-villosités recombinants, 10 μL d’anticorps E-cadhérine et 1970 μL de NDS/PBST à 1 % pour huit puits d’une plaque de 24 puits.</li>
		<li>Après 45 min d’incubation, centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Placez les tubes sur de la glace. Retirer le surnageant et le remplacer par 250 μL de solution d’anticorps primaires. Incuber les tubes pendant une nuit à 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloration (Jour 2)<ol><li>Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C et retirer le surnageant. Ajouter 250-500 μL de PBST à chaque tube, selon la taille de la pastille, et placer sur le rotateur ou l’agitateur à 200 tr/min pendant 1 h à 2-8 °C. Répétez le lavage PBST 4x.</li>
		<li>Préparer la solution d’anticorps secondaires en ajoutant 52 μL d’IgG anti-lapin Cy3 (H + L) à 50% de glycérol et 5,2 μL d’âne anti-souris vert fluorescent 488 anticorps secondaires à 5142,8 μL de NDS/PBST à 1%.</li>
		<li>Après le dernier lavage et centrifugation PBST, retirer le surnageant des tubes. Distribuer 200 μL de solution d’anticorps secondaires à chaque tube et incuber dans l’obscurité pendant une nuit à 2-8 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage d’entéroïdes apicals tachés (Jour 1)<ol><li>Apportez à TA un support à base de glycérol contenant un colorant nucléaire bleu pendant 1 h.</li>
		<li>Centrifuger les tubes à 300 x g pendant 4 min à 4 °C. Retirer 100 μL du surnageant et remettre en suspension les cellules dans les ~100 μL restants du surnageant. Transférer la suspension cellulaire dans des tubes de 0,5 mL.</li>
		<li>Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 s pour granuler les cellules. Retirez le surnageant et remettez en suspension les pastilles cellulaires dans 100 μL de coloration d’acide nucléique rouge lointain. Incuber les tubes à TA pendant 10 min.</li>
		<li>Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 s pour granuler les cellules. Retirer le surnageant et remettre en suspension les pastilles de la cellule dans 100 μL de 1x PBS. Répétez pour un deuxième lavage.</li>
		<li>Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 s pour granuler les cellules et éliminer 70 μL du surnageant. Remettez en suspension les cellules dans le volume restant du PBS et transférez le contenu sur une feuille de couverture étiquetée (24 mm x 60 mm).</li>
		<li>Appliquez 75 μL de support directement sur l’échantillon et retirez les bulles à l’aide d’un embout de pipette. Laisser durcir les lames de couverture pendant la nuit (18-24 h) à RT dans l’obscurité.</li>
	</ol></li>
	<li>Montage d’entéroïdes apicals tachés (Jour 2)<ol><li>Après séchage pendant la nuit, appliquez une fine couche (~ 15 μL) de glycérol sur les lames de couverture. Montez le couvercle sur la lame de verre et appuyez doucement en place. Appuyez pour supprimer les bulles entre le bordereau de couverture et la glissière.</li>
		<li>Laisser la lame-couverture durcir à RT dans l’obscurité pendant au moins 2 heures, avant d’imager à un grossissement de 20x avec un microscope confocal. Pour la visualisation microscopique des entéroïdes à l’aide de diverses méthodes d’acquisition confocale, se reporter à Lallemant et coll.37.</li>
	</ol></li>
	<li>Quantification par immunofluorescence REMARQUE: Cette méthode détermine la fluorescence totale corrigée en supprimant le signal de fond à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/).<ol><li>Ouvrez les images confocales dans ImageJ et délimitez la zone souhaitée avec l’outil de région d’intérêt (ROI).</li>
		<li>Définissez les paramètres définis par l’utilisateur en accédant à Analyser > Définir les mesures. Sélectionnez Zone > Densité intégrée > Valeur moyenne de gris sous l’onglet Paramètres.</li>
		<li>Naviguez jusqu’à Analyser > mesurer. Une fenêtre pop-up apparaîtra contenant les mesures. Copiez et collez ces mesures dans une feuille de calcul.</li>
		<li>Pour soustraire le signal d’arrière-plan, sélectionnez une petite zone non fluorescente de l’image. Accédez à Analyser > mesure pour cette région. Une fenêtre pop-up apparaîtra contenant les mesures. Copiez et collez la sortie dans une feuille de calcul.</li>
		<li>Multipliez la surface de la cellule sélectionnée par la fluorescence moyenne des lectures de fond et soustrayez la somme de la densité intégrée pour calculer la fluorescence totale corrigée des cellules (CTCF). Répétez les étapes ci-dessus pour toutes les images d’intérêt, tout en conservant les enregistrements dans une feuille de calcul ou un logiciel statistique (voir le tableau des matériaux).</li>
	</ol></li>
</ol>3. Viabilité des cellules NEC-in-a-dish
<ol><li>Traitements entéroïdes<ol><li>Établir un modèle de NEC-in-dish apical-out pendant 24 h, comme à l’étape 1.</li>
		<li>Décongeler le réactif de dosage de viabilité cellulaire pendant une nuit à 4 °C. Le jour du dosage, porter le réactif à TA 30 min avant utilisation. Retourner le réactif pour mélanger.</li>
		<li>Avant d’effectuer l’essai, retirez 100 μL de milieu de chaque puits, en laissant les 400 μL restants. Ajouter 400 μL de réactif d’essai de viabilité cellulaire à chaque puits.</li>
		<li>Bien mélanger vigoureusement le contenu sur un agitateur à plaques à TA pendant 5 min à 200 tr/min pour induire la lyse cellulaire. Après agitation, incuber la plaque à TA pendant 25 minutes supplémentaires.</li>
		<li>Après 25 minutes d’incubation, mélanger le contenu d’un puits par pipetage et transférer 200 μL des 800 μL dans un seul puits d’une plaque opaque à fond clair en polystyrène opaque de 96 puits. Répéter pour les 600 μL restants, en créant quatre répétitions techniques par puits. Transférer ainsi le contenu restant de chaque puits de la plaque de 24 puits dans une plaque de 96 puits.</li>
		<li>À l’aide d’un lecteur de plaques capable de luminescence, enregistrez les valeurs à 0,25 ms d’intégration et comparez les valeurs relatives entre les traitements. Alternativement, comparez la luminescence de traitement à une norme d’adénosine triphosphate (ATP).</li>
	</ol></li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer et n’ont aucun conflit d’intérêts.

