Name: Un protocole de dosage en fosse simple pour visualiser et quantifier la résorption ostéoclastique in vitro (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Découvrez un protocole de dosage de résorption ostéoclastique utilisant des plaques de culture recouvertes de phosphate de calcium. Cette méthode permet de visualiser simultanément les cavités de résorption et les cellules.

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Ce travail a été partiellement financé par le China Scholarship Council [CSC n° 201808440394]. W.C. a été financé par le SCC.

Le protocole a été examiné et approuvé par le comité d’éthique local (numéro d’approbation 287/2020B02).
1. Préparation de plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium
<ol><li>Préparation de la solution mère de calcium (25 mM CaCl2·2H2O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O dans le tampon Tris)<ol>
<li>Préparez un tampon Tris de 1,0 M et ajustez le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl.</li>
		<li>Installez un bécher en verre sur un agitateur magnétique et ajoutez 100 mL de tampon Tris de 1,0 M.</li>
		<li>Peser 0,368 g de CaCl2·2H2O, 8,0 g de NaCl et 0,305 g de MgCl2·6H2O et dissoudre dans le tampon Tris un par un.</li>
		<li>Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl. Conserver à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation de la solution mère de phosphate (11,1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO3 dans le tampon Tris)<ol>
<li>Installez un bécher en verre sur un agitateur magnétique et ajoutez 100 mL de tampon Tris de 1,0 M.</li>
		<li>Peser 0,158 g de Na2HPO4· H2O et 0,353 g de NaHCO3 et dissoudre dans le tampon Tris un par un.</li>
		<li>Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl. Conserver à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pré-calcification des plaques de culture cellulaire à 96 puits<ol>
<li>Préparer 30 mL de solution de travail en mélangeant 15 mL de tampon Tris de 1,0 M, 7,5 mL de solution de calcium (étape 1.1.4) et 7,5 mL de solution mère de phosphate (étape 1.2.3). Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 μm.</li>
		<li>Préparez une plaque de culture cellulaire de 96 puits avec un fond plat. Pipette 300 μL de solution de phosphate de calcium (étape 1.3.1.) dans chaque puits. Couvrir la plaque avec un couvercle et incuber la plaque à 37 °C pendant 3 jours.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Préparation d’une solution de phosphate de calcium (2,25 mM Na2HPO4· H 2 O, 4 mM CaCl2·2H2O, 0,14 M NaCl, 50 mM De base Tris en ddH2O)<ol>
<li>Ajouter 2 mL de 1 M HCl à 40 mL d’eau désionisée dans un bécher avec une bille d’agitation magnétique et dissoudre 0,016 g de Na2HPO4· H2O, 0,0295 g de CaCl2·2H2O, 0,409 g de NaCl et 0,303 g de base Tris un par un.</li>
		<li>Ajuster le pH à 7,4 à l’aide de 1 M HCl. Ajouter de l’eau désionisée pour remplir le volume à 50 mL. Filtrer la solution avec un filtre de 0,2 μm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calcification de plaques de culture cellulaire à 96 puits<ol>
<li>Aspirer la solution de précalcification des plaques de culture cellulaire pré-calcifiées à 96 puits et ajouter 300 μL de solution de phosphate de calcium (étape 1.4.2) à chaque puits. Couvrir les plaques avec un couvercle et incuber à 37 °C pendant 1 jour.</li>
		<li>Retournez la plaque pour verser la solution et lavez la plaque trois fois avec de l’eau désionisée à fond. Séchez immédiatement la plaque à l’aide d’un sèche-cheveux ou d’un gaz CO2 ouN2 comprimé pour maintenir une surface uniforme.</li>
		<li>Stériliser la plaque enduite par rayonnement UV dans un banc propre pendant 1 h. Utilisez immédiatement la plaque revêtue ou scellez la plaque avec un parafilm et conservez-la à température ambiante.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolement des PBMC du sang périphérique humain
<ol><li>Prélever 15 mL de sang dans la veine après avoir obtenu le consentement éclairé écrit du donneur de sang (vote éthique: 287/2020B02).</li>
	<li>Diluer 15 mL de sang frais avec un volume égal de PBS et mélanger en inversant le tube plusieurs fois ou en tirant le mélange dans et hors d’une pipette.</li>
	<li>Préparer un tube conique de 50 mL contenant 15 mL de solution de gradient de densité (p. ex. Ficoll, Table des matériaux) par tube. Inclinez le tube et superposez soigneusement 30 mL d’échantillon de sang dilué sur la solution de gradient de densité de 15 mL (échantillon de sang dilué : solution de gradient de densité, rapport 1:0,5-1). REMARQUE: Lors de la superposition de l’échantillon, veillez à ne pas mélanger la solution de gradient de densité avec l’échantillon de sang dilué.</li>
	<li>Centrifuger à 810 x g pendant 20 min à 20 °C dans un rotor à godet oscillant sans frein.</li>
	<li>Aspirer la couche supérieure en laissant la couche cellulaire mononucléaire (lymphocytes, monocytes et thrombocytes) intacte à l’interphase.</li>
	<li>Transférez soigneusement la couche cellulaire mononucléaire dans un nouveau tube conique de 50 mL.</li>
	<li>Remplissez le tube avec du PBS, du mélange et de la centrifugeuse à 300 x g pendant 10 min à 20 °C (le frein peut être utilisé à partir de cette étape).</li>
	<li>Retirez soigneusement le surnageant complètement. Remettre en suspension la pastille de la cellule dans 50 mL de PBS et centrifuger à 300 x g pendant 10 min à 20 °C. Retirez soigneusement le surnageant complètement.</li>
	<li>Pour l’élimination des plaquettes, remettre la pastille de cellule dans 50 mL de PBS et centrifuger à 200 x g pendant 10 min à 20 °C. Retirez soigneusement le surnageant complètement.</li>
	<li>Transférer les cellules remises en suspension dans des flacons de culture cellulaire pour l’expansion des progéniteurs OC.</li>
</ol>3. Expansion des progéniteurs OC
<ol><li>Remettre en suspension les PBMC en α-MEM complets (10 % FBS, 1 % Pen/Strep, 1 % amphotéricine B) contenant 20 ng/mL M-CSF. Semez des PBMC à une densité de 2,5 x 105 cellules/cm2. Habituellement, les cellules isolées de 15-20 mL de sang frais peuvent être ensemencées dans une fiole de 75 cm2 (1,5-2 x 107 cellules).</li>
	<li>Nourrissez les cellules avec du α-MEM complet frais contenant 20 ng / mL de M-CSF tous les trois jours jusqu’à ce que les cellules attachées atteignent la confluence souhaitée. Les rendements typiques sont de 1,5-2 x 106 cellules / flacon lorsque les cellules sont confluentes à 95%. Habituellement, la période d’expansion dure 6 jours. REMARQUE: Le potentiel ostéoclastogène des précurseurs peut diminuer avec un temps de culture prolongé.</li>
