Application cohérente de spectroscopie Raman anti-Stokes (CARS) pour l’imagerie de la myélinisation dans les tranches de cerveau

Cette technique permet d’imager la myéline dans les coupes de tissu cérébral. La myélinisation joue un rôle important dans la conduite des potentiels d’action et la compréhension de la myéline nous aidera à comprendre le fonctionnement du cerveau. Le principal avantage de la technique CARS par rapport à la microscopie électronique par exemple, est que CARS est une technique de microscopie optique et peut facilement être combinée avec d’autres images de fluorescence, telles que celles utilisées en immunohistochimie.

Plusieurs conditions médicales sont dues à des altérations de la myélinisation, par exemple, la sclérose en plaques, le vieillissement et l’autisme. Comprendre ces altérations nous aidera à comprendre les conditions médicales sous-jacentes. Dans ce cas, le laser CARS est réglé sur les lipides d’image ou, en particulier, sur les liaisons CH2.

Dans le cerveau, la plus grande source de lipides est la myéline. Ainsi, il s’agit d’une technique pour imager la myéline dans le tissu cérébral. Il devrait être possible d’utiliser la même méthode pour d’autres types de tissus lorsque l’imagerie des lipides est intéressante.

Le réglage et l’alignement du laser CARS nécessitent une expertise considérable et sont mieux effectués par un expert en laser ou en microscopie optique. Après avoir préparé les tissus comme décrit dans le manuscrit, colorer les sections flottantes pour le nisel et les milieux d’anticorps afin de visualiser les corps cellulaires, puis incuber les sections sur un agitateur de laboratoire standard pendant 30 minutes à température ambiante. Avant d’apporter les échantillons au microscope, allumez et réchauffez le laser CARS pendant au moins une heure, puis alignez le laser CARS en chevauchant spatialement la pompe et alimentez les faisceaux laser, et ajustez le délai entre les deux faisceaux laser.

Colorez l’optique du condensateur et le diaphragme du microscope pour l’imagerie CARS vers l’avant, puis ajustez le périscope externe pour centrer les deux lasers superposés spatialement sur les miroirs de la tête de balayage du microscope. Pour la meilleure détection non numérisée CARS avant. Assurez-vous que le condenseur est de couleur leurrée.

Pour l’immunofluorescence, l’imagerie confocale et l’imagerie CARS, équipez le laser CARS de détecteurs CARS non numérisés avant et épi en incorporant un microscope confocal équipé de lasers visibles pour l’imagerie par fluorescence. Maintenant, placez les sections dans un plat de culture avec un fond couvercle et du PBS pour éviter de sécher le tissu. Utilisez également un poids en verre pour garder le mouchoir près du couvercle.

À l’aide de l’interface utilisateur graphique, définissez les paramètres d’acquisition d’image pour l’imagerie confocale par fluorescence des voitures et des missiles. Placez l’échantillon sur l’étage du microscope, concentrez-le et capturez les images. Les spectres de CARS vont de 640 à 660 nanomètres et il ne semble pas y avoir de chevauchement dans les spectres avec le marqueur immunofluorescent marqué par le nisel, ce qui indique que les signaux CARS peuvent être utilisés avec des signaux immunofluorescents.

Nisel a été utilisé pour visualiser les corps cellulaires des gerbilles mongoles et des cerveaux de souris, et l’imagerie de CARS a été utilisée pour visualiser la gaine de myéline, indiquant que cette technique pouvait être utilisée à travers les espèces. Les deux séries d’images montrent une section du noyau médian du corps trapézoïdal dans le tronc cérébral. La résolution de CARS est inférieure à celle du microscope électronique et est de l’ordre de plusieurs centaines de nanomètres.

Les images peuvent être analysées avec un logiciel d’analyse d’images standard, tel que ImageJ pour quantifier les paramètres d’intérêt, par exemple, l’épaisseur ou la longueur de la myéline.