Le développement récent de modèles entéroïdes dérivés de cryptes épithéliales intestinales permet d’obtenir un tissu in vitro plus pertinent sur le plan physiologique dans lequel étudier la pathogenèse de l’entérocolite nécrosante. Bien qu’ils incluent tous les principaux types de cellules différenciées de l’épithélium intestinal, les entéroïdes 3D sont toujours soumis à plusieurs limitations importantes. Les entéroïdes conventionnels à sortie basolatérale sont suspendus dans des dômes d’hydrogel ECM 3D, dont la...

L’entérocolite nécrosante (ECN), une maladie inflammatoire grave de l’intestin grêle survenant chez jusqu’à 10 % des nouveau-nés prématurés, est généralement associée à une morbidité et une mortalité élevées 1,2. Les taux de mortalité approchant les 50% chez les nourrissons de très faible poids de naissance (<1500 g), nécessitant une intervention chirurgicale, ne sont pas rares3. Bien que l’étiologie exacte de l’ECN ne soit pas actuellement comprise, on pense que les facteurs de risque, tels que l’alimentation au lait maternisé, s’ajoutent à des anomalies physiologiques, telles que la dysbiose, un épithélium intestinal immature et une barrière intestinale dysfonctionnelle, dans le développement de la maladie 2,4. Malgré des efforts importants, peu de progrès ont été réalisés dans la prévention ou le traitement de l’ECN au cours de la dernière décennie5. Une nouvelle méthode in vitro pour étudier l’ECN et le dysfonctionnement de la barrière épithéliale intestinale associée est nécessaire pour faire progresser la compréhension de la pathogenèse de la maladie, car les résultats des modèles animaux ont, jusqu’à présent, mal transposé au chevet du patient6.
Un certain nombre de modèles in vitro ont été utilisés pour étudier les mécanismes en jeu pendant l’ECN. La lignée cellulaire épithéliale intestinale humaine, Caco-2, est parmi les modèles in vitro les plus couramment utilisés de NEC 7,8. Les cellules Caco-2 émulent les caractéristiques morphologiques de l’intestin grêle, mais, en tant que lignée cellulaire, ne se différencient pas dans la grande variété de types de cellules in vivo, y compris les cellules caliciformes productrices de mucus, nécessaires pour un modèle hautement traduisible. HT-29-MTX, cellules d’adénocarcinome du côlon humain, comprennent un phénotype mixte d’entérocyte et de cellules caliciformes, mais manquent encore de types cellulaires à base de cryptes de l’épithélium intestinal9. IEC-6 et IEC-18 sont des lignées cellulaires non transformées avec une morphologie immature semblable à une crypte iléale mais ne sont pas dérivées de tissus humains, ce qui limite leur capacité de traduction. Les lignées cellulaires intestinales FHs 74-Int et H4 sont dérivées de tissus fœtaux humains et ne forment pas de jonctions serrées ou de monocouches polarisées10,11, et sont donc immatures par rapport aux nourrissons les plus prématurés sensibles à l’ECN. En règle générale, les modèles in vitro d’ECN utilisent des traitements lipopolysaccharidiques (LPS) pour induire le récepteur 4 de type Toll (TLR4), un récepteur majeur initiant l’inflammation intestinale dans NEC12. Les dommages induits par le traitement des espèces réactives de l’oxygène (ROS), généralement par le peroxyde d’hydrogène, sont souvent utilisés pour induire des dommages oxydatifs de type NEC et l’apoptose13,14. En tant que principal moteur de l’inflammation intestinale, le facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α), un composant en aval de la signalisation inflammatoire TLR4, est également couramment utilisé dans ces modèles in vitro pour imiter la pathogenèse in vivo 15.
Les organoïdes, générés à partir de cellules souches pluripotentes inductibles (CSPi), ont gagné en popularité en tant que modèle in vitro de l’intestin en raison de leur capacité à récapituler l’architecture complexe in vivo et la composition de type cellulaire du tissu dont ils sont dérivés16,17. Un système in vitro apparenté, les entéroïdes, sont des organoïdes dérivés de cryptes intestinales réséquées qui sont plus faciles à établir et à maintenir que les organoïdes dérivés de CSPi. Les entéroïdes sont généralement cultivés dans une matrice extracellulaire (ECM) tridimensionnelle (3D) avec un accès expérimental limité à la surface cellulaire basolatérale. Des méthodes, telles que