</ol>4. Induction de l’ostéoclastogenèse dans les plaques revêtues de CaP
<ol><li>Pour faciliter l’adhésion cellulaire, incuber les plaques revêtues de CaP avec 50 μL de FBS pendant 1 h dans un incubateur à 37 °C.</li>
	<li>Pour détacher les précurseurs de CO, lavez la fiole avec du PBS deux fois pour éliminer les cellules mortes ou non adhérentes. Ajouter 4 mL de trypsine (Table des matériaux) par flacon de 75 cm2 , pendant 30 min.<ol>
<li>Ajouter 4 mL de α-MEM complet pour arrêter la digestion, détacher soigneusement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire et transférer les cellules dans un tube de 50 mL.</li>
		<li>Déterminez le nombre total de cellules à l’aide d’une chambre de Neubauer ou similaire.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Granulés les cellules par centrifugation pendant 7 min à 350 x g. Remettre en suspension la pastille dans suffisamment de α-MEM complet contenant 20 ng/mL M-CSF et 20 ng/mL RANKL pour obtenir une concentration de 1 x 106 cellules/mL.</li>
	<li>Aspirer la solution FBS de la plaque de 96 puits revêtue de CaP et pipette 200 μL de suspension cellulaire par puits (2 x 105 cellules/puits).</li>
	<li>Incuber les précurseurs OC pendant la période souhaitée ou avec les réactifs souhaités pertinents pour la conception expérimentale. Habituellement, un nombre élevé d’OC de grande taille et multinucléés peut être observé après 6 jours et lorsque des fosses de résorption se forment. Cellules d’alimentation avec un milieu α-MEM complet frais contenant 20 ng/mL de M-CSF et 20 ng/mL de RANKL tous les trois jours.</li>
	<li>À la fin de l’incubation, lavez les cellules avec du PBS deux fois, fixez-les avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 10 minutes et lavez à nouveau avec du PBS.</li>
	<li>Utilisez les CO fixes directement pour la coloration par fluorescence ou stockez-les à 4 °C.</li>
</ol>5. Coloration par fluorescence des CO et du revêtement CaP
<ol><li>Incuber les cellules fixes avec un tampon de perméabilisation (0,1% de Triton dans PBS) pendant 5 min.</li>
	<li>Colorez les filaments d’actine avec 100 μL de solution de phalloïdine marquée AlexaFluor 546 dans du PBS pendant 30 min et aspirez la solution de coloration. Ajouter 100 μL de solution de coloration Hoechst 33342 (10 μg/mL dans le PBS) pendant 10 min pour colorer les noyaux. DAPI peut également être utilisé.</li>
	<li>Revêtement De coloration CaP avec 100 μL de 10 μM de calccéine dans le PBS pendant 10 min. Lavez trois fois avec PBS et prenez des images.</li>
	<li>Après l’imagerie par fluorescence, les mêmes plaques peuvent être utilisées pour quantifier la zone de la fosse de résorption par coloration de Von Kossa. Pour ce faire, lavez les assiettes à l’eau désionisée deux fois.</li>
</ol>6. Quantification de la surface totale de la fosse de résorption
<ol><li>Pour tacher le revêtement CaP avec coloration Von Kossa, incuber avec 50 μL de 5% AgNO3 dans de l’eau désionisée par puits sous rayonnement UV pendant 1 h, jusqu’à ce que le revêtement au fond des puits soit devenu brun.</li>
	<li>Lavez la plaque trois fois avec de l’eau désionisée et prenez des images en champ lumineux. Un objectif avec peu de grossissement, tel qu’un objectif 1,25x, peut être utilisé pour capturer l’ensemble du puits dans une seule image. Cela facilite l’analyse ultérieure de l’image. D’autres méthodes pour capturer toute la zone du puits peuvent être appliquées.</li>
	<li>Ouvrez un fichier image avec ImageJ: File | Ouvrir | | de l’image Type | 8 bits. Vérifiez l’unité d’échelle dans le coin inférieur droit de l’image à l’aide de la ligne droite | Analyser | Définir l’échelle. Entrez la longueur dans la couverture « distance connue », entrez une nouvelle unité d’échelle dans Unité de longueur et cochez la case Global.</li>
	<li>Liste des paramètres de mesure à analyser : Analyser | Définir les mesures. Dans la fenêtre Définir les mesures, cochez les cases Zone et Limite au seuil.</li>
	<li>Mesurer la surface des fosses : image | Ajuster | Seuil. Dans la fenêtre Seuil, cochez la case Arrière-plan sombre et cliquez sur Auto. La zone des fosses devient rouge. Fermez la fenêtre Seuil et sélectionnez Analyser | Mesure. Enregistrez le fichier de résultats : Fichier | Enregistrer sous.</li>
</ol>7. Quantification du nombre et de la taille du CO, et de la zone normalisée de la fosse de résorption
<ol><li>Ouvrez une image de fluorescence d’ostéoclastes avec ImageJ et vérifiez l’unité d’échelle (voir étape 6.3).</li>
	<li>Liste des paramètres de mesure à analyser : Analyser | Définir les mesures. Dans la fenêtre Définir les mesures, cochez la case Zone .</li>
	<li>Décrire les OC à l’aide des sélections ROI Manager et Polygon : Analyser | Outils | Gestionnaire de retour sur investissement. Cliquez sur Sélections de polygones dans l’ensemble d’outils, dessinez un OC (cellules avec anneau d’actine et ≥ trois noyaux) et cliquez sur Ajouter [t] dans la fenêtre gestionnaire de retour sur investissement. Répétez la description jusqu’à ce que tous les CO soient inclus.</li>
	<li>Mesurer le nombre et la taille des CO : sélectionnez tous les éléments dans le Gestionnaire de retour sur investissement et cliquez sur Mesurer. Enregistrez le fichier de résultats : Fichier | Enregistrer sous (Figure 3E).</li>
	<li>Mesurez la zone de fosse des images de fluorescence. Ouvrez l’image fluorescente du revêtement en corrélation avec l’image de l’étape 7.3 et vérifiez l’unité d’échelle (voir l’étape 6.3).<ol>
<li>Énumérer les paramètres de mesure à analyser (voir étape 6.4). Sélectionnez | d’image Ajuster | Seuil. Dans la fenêtre Seuil, décochez toutes les cases et cliquez sur Auto. La zone des fosses devient rouge. Fermez la fenêtre Seuil et sélectionnez Analyser | Mesure. Enregistrez le fichier de résultats.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Calculez la surface normalisée de la fosse par numéro OC.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous décrivons ici une méthode simple et fiable pour un test de résorption ostéoclastique utilisant des CO dérivés et développés in vitro à partir de PBMC. Les plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisées peuvent être facilement préparées et visualisées à l’aide de matériaux disponibles en laboratoire. En plus des PBMC non triés adoptés dans ce protocole, les OC générés à partir de cellules monocytaires murines21 et de cellules macrophages de moelle osseuse17<...

