Name: Microtransplantation de membranes synaptiques pour réactiver les récepteurs synaptiques humains pour les études fonctionnelles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-20T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez la microtransplantation de membranes synaptiques dans des ovocytes de Xenopus laevis pour enregistrer l'activité des récepteurs AMPA et GABA. Cette méthode électrophysiologique permet d'étudier les mécanismes neuronaux liés aux troubles neurodégénératifs et mentaux.

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Ce travail a été soutenu par les subventions NIA/NIH R01AG070255 et R01AG073133 à AL. Nous remercions également le centre de recherche sur la maladie d’Alzheimer de l’Université de Californie à Irvine (UCI-ADRC) d’avoir fourni le tissu humain présenté dans ce manuscrit. L’UCI-ADRC est financé par la subvention NIH/NIA P30 AG066519.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

L’analyse des complexes protéiques natifs du cerveau humain est nécessaire pour comprendre les processus homéostatiques et pathologiques dans les troubles cérébraux et développer des stratégies thérapeutiques pour prévenir ou traiter les maladies. Ainsi, les banques de cerveaux contenant des échantillons congelés instantanément sont une source inestimable d’une grande richesse d’informations physiologiques, pour la plupart inexploitée 29,30. Une préoccupation ini...

Les troubles neurodégénératifs affectent un grand pourcentage de la population. Bien que leurs conséquences dévastatrices soient bien connues, le lien entre les altérations fonctionnelles des récepteurs des neurotransmetteurs, qui sont essentiels au fonctionnement du cerveau, et leur symptomatologie est encore mal compris. La variabilité interindividuelle, la nature chronique de la maladie et l’apparition insidieuse des symptômes ne sont que quelques-unes des raisons qui ont retardé la compréhension des nombreux troubles cérébraux où les déséquilibres chimiques sont bien documentés 1,2. Les modèles animaux ont généré des informations inestimables et élargi nos connaissances sur les mécanismes sous-jacents à la physiologie et à la physiopathologie dans les systèmes évolutifs conservés; cependant, plusieurs différences interespèces entre les rongeurs et les humains empêchent l’extrapolation directe de la fonction des récepteurs des modèles animaux au cerveau humain3. Ainsi, les premiers efforts pour étudier les récepteurs humains natifs ont été développés par le laboratoire de Ricardo Miledi en utilisant des tissus enlevés chirurgicalement et des échantillons congelés. Ces expériences initiales ont utilisé des membranes entières qui comprennent des récepteurs synaptiques et extra synaptiques neuronaux ainsi que des récepteurs de neurotransmetteurs non neuronaux, et bien qu’elles fournissent des informations importantes sur les états malades, on craint que le mélange de récepteurs ne complique l’interprétation des données 4,5,6,7. Il est important de noter que les synapses sont la cible principale de nombreux troubles neurodégénératifs 8,9; par conséquent, les tests pour tester les propriétés fonctionnelles des synapses affectées sont fondamentaux pour obtenir des informations sur les changements pertinents pour la maladie affectant la communication synaptique. Ici, une modification de la méthode originale est décrite: la microtransplantation des membranes synaptiques (MSM), qui se concentre sur la caractérisation physiologique des préparations de protéines synaptiques enrichies et a été appliquée avec succès à l’étude des synaptosomes 10,11,12,13,14,15 . Avec cette méthodologie, il est possible de transplanter des récepteurs synaptiques qui travaillaient autrefois dans le cerveau humain, intégrés dans leurs propres lipides natifs et avec leur propre cohorte de protéines associées. De plus, comme les données des HARSAH sont quantitatives, il est possible d’utiliser ces données pour les intégrer à de grands ensembles de données protéomiques ou de séquençage10.
Il est important de noter que de nombreuses analyses pharmacologiques et biophysiques des récepteurs synaptiques sont effectuées sur des protéines recombinantes16,17. Bien que cette approche fournisse un meilleur aperçu des relations structure-fonction des récepteurs, elle ne peut pas fournir d’informations sur les complexes complexes de récepteurs multimériques trouvés dans les neurones et leurs changements dans la maladie. Par conséquent, une combinaison de protéines natives et recombinantes devrait fournir une analyse plus complète des récepteurs synaptiques.
Il existe de nombreuses méthodes pour préparer les synaptosomes 10,11,12,13,14,15 qui peuvent être ajustés pour les besoins d’un laboratoire. Le protocole part de l’hypothèse que les préparations enrichies en synaptomoses ont été isolées et sont prêtes à être traitées pour des expériences de microtransplantation. En laboratoire, la méthode Syn-Per est utilisée en suivant les instructions du fabricant. Ceci est fait en raison de la reproductibilité élevée dans les expériences électrophysiologiques10,11. Il existe également une abondante littérature expliquant comment isoler les ovocytes Xenopus 18,19, qui peuvent également être achetés prêts pour l’injection20.