la microinjection18,19, ont été développées pour surmonter cette barrière à la surface apicale, mais l’accumulation de débris cellulaires et de mucus dans la lumière rend la micro-injection à la fois techniquement difficile et incohérente. Comme les plates-formes de micro-injection robotique personnalisées ne sont pas largement accessibles20, la variabilité de la capacité technique et de la technique générale d’un laboratoire à l’autre devient une variable importante à surmonter avec les protocoles de micro-injection. Les monocouches bidimensionnelles (2D) dérivées d’entéroïdes 3D dissociés, comprenant encore tous les principaux types cellulaires de l’épithélium intestinal, permettent d’accéder à la surface apicale mais ont toujours été difficiles à maintenir sans couche nourricière de myofibroblastes mésenchymateux21. Alors que des supports perméables à la culture cellulaire peuvent être utilisés pour accéder aux côtés apical et basolatéral des monocouches entéroïdes sans utiliser de myofibroblastes sous-jacents, ces inserts nécessitent l’excision et le montage de la membrane avant utilisation avec des modalités telles que la microscopie confocale, ce qui entraîne un processus plus exigeant et plus difficile sur le plan technique lors de l’utilisation de méthodes de microscopie traditionnelles22. NEC a été modélisé in vitro en utilisant des entéroïdes 3D traditionnels 23,24,25 et des supports perméables 26,27, et l’inflammation intestinale a récemment été reproduite avec des modèles intestin-sur-puce 28,29. Bien que les modèles gut-on-a-chip intégrant la microfluidique soient, de loin, les modèles les plus avancés et les plus traduisibles, cette technologie est coûteuse, complexe et inaccessible à la plupart des chercheurs30.
Les progrès récents dans les techniques d’entéroïdes apicals ont permis un accès plus facile à la surface apicale des entéroïdes 3D sans risquer d’endommager l’intégrité structurelle de l’épithélium in vitro 31,32,33. Les entéroïdes à sortie apicale partagent la composition de type cellulaire et la fonction barrière de l’épithélium intestinal in vivo, mais, contrairement aux entéroïdes 3D typiques, les surfaces apicales de ces cellules font face au milieu de culture, ce qui permet des études plus pertinentes sur le plan physiologique sur l’absorption des nutriments, l’infection microbienne et la sécrétion luminale31. Un avantage supplémentaire des entéroïdes à élimination apicale est la capacité de distribuer de manière homogène des agents expérimentaux aux entéroïdes. Il n’est pas nécessaire de faire varier les volumes de traitement en fonction de la taille des entéroïdes, comme c’est le cas avec la micro-injection, et la capacité de maintenir ces entéroïdes en culture en suspension annule toute interférence ECM sur la diffusion expérimentale de l’agent32.
L’entérocolite nécrosante est une maladie multifactorielle impliquant plusieurs types de cellules épithéliales intestinales et divers facteurs environnementaux et physiopathologiques34. La composition cellulaire variée des entéroïdes intestinaux est une nette amélioration par rapport aux monocultures dans la modélisation d’une maladie complexe telle que l’ECN. Il est intéressant de noter que, alors qu’une seule exposition inflammatoire est souvent suffisante pour induire des dommages dans les monocultures in vitro , les entéroïdes, comme avec les modèles murins23, semblent nécessiter au moins deux composants inflammatoires pour induire des dommages de type NEC6. Ici, nous présentons un modèle de NEC-in-a-dish apical-out, utilisant des entéroïdes apical-out en combinaison avec l’hypoxie (une caractéristique clinique importante de NEC6) et le LPS ou le TNF-α, comme un modèle in vitro amélioré et physiologiquement plus pertinent pour étudier les réponses épithéliales à l’inflammation de type NEC et, potentiellement, identifier des cibles thérapeutiques. Nous décrivons un protocole pour inverser la polarité des entéroïdes 3D de l’intestin grêle, ainsi qu’un protocole de coloration immunofluorescente pour identifier la perturbation de la barrière épithéliale et les altérations de l’expression des protéines jonctionnelles. Enfin, nous démontrons en outre un test de viabilité entéroïde simple pour déterminer l’impact de notre modèle NEC-in-a-dish à double coup et à sortie apicale.