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Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Les ostéoclastes (OC) sont des macrophages spécifiques aux tissus dérivés de cellules souches hématopoïétiques (CSH), jouant un rôle central dans le remodelage osseux avec les ostéoblastes1. Les troubles osseux induits par les hormones sexuelles, immunologiques et malins qui détruisent les os de manière systémique ou locale sont dus à une activité ostéoclastique excessive, y compris l’ostéoporose liée à la ménopause2, la polyarthrite rhumatoïde3, la maladie parodontale4, la maladie osseuse myélomateuse5 et les métastases osseuses ostéolytiques6. En revanche, des défauts dans la formation et la fonction du CO peuvent également provoquer une ostéopétrose7. Les CSH subissent une différenciation en progéniteurs OC sous stimulation du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF, symbole du gène ACP5). En présence à la fois de M-CSF et d’activateur de récepteur du ligand NF-κB (RANKL, symbole du gène TNFSF11), les progéniteurs OC se différencient davantage en OC mononucléaires et fusionnent ensuite pour devenirdes OC multinucléés 8,9,10. Les cytokines M-CSF et RANKL sont indispensables et suffisantes pour l’induction de marqueurs ostéoclastiques tels que le récepteur de la calcitonine (CT), l’activateur du récepteur du facteur nucléaire κ B (RANK), la pompe à protons V-ATPase, la sous-unité alpha du canal chlorure 7 (CIC-7), l’intégrine β3, la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP, symbole du gène ACP5), la cystéine protéase lysosomale cathepsine K (CTSK) et la métallopeptidase matricielle 9 (MMP9). Les CO activés forment une zone d’étanchéité à la surface osseuse par la formation d’un anneau d’actine avec une bordure ébouriffée11,12. Dans la zone d’étanchéité, les CO médient la résorption par la sécrétisation de protons via la pompe à protons V-ATPase 12,13, MMP914 et CTSK15, conduisant à la formation de lacunes.
Pour les expériences in vitro, les progéniteurs OC peuvent être obtenus par expansion des macrophages de la moelle osseuse à partir du fémur et du tibiade souris 16,17, ainsi que par isolement des cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) à partir d’échantillons de sang et de pelages bouffants 18,19,20, ou par différenciation des cellules monocytaires murines immortalisées RAW 264,7 21,22.
Dans le présent protocole, nous décrivons un test de résorption ostéoclastique dans des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP à l’aide d’OC dérivés de PBMC primaires. La méthode des plaques de culture cellulaire revêtues de CaP utilisée ici est adoptée et affinée à partir de la méthode décrite précédemment par Patntirapong et al.17 et Maria et al.21. Pour obtenir des précurseurs OC, les PBMC sont isolés par centrifugation par gradient de densité et élargis comme décrit précédemment20.