<table><tbody><tr><td>Pour la microinjection</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3.5" Capillaires en verre</td><td>Drummond</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>24 puits, fond plat Plaque de culture tissulaire</td><td>Thermofisher</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur de micropipette de type Flaming/Brown</td><td>Sutter</td><td>P-1000</td><td></td></tr><tr><td>Bol d’injection</td><td>Thermofisher</td><td>08-772B</td><td></td></tr><tr><td>Tubes de microcentrifugation</td><td>Thermofisher</td><td>02-682-002</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Thermofisher</td><td>O121-1</td><td></td></tr><tr><td>Nanoject II</td><td>Drummond</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Maille de nylon</td><td>Filet industriel</td><td>WN0800</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Thermofisher</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>Seringue</td><td>Thermofisher</td><td>14-841-31</td><td></td></tr><tr><td>Bain de nettoyage par ultrasons</td><td>Thermofisher</td><td>FS20D</td><td></td></tr><tr><td>Xenopus laevis grenouilles</td><td>Xenopus 1</td><td>4217</td><td></td></tr><tr><td>Pour deux électrodes Tension clamp</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>15 cm de long capillaires en verre borosilicate poli au feu</td><td>Sutter</td><td>B200-116-15</td><td></td></tr><tr><td>Tout ordinateur PC ou ordinateur portable</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filtre passe-bas Bessel Warner</td><td>Instruments</td><td>LPF-8</td><td></td></tr><tr><td>Stéréoscope</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-000-037</td><td></td></tr><tr><td>Poste de travail à pince de tension à deux électrodes</td><td>Warner Instruments</td><td>TEV-700</td><td></td></tr><tr><td>ValveLink 8.2 Contrôleur de perfusion</td><td>Automate Scientific</td><td>SKU:01-18</td><td></td></tr><tr><td>WInEDR Logiciel libre</td><td>Université de Strathclyde Glasgow</td><td>https://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/software_ses.htm</td><td></td></tr><tr><td>DAQ multifonction série X</td><td>National Instruments</td><td>NI USB-6341</td><td></td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Calcium</td><td>dichloride Thermofisher</td><td>C79</td><td></td></tr><tr><td>Calcium nitrate tétrahydraté</td><td>Thermofisher</td><td>C109</td><td></td></tr><tr><td>Collagénase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0130</td><td></td></tr><tr><td>GABA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2129</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (acide 4-(2-hydroxyéthyl)-1-pipérazineéthanesulfonique)</td><td>Thermofisher</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>Acide kaïnique</td><td>Tocris</td><td>0222</td><td></td></tr><tr><td>Sulfate de magnésium heptahydraté</td><td>Thermofisher</td><td>M63</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Thermofisher</td><td>P217</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Thermofisher</td><td>S233</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>Thermofisher</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrafree-0.1 &micro ; m Filtre MC,</td> <td>Amicon</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

microtransplantation de membranes synaptiques pour réactiver les récepteurs synaptiques humains pour les études fonctionnelles

Microtransplantation of Synaptic Membranes to Reactivate Human Synaptic Receptors for Functional Studies

Les récepteurs ionotropes excitateurs et inhibiteurs sont les principales portes des flux ioniques qui déterminent l’activité des synapses au cours de la communication neuronale physiologique. Par conséquent, des altérations de leur abondance, de leur fonction et de leurs relations avec d’autres éléments synaptiques ont été observées comme un corrélat majeur des altérations de la fonction cérébrale et des troubles cognitifs dans les maladies neurodégénératives et les troubles mentaux. Comprendre comment la fonction des récepteurs synaptiques excitateurs et inhibiteurs est altérée par la maladie est d’une importance cruciale pour le développement de thérapies efficaces. Pour obtenir des informations pertinentes pour la maladie, il est important d’enregistrer l’activité électrique des récepteurs de neurotransmetteurs qui restent fonctionnels dans le cerveau humain malade. Jusqu’à présent, il s’agit de l’approche la plus proche pour évaluer les altérations pathologiques de la fonction des récepteurs. Dans ce travail, une méthodologie est présentée pour effectuer la microtransplantation de membranes synaptiques, qui consiste à réactiver des membranes synaptiques à partir de tissus cérébraux humains congelés contenant des récepteurs humains, par son injection et sa fusion postérieure dans la membrane des ovocytes Xenopus laevis . Le protocole fournit également la stratégie méthodologique pour obtenir des réponses cohérentes et fiables des récepteurs de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique (AMPA) et de l’acide γ-aminobutyrique (GABA), ainsi que de nouvelles méthodes détaillées utilisées pour la normalisation et l’analyse rigoureuse des données.