<table><tbody><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8,0</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575-020</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>Tube conique 15 mL</td><td>VWR</td><td>89039-666</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Viability Assay</td><td>Promega</td><td>G9681</td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Microplaques à 24 puits à fixation ultra-faible</td> Fisher <td>Scientific</td><td>07-200-602</td><td></td></tr><tr><td>Verre de protection 24 mm x 60 mm</td><td>Thermo Scientific</td><td>102460</td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé croisé, Alexa Fluor 488 Thermo</td><td>Scientific</td><td>A-21202</td><td></td></tr><tr><td>Donkey Anti-Rabbit IgG Igmate, conjugué Cy3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AP182C</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium/Nutrient Mixture Ham’s F-12 (DMEM-F12) avec tampon HEPES de 15 mM</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>36254</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-cadhérine (7H12)</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-19051</td><td></td></tr><tr><td>Solution de formaldéhyde 4 %, tamponnée, pH 6,9</td><td>Millipore Sigma</td><td>1004960700</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56-81-5</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>Fidji</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>06010</td><td></td></tr><tr><td>Microscope confocal Leica SP8</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lipopolysaccharides d’Escherichia coli O111 :B4, purifiés par filtration sur gel Chromatographie</td><td>Millipore Sigma</td><td>L3012-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td></td></tr><tr><td>Sérum d’âne normal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>566460</td><td></td></tr><tr><td>Nunc MicroWell 96 puits, traité Nunclon Delta, microplaque à fond plat</td><td>Thermo Scientific</td><td>136101</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solution saline tamponnée au phosphate), 1x [-] calcium, magnésium, pH 7,4</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>Prolonge Verre Antifade Mountant avec NucBlue</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36983</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-Villin recombinant [SP145]</td><td>Abcam</td><td>ab130751</td><td></td></tr><tr><td>Protéine TNF-&alpha humaine recombinante 100 &micro ; g</td><td>Bio-Techne</td><td>210-TA-100/CF</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax iD3 Lecteur de microplaques multimode</td><td>Dispositifs</td><td></td><td></td>moléculaires</tr><tr><td>Thermo Forma Série II Incubateur trigaz à chemise d’eau, 184L</td><td>Fisher Scientific</td><td>3140</td><td></td></tr><tr><td>TO-PRO-3 Iodure (642/661)</td><td>Thermo Scientific</td><td>T3605</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Tubes, 0,5 mL, bouchon plat</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB0350</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9005-64-5</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