<table><tbody><tr><td>AgNO3</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>35110</td><td>Nitrate d’argent</td></tr><tr><td>a-MEM</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td>MEM alpha, GlutaMAX, sans nucléosides</td></tr><tr><td>amphotéricine B</td><td>Biochrom</td><td>03-028-1B</td><td>Amphotéricine B Solution</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21097-50G</td><td>Chlorure de calcium dihydraté</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td>Calcein</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>sérum fœtal bovin</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>Ficoll Paque Plus</td></tr><tr><td>Tampon de fixation</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td>Paraformaldéhyde</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merk</td><td>1.09057.1000</td><td>Acide chlorhydrique</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Promokine</td><td>PK-CA707-40046</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>Humain recombinant M-CSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td>Chlorure de magnésium</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2943,0250</td><td>di- Hydrogénophosphate de sodium anhydre</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td>S7653-250G</td><td>chlorure de sodium</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk</td><td>K15322429</td><td>Bicarbonate de soude</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (1X), DBPS sans calcium et magnésium</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Mélange pénicilline-streptomycine</td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546 Phalloïdine</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PeproTech</td><td>310-01</td><td>Ligand sRANK humain recombinant (dérivé d’E. coli)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>Tris(hydroxyméthyl)aminométhane</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Alkyl Phényl Polyéthylène Glycol</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td>Enzymes de dissociation cellulaire recombinante</td></tr></tbody></table>

un protocole de dosage en fosse simple pour visualiser et quantifier la résorption ostéoclastique in vitro