Quelques heures après l’injection, les membranes synaptiques, porteuses de leurs récepteurs de neurotransmetteurs et de leurs canaux ioniques, commencent à fusionner avec la membrane plasmique de l’ovocyte. La figure 1 montre des enregistrements des récepteurs AMPA et GABAA microtransplantés en ovocytes Xenopus. Pour la majeure partie de l’analyse, les réponses de deux ou trois ovocytes par échantillon ont été mesurées, en utilisant deux ou trois lots d’ovocytes de grenou...

Le protocole démontre qu’en effectuant une microtransplantation de membranes synaptiques en ovocytes Xenopus laevis , il est possible d’enregistrer des réponses cohérentes et fiables de l’acide α-amino-3-hydroxy-5-méthyl-4-isoxazolepropionique et des récepteurs de l’acide γ-aminobutyrique.

Microtransplantation de membranes synaptiques pour réactiver les récepteurs synaptiques humains pour les études fonctionnelles

Excitatory and inhibitory ionotropic receptors are the major gates of ion fluxes that determine the activity of synapses during physiological neuronal ...

Les troubles neurodégénératifs et de santé mentale résultent de changements dans la communication synaptique. Les événements multifactoriels modifient les récepteurs synaptiques d’une manière que nous ne comprenons pas complètement. La microtransplantation des membranes synaptiques donne un aperçu de ces altérations.Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’enregistrer l’activité des récepteurs cérébraux natifs travaillant dans le cerveau humain et, par conséquent, de représenter les maladies que nous étudions. Les récepteurs synaptiques sont des cibles majeures pour la médecine régulant l’activité électrique du cerveau, mais en comprenant comment ces récepteurs changent, de meilleures thérapies restaurant leur fonctionnalité peuvent être développées. Cette méthode a été appliquée avec succès à différentes espèces, des insectes, des poissons, des mammifères, mais peut également être appliquée aux récepteurs membranaires en dehors du cerveau, par exemple, les muscles et les tumeurs.Les possibilités sont larges. Couper les aiguilles d’injection est délicat. Trop petit peut empêcher l’injection de protéines, et deux gros peuvent tuer la cellule.Il permet d’utiliser une mesure cohérente, comme le bord d’une lame de rasoir. Commencez par soniquer les échantillons sélectionnés préparés à partir de la région du cerveau humain d’intérêt trois fois dans un bain avec de la glace humide flottante. Utilisez cinq cycles de secondes à chaque fois et attendez une minute sur de la glace humide entre les cycles.Placez un microlitre de l’échantillon sur le thermoplastique et faites une indentation sur la surface, si nécessaire, avant le placement de l’échantillon pour empêcher le mouvement de l’échantillon. Utilisez les boutons du manipulateur qui maintiennent le nanoinjecteur pour positionner l’aiguille et déplacez-la vers l’échantillon à remplir. Une fois que la pointe de l’aiguille est dans l’échantillon, appuyez sur le bouton de remplissage et maintenez-le enfoncé jusqu’à ce que suffisamment d’échantillon soit prélevé.Environ 0,5 microlitre d’échantillon est nécessaire pour 10 ovocytes. Utilisez les boutons pour déplacer l’aiguille du nanoinjecteur dans la position la plus haute. Pénètrez dans l’ovocyte juste sous la surface avec une aiguille, pas plus profonde, et utilisez la pédale pour injecter l’échantillon.Attendez environ deux à trois secondes. Après une injection réussie, la cellule se dilatera. Utilisez les boutons du manipulateur pour sortir de la cellule.Déplacez la boîte de Petri de sorte que l’ovocyte suivant soit aligné avec l’aiguille. Répétez le processus jusqu’à ce que le nombre souhaité d’ovocytes dans la boîte ait été injecté, puis rétractez le nanoinjecteur à sa position d’origine et retirez l’aiguille. S’assurer qu’un puits d’ovocytes n’est pas injecté pour être utilisé comme témoin.Allumez tout l’équipement utilisé pour l’enregistrement des courants ioniques, puis allumez l’ordinateur de bureau et connectez-vous à WinEDR version 3.9.1. Assurez-vous que le programme est en cours d’exécution et que l’enregistrement est défini sur Disque. Après cela, définissez la durée d’enregistrement et désactivez l’option Simulateur.Pour la section de l’électrode de tension, désactivez la compensation de capacité négative. Réglez le sélecteur de gain sur 10 pour la section de l’électrode de bain, puis réglez l’interrupteur à bascule à trois positions, qui sélectionne le multiplicateur de gain, sur x1. Les voyants LED indiqueront la sélection du multiplicateur de gain.