In Vitro Apical-Out Enteroid Model of Necrotizing Enterocolitis

L’entérocolite nécrosante (ECN) est une maladie dévastatrice qui touche les nouveau-nés prématurés, caractérisée par une inflammation intestinale et une nécrose. Les entéroïdes sont récemment apparus comme un système prometteur pour modéliser les pathologies gastro-intestinales. Cependant, les méthodes actuellement utilisées pour la manipulation entéroïde n’ont pas accès à la surface apicale de l’épithélium (tridimensionnel [3D]) ou sont longues et gourmandes en ressources (monocouches bidimensionnelles [2D]). Ces méthodes nécessitent souvent des étapes supplémentaires, telles que la micro-injection, pour que le modèle devienne physiologiquement transposable. Ici, nous décrivons un protocole physiologiquement pertinent et peu coûteux pour étudier l’ECN in vitro en inversant la polarité entéroïde, ce qui donne à la surface apicale tournée vers l’extérieur (apical-out). Un protocole de coloration immunofluorescente pour examiner l’intégrité de la barrière entéroïde et l’expression des protéines jonctionnelles après une exposition au facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) ou au lipopolysaccharide (LPS) dans des conditions normoxiques ou hypoxiques est également fourni. La viabilité des entéroïdes 3D exposés au LPS normoxique ou hypoxique ou au TNF-α pendant 24 heures est également évaluée. Les entéroïdes exposés au LPS ou au TNF-α, en combinaison avec l’hypoxie, présentaient une perturbation de l’architecture épithéliale, une perte de l’expression de la protéine de jonction adhérente et une réduction de la viabilité cellulaire. Ce protocole décrit un nouveau modèle d’ECN dans une boîte qui présente une plate-forme physiologiquement pertinente et rentable pour identifier les cibles épithéliales potentielles pour les thérapies NEC et étudier la réponse intestinale prématurée aux traitements.

L’utilisation d’entéroïdes pour modéliser l’inflammation intestinale, même dans le contexte d’une entérocolite nécrosante, est maintenant courante. Cependant, la plupart des méthodes actuellement utilisées soit n’ont pas accès à la surface apicale des entéroïdes, ce qui annule la pertinence physiologique des composés destinés à une utilisation éventuelle comme traitements oraux, soit sont techniquement difficiles et prennent beaucoup de temps, comme dans le cas des monocouches dérivées d’entéroïdes. Pour augmenter l’util...

Ce protocole décrit un modèle apico-out d’entérocolite nécrosante (ECN) dans une boîte utilisant des entéroïdes intestinaux grêles à polarité inversée, permettant l’accès à la surface apicale. Nous fournissons un protocole de coloration immunofluorescente pour détecter la perturbation épithéliale liée à l’ECN et une méthode pour déterminer la viabilité des entéroïdes à sortie apicale soumis au protocole NEC-in-a-dish.

In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

Necrotizing enterocolitis (NEC) is a devastating disease affecting preterm infants, characterized by intestinal inflammation and necrosis. Enteroids have ...