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Les ostéoclastes matures sont des cellules multinucléées qui peuvent dégrader les os par la sécrétion d’acides et d’enzymes. Ils jouent un rôle crucial dans diverses maladies (p. ex. ostéoporose et cancer des os) et sont donc des objets de recherche importants. In vitro, leur activité peut être analysée par la formation de fosses de résorption. Dans ce protocole, nous décrivons une méthode simple de dosage en fosse utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium (CaP), qui peuvent être facilement visualisées et quantifiées. Des précurseurs d’ostéoclastes dérivés de cellules mononucléaires du sang périphérique humain (PBMC) ont été cultivés sur les plaques revêtues en présence de stimuli ostéoclastogènes. Après 9 jours d’incubation, les ostéoclastes ont été fixés et colorés pour l’imagerie par fluorescence tandis que le revêtement CaP a été contre-coloré par la calcéine. Pour quantifier la zone résorbée, le revêtement CaP sur les plaques a été coloré avec 5% d’AgNO3 et visualisé par imagerie en champ clair. La zone de la fosse de résorption a été quantifiée à l’aide d’ImageJ.

Le revêtement de phosphate de calcium sur le fond des plaques de culture cellulaire a été effectué en deux étapes de revêtement comprenant une pré-calcification de 3 jours et une étape de calcification de 1 jour. Comme le montre la figure 1, du phosphate de calcium uniformément réparti a été obtenu au fond des plaques de 96 puits. Le revêtement a très bien adhéré au fond après les étapes de lavage effectuées.
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Nous présentons ici une procédure de dosage simple et efficace pour les essais en fosse de résorption utilisant des plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium.