Éteignez le sélecteur de mode de serrage, mettez le contrôle de gain CC en place et réglez le contrôle de gain sur environ la moitié de la boucle ouverte de bande passante complète. Définissez les commandes sur 40 millivolts, les commandes de maintien sur négatif et le multiplicateur d’échelle sur x2. Pour l’électrode de courant, utilisez le décalage VE pour établir une référence zéro, avant d’empaler l’ovocyte.Ensuite, ouvrez le logiciel WinEDR version 3.9.1, allez dans le menu supérieur et sélectionnez Fichier, suivi de Nouveau. Créez votre propre dossier et enregistrez le fichier. Dans le menu principal, sélectionnez Enregistrer, puis Enregistrer sur disque.Placez les ponts de gélose dans les trous circulaires respectifs derrière la chambre d’enregistrement, en reliant les puits pour les électrodes utilisées comme référence au sol dans la chambre d’enregistrement. Ajoutez 1x solution de travail de Ringer à la valve de perfusion correspondante. Ouvrez la vanne jusqu’à ce que la chambre d’enregistrement soit remplie de la solution de Ringer.À l’aide des manipulateurs droit et gauche qui maintiennent les électrodes, guidez les aiguilles des électrodes dans la chambre d’enregistrement remplie de la solution de Ringer. Vérifiez la résistance de chaque électrode en mettant à zéro les boutons de décalage VM et VE, puis en appuyant sur les boutons de test de l’électrode. La résistance devrait être comprise entre 0,5 et trois mégaohms.Si la résistance est hors de portée, remplacez-la à l’aide de nouvelles microélectrodes. Ensuite, remplissez la chambre d’enregistrement avec une nouvelle solution de Ringer. Utilisez une pipette en verre pour placer un ovocyte non injecté ou micro-transplanté au centre de la chambre d’enregistrement.Assurez-vous que l’ovocyte est clairement visible au microscope avec le côté animal vers le haut. Guidez l’électrode dans la solution de Ringer jusqu’à ce qu’elle touche la membrane ovocytaire. Percez doucement la membrane ovocytaire du côté animal avec les deux électrodes et enregistrez le potentiel de la membrane au repos.Activez le flux Solution de la sonnerie. À l’aide de l’amplificateur de serrage ovocyte, changez le mode pour que la pince de tension ralentisse et réglez la tension de maintien à 80 millivolts. Le courant sur le moniteur doit être négatif, généralement entre 0 et 0,4 microampères.Accédez à Fichier, Nouveau, puis enregistrez l’enregistrement sur le logiciel pour créer un nouveau fichier, puis enregistrez l’enregistrement. Appuyez sur Enregistrer puis sur Enregistrer sur disque pour démarrer l’enregistrement. Ajoutez des informations pertinentes au fichier à l’aide de la boîte de dialogue Graphique de repères.Appliquez des agonistes pour la stimulation chimique en ouvrant les valves et en les perfusant dans la chambre d’enregistrement pendant 15 secondes. Une fois l’enregistrement terminé, mettez la pince de tension en position d’arrêt et éteignez la vanne de la solution de sonnerie. Retirez l’ovocyte et jetez-le conformément à la politique institutionnelle pour les échantillons de cerveau humain, puis arrêtez l’enregistrement et enregistrez le fichier.Enregistrez une copie des enregistrements sur une clé USB. À partir de là, ouvrez le fichier souhaité à analyser. Pour mesurer la réponse maximale AMPA et la réponse de crête GABA A, établissez d’abord un niveau 0 ou une ligne de base en trouvant la ligne rouge, puis faites-la glisser vers le courant généré par l’application Ringer ou la ligne de base.Une fois le niveau 0 établi, déterminez les mesures de réponse en faisant glisser le curseur de lecture verticale vert vers la partie souhaitée du traceur graphique. Les courants ioniques des ovocytes injectés avec les membranes des récepteurs synaptiques humains ont été enregistrés. Les récepteurs AMPA ont été activés avec 100 kainates micromolaires et les récepteurs GABA A avec un GABA millimolaire.La co-injection des membranes filtrées de l’organe électrique de la torpille, riche en récepteurs de l’acétylcholine, et l’ADNc codant pour le récepteur GABA de la première rangée dans le pôle animal ont produit principalement deux groupes d’ovocytes, en fonction de leurs réponses. Un groupe d’ovocytes avait de grandes réponses à l’acétylcholine, mais aucune réponse à un GABA micromolaire. Les ovocytes d’un autre groupe avaient des réponses nulles ou faibles à l’acétylcholine, mais des réponses importantes au GABA.L’image graphique montre la moyenne plus moins l’erreur-type de la moyenne du courant de crête dans le groupe un et le groupe deux. Un ovocyte du groupe deux avait de grandes réponses au GABA et à l’acétylcholine, suggérant la rupture du noyau. Par