Ce protocole décrit le premier modèle apical-out dans une boîte et constitue une amélioration critique par rapport aux modèles entéroïdes latéraux basaux dans une boîte lors de l’établissement de la modélisation in vitro de thérapies potentielles destinées à une administration orale. Cette méthode permet d’accéder à la surface apicale des entéroïdes. Les composés peuvent être ajoutés aux milieux cellulaires et les composés sont absorbés par voie apicale comme ils le seraient in vivo.Les chercheurs intéressés par l’établissement d’un système in vitro d’inflammation intestinale pour tester des thérapies orales potentielles peuvent trouver cette technique particulièrement utile. Les tissus provenant de différents âges et espèces peuvent nécessiter une normalisation plus poussée. Ainsi, les patients tout en établissant des temps d’inversion de polarité peuvent être nécessaires.Pour inverser la polarité des entéroïdes 3D, aspirez les milieux de chaque puits d’une plaque de 24 puits d’entéroïdes basolatéraux 3D établis. Ajoutez 500 microlitres de cinq millimolaires glacés, d’EDTA ou de PBS à chaque puits d’une plaque de 24 puits et perturbez doucement mécaniquement l’extrait de membrane basale ou le dôme de matrice extracellulaire en pipetant de haut en bas cinq à six fois avec une pipette P 200. Transférer le contenu de quatre puits dans un tube chronique de 15 millilitres.Ajoutez ensuite huit millilitres de PBS glacé à l’EDTA dans le tube. Transférer les 20 puits restants de la même manière. Incuber les tubes à quatre degrés Celsius pendant une heure sur une plate-forme rotative ou un agitateur à 330 tr / min.Après incubation, centrifuger les tubes et jeter le surnageant de chaque tube. Mélanger et laver les granulés avec cinq millilitres de DMEM F12. Ensuite, centrifugez la suspension cellulaire et retirez le surnageant avant d’ajouter 12 millilitres de milieu sans antibiotiques dans le tube en veillant à ce que les granulés cellulaires soient remis en suspension.Pippet 500 microlitres de la suspension entéroïde dans chaque puits d’une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits. Incuber la plaque à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone pendant deux à cinq jours ou jusqu’à ce que les entéroïdes aient inversé la polarité. Le premier jour, en vous abstenant, transférer le contenu de quatre puits d’une plaque de 24 puits dans un tube microcentrifuge de 1,5 millilitre.Répéter pour tous les puits souhaités avec chaque traitement dans un tube séparé. Centrifuger les tubes et remettre en suspension la pastille dans 300 microlitres de 4% de fixateur d’aldéhyde à température ambiante. Après 30 minutes, lavez les granulés avec 500 microlitres de PBS.Ajouter 500 microlitres de 0,1% Triton X 100 aux tubes. Incuber les tubes pendant une heure à température ambiante. Ensuite, placez les tubes sur un rotateur ou un agitateur à 200 tr / min pendant 15 minutes à deux à huit degrés Celsius.Après la dernière incubation, ajouter 500 microlitres de NDS à 10% dans du PBS T et incuber à température ambiante pendant 45 minutes. Pendant l’incubation, préparer la solution d’anticorps primaires. Le lendemain, ajoutez 250 à 500 microlitres de PBS T aux tubes en fonction de la taille de la pastille, et placez-les sur le rotateur ou le shaker à 200 tr / min pendant une heure à deux à huit degrés Celsius.Ajouter 200 microlitres de la solution d’anticorps secondaire et incuber les tubes à deux à huit degrés Celsius dans l’obscurité. Le lendemain, procédez au montage des entéroïdes apical colorés en faisant tourner les tubes et en retirant 100 microlitres de surnageant. Remettez les cellules en suspension dans les 100 microlitres de surnageant restants et transférez la suspension cellulaire dans des tubes de 500 microlitres.Centrifuger les tubes dans une mini-centrifugeuse pendant 20 secondes. Retirez le surnageant et remettez les pastilles en suspension dans 100 microlitres de coloration d’acide nucléique rouge à température ambiante. Après 20 minutes d’incubation, centrifuger les cellules et remettre les granulés en suspension dans 100 microlitres de PBS.Après le deuxième lavage et la centrifugation, retirez 70 microlitres du surnageant et remettez les granulés en suspension dans le volume restant de PBS. Ensuite, transférez la suspension cellulaire sur un couvercle étiqueté de 24 x 60 millimètres. Appliquez 75 microlitres de support directement sur l’échantillon et retirez les bulles avec un embout de pipette.Après une nuit de durcissement dans l’obscurité, appliquez une fine couche de glycérol sur les feuillets de couverture, puis montez les feuillets de couvercle sur la lame de verre et appuyez doucement en place. Appuyez pour supprimer les bulles entre le bordereau de couverture et la glissière. Laissez le couvercle reposer à température ambiante dans l’obscurité pendant deux heures avant d’imager les entéroïdes à un grossissement de 20 fois avec un microscope confocal.Pour les traitements entéroïdes, établir une entérocolite nécrosante apicale dans un modèle de plat pendant 24 heures, comme décrit dans le manuscrit du texte. Avant d’effectuer le test, retirez 100 microlitres de média de chaque puits en laissant les 400 microlitres restants. Ajoutez 400 microlitres de réactif d’essai de viabilité cellulaire à chaque puits.Mélanger vigoureusement le contenu sur une plaque agitateur pendant cinq minutes à 200 RPM pour induire la lyse cellulaire. Ensuite, transférez 200 microlitres dans un seul puits d’une plaque à fond clair de 96 puits. Répétez pour les 600 microlitres restants en créant quatre réplications techniques par puits.À l’aide d’un lecteur de plaques capable de luminescence, enregistrez les valeurs à 0,25 milliseconde d’intégration et comparez les valeurs relatives entre les traitements. La coloration représentative par immunofluorescence du contrôle a confirmé la localisation apicale des noyaux vers la lumière et la détection du méchant au bord externe de l’épithélium. Par rapport au contrôle, l’exposition au lipopolysaccharide, à la nécrose tumorale alpha ou à l’hypoxie seule n’a pas induit de changements manifestes dans la morphologie cellulaire globale E-cadhérine ou la localisation du méchant ou l’intensité fluorescente.Le traitement par lipopolysaccharide ou nécrose tumorale alpha en combinaison avec l’hypoxie a perturbé l’architecture épithéliale et a démontré une perte significative de jonction d’adhérence et d’expression de la protéine de bordure de brosse révélée par la perte de l’audition ECA et la coloration du méchant. La viabilité de la cellule apicale a été déterminée dans des conditions normoxiques ou hypoxiques. Dans des conditions normoxiques, par rapport au lipo polysaccharide témoin ou à la nécrose tumorale, la nécrose alpha n’a pas affecté de manière significative la viabilité cellulaire des entéroïdes.Cependant, des réductions significatives de la viabilité ont été observées dans le lipopolysaccharide ou la nécrose tumorale alpha en combinaison avec l’hypoxie par rapport à l’hypoxie seule. Tout en établissant un modèle apical dans un plat. N’oubliez pas de garder l’EDTA dans la suspension cellulaire glacée.Cela améliorera l’inversion de polarité et garantira que tous les ECM sont correctement liquéfiés et retirés. D’autres applications en aval telles que QPCR, RNA-seq, Western blot ou évaluations fonctionnelles de la perméabilité de la barrière peuvent être effectuées davantage pour caractériser la réponse à la signalisation inflammatoire dans l’hypoxie.

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Cette vidéo démontre le développement de la maladie d’entérocolite nécrosante dans un modèle d’entéroïde néonatal d’origine humaine induit par un traitement par lipopolysaccharides. Ce modèle permet d’étudier la physiopathologie intestinale.

Induction de l’entérocolite nécrosante dans un modèle d’entérocolite épithéliale humaine

Enteroids sont en train de devenir un nouveau modèle dans l’étude des maladies humaines. Le protocole décrit comment simuler un modèle enteroid de l’entérocolite nécrosante humain utilisant lipopolysaccharide (LPS) traitement d’enteroids produit du tissu néonatal. Enteroids recueillis montrent des modifications inflammatoires semblables à ceux vus dans l’entérocolite nécrosante humaine.

Un nouveau modèle de Enteroid épithéliales humaines d’entérocolite nécrosante

L’entérocolite nécrosante (CEN) est la maladie gastro-intestinale (GI) la plus grave qui survient souvent chez les prématurés, en particulier les nourrissons de très faible poids à la naissance, avec une mortalité élevée et une pathogenèse incertaine. La cause de la CEN peut être liée à des anomalies inflammatoires du système de régulation immunitaire. Un modèle animal NEC est un outil indispensable pour la recherche sur le système immunitaire contre les maladies NEC. Les modèles animaux NEC...

Un modèle murin BALB/c néonatal d’entérocolite nécrosante

Ce protocole décrit une méthode pour établir et effectuer un essai de plaie par égratignures sur des monocouches bidimensionnelles (2D) dérivées d’entéroïdes tridimensionnels (3D) isolés de l’iléon de primates non humains.

Effet de l’acide hyaluronique 35 kDa sur un modèle in vitro de lésion prématurée de l’intestin grêle prématuré et cicatrisation à l’aide de monocouches dérivées d’entéroïdes

Ce protocole détaille l’établissement d’entéroïdes, un modèle intestinal tridimensionnel, à partir de tissu intestinal fœtal. L’imagerie immunofluorescente de biomarqueurs épithéliaux a été utilisée pour la caractérisation du modèle. L’exposition apicale aux lipopolysaccharides, une endotoxine bactérienne, à l’aide d’une technique de micro-injection a induit une perméabilité épithéliale d’une manière dose-dépendante mesurée par la fuite de dextrane fluorescent.

Test de perméabilité épithéliale dans les entéroïdes dérivés du tissu fœtal

Le présent protocole décrit une méthode qui utilise le jaune de lucifer dans un modèle entéroïde apical-out pour déterminer la perméabilité intestinale. Cette méthode peut être utilisée pour déterminer la perméabilité paracellulaire chez les entéroïdes qui modélisent les maladies inflammatoires de l’intestin telles que l’entérocolite nécrosante.

Détermination de la perméabilité intestinale à l’aide du jaune de Lucifer dans un modèle entéroïde apical-out

Escherichia coli provoque une septicémie chez les nouveau-nés qui ingèrent la bactérie au moment de la naissance. Le processus impliqué dans la capacité d’E. coli à se déplacer des voies entériques à la circulation sanguine est mal compris. Ce modèle in vitro évalue la capacité des souches d’E. coli à traverser les cellules épithéliales intestinales.

Évaluation de la transcytose intestinale d’isolats néonatals de bactériémie à Escherichia coli

Ce protocole décrit un modèle in vitro d’entérocolite nécrosante (NEC), qui peut être utilisé pour des études mécanistiques de la pathogenèse de la maladie. Il est doté d’une puce microfluidique ensemencée d’entéroïdes intestinaux dérivés de l’intestin néonatal humain, de cellules endothéliales et du microbiome intestinal d’un nouveau-né atteint d’une NEC sévère.

Modèle microfluidique d’entérocolite nécrosante incorporant des entéroïdes intestinaux néonatals humains et un microbiome dysbiotique

Ce protocole décrit un modèle murin néonatal d’entérocolite nécrosante (ECN) et l’isolement ultérieur des cellules immunitaires de la lamina propria de l’intestin grêle murin néonatal.

Un modèle murin néonatal d’entérocolite nécrosante et d’isolement de la lamina propria pour le profilage des cellules immunitaires

Nous démontrons comment mettre en place...

Transplantation de cellules souches dans un In vitro Simulation d&#39;ischémie / reperfusion modèle

Découvrez un modèle entéroïde apical-out in vitro pour l'entérocolite nécrosante utilisant des entéroïdes intestinaux à polarité inversée. Cette méthode permet d'accéder à la surface apicale pour tester des thérapeutiques orales efficacement.

In vitro Modèle entéroïde apical-out de l’entérocolite nécrosante

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