Un protocole de dosage en fosse simple pour visualiser et quantifier la résorption ostéoclastique in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Notre protocole décrit une méthode simple et fiable pour un test de résorption ostéoclastique. L’utilisation de plaques de culture cellulaire revêtues de phosphate de calcium peut être facilement préparée et visualisée à l’aide de matériaux disponibles en laboratoire. Contrairement aux tranches opaques d’os ou de dentine, le revêtement de phosphate de calcium permet de visualiser les fosses de résorption et les cellules en même temps.Dans ce protocole, nous utilisons des PBMC pour la différenciation des ostéoclastes. Cependant, il peut également être appliqué à d’autres types de cellules comme les monocytes dérivés de la moelle osseuse ou les cellules Raw 264.7. Prenez d’abord une plaque de culture cellulaire à fond plat de 96 puits et pipettez 300 microlitres de solution de phosphate de calcium préalablement préparée dans chaque puits.Ensuite, couvrez la plaque avec le couvercle et incubez la plaque à 37 degrés Celsius pendant trois jours. Après trois jours, aspirer la solution de pré-calcification des plaques de culture cellulaire pré-calcifiées de 96 puits et ajouter 300 microlitres de solution de phosphate de calcium à chaque puits. Couvrez les plaques avec un couvercle et incubez à 37 degrés Celsius pendant une journée.Ensuite, inversez la plaque pour verser la solution et lavez soigneusement la plaque trois fois avec de l’eau désionisée. Séchez immédiatement la plaque à l’aide d’un sèche-cheveux ou de dioxyde de carbone comprimé ou d’azote gazeux pour maintenir une surface uniforme. Maintenant, irradiez la plaque enduite sur un banc propre avec des rayons ultraviolets pendant une heure.Utilisez immédiatement la plaque revêtue ou scellez la plaque avec Parafilm et conservez-la à température ambiante. Diluer 15 millilitres de sang frais avec un volume égal de PBS et les mélanger en inversant ou en piquant plusieurs fois. Ensuite, prenez 15 millilitres de solution de gradient de densité dans un tube conique de 50 millilitres, inclinez le tube et superposez soigneusement 30 millilitres d’échantillon de sang dilué sur la solution de gradient de densité de 15 millilitres.Plus tard, centrifugez le tube dans un rotor à godet oscillant sans casser à 810 fois G pendant 20 minutes à 20 degrés Celsius. Ensuite, aspirez la couche supérieure en laissant la couche cellulaire mononucléaire intacte à l’interface. Transférez soigneusement la couche cellulaire mononucléaire dans un nouveau tube conique de 50 millilitres.Remplissez le tube avec du PBS, mélangez et centrifugez à 300 fois G pendant 10 minutes à 20 degrés Celsius. Remettez en suspension les PBMC dans un alpha-MEM complet contenant 20 nanogrammes par millilitre de facteur de stimulation des colonies de macrophages, et ensemencez 2,5 fois 10 à cinq cellules par centimètre carré de PBMC dans une fiole. Incuber les plaques enduites de phosphate de calcium avec 50 microlitres de sérum bovin fœtal à 37 degrés Celsius pendant une heure.Ensuite, lavez la fiole deux fois avec du PBS pour détacher les précurseurs d’ostéoclastes des cellules mortes ou non adhérentes, puis ajoutez quatre millilitres de trypsine par flacon de 75 centimètres carrés. Après 30 minutes, arrêtez la digestion en ajoutant quatre millilitres d’alpha-MEM complet, puis détachez soigneusement les cellules à l’aide d’un grattoir cellulaire. Transférez les cellules dans un tube de 50 millilitres et comptez le nombre total de cellules à l’aide d’une chambre de comptage.Centrifugez le tube à 350 fois G pendant sept minutes pour granuler les cellules et remettre en suspension la pastille et complétez l’alpha MEM contenant M-CSF et RANKL pour obtenir une fois 10 à six cellules par millilitre. Aspirer le sérum bovin fœtal de la plaque enduite de phosphate de calcium et pipeter 200 microlitres de suspension cellulaire par puits. Après l’incubation, lavez les cellules deux fois avec du PBS.Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 10 minutes et lavez-les à nouveau avec du PBS. Pour la coloration, ajoutez un tampon de perméabilisation aux cellules fixes et incuubez-les pendant cinq minutes. Pour colorer les filaments d’actine, incuber les cellules avec 100 microlitres de solution de phalloïdine marquée Alexa Fluor 546 dans du PBS pendant 30 minutes, puis aspirer la solution de coloration et colorer les noyaux à l’aide de 100 microlitres de Hoechst pendant 10 minutes.Coloration en phosphate de calcium avec 100 microlitres de 10 micromolaires de calccéine micromolaire et de PBS pendant 10 minutes. Après avoir lavé trois fois avec PBS, capturez des images. Pour la coloration Von Kossa du revêtement de phosphate de calcium, ajoutez 50 microlitres de nitrate d’argent à 5% et d’eau désionisée à chaque puits, et incubez la plaque sous rayonnement ultraviolet pendant une heure jusqu’à ce que le revêtement au fond des puits soit devenu brun.Le revêtement de phosphate de calcium au fond des 96 plaques de puits semblait uniforme et bien adhérent. Après neuf jours de culture dans le M-CSF et le RANKL sur les plaques revêtues de phosphate de calcium, les précurseurs d’ostéoclastes ont formé des fosses de résorption et de grands ostéoclastes. Les ostéoclastes multinucléés situés dans les fosses exprimaient des niveaux élevés de TRAP.Les ostéoclastes matures ont montré la présence de trois noyaux ou plus et de l’anneau d’actine distinct. Le revêtement de phosphate de calcium vert a montré la présence de fosses de résorption noires. Les images de fluorescence de la zone de fosse ont été mesurées à l’aide de l’outil de seuil de l’image J.Le nombre et la taille des ostéoclastes ont été calculés à l’aide du gestionnaire de retour sur investissement et de l’outil de sélection de polygones de l’image J.Les précurseurs des ostéoclastes cultivés en l’absence de RANKL ne pouvaient pas former de fosses de résorption, mais M-CSF et RANKL ont facilité la formation de fosses ostéoclastogènes.Et la zone de la fosse a été quantifiée à l’aide de l’image J.Le séchage immédiat de la plaque revêtue avec un flux d’air aide à créer un revêtement uniforme de phosphate de calcium. Sinon, il est susceptible de former un revêtement plus épais au milieu du puits.

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Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate : une technique in vitro pour détecter les ostéoclastes cultivés contenant l’enzyme TRAP

Dans cette vidéo, nous décrivons un test de résorption ostéoclastique in vitro sur des plaques de culture cellulaire enrobées de phosphate de calcium cultivées avec des ostéoclastes dérivés de cellules mononucléées du sang périphérique humain. Les ostéoclastes forment un anneau d’actine caractéristique sur la matrice recouverte de phosphate de calcium de la plaque de culture cellulaire et dégradent la matrice dans la région du cycle d’actine pour libérer des ions calcium et phosphate, ce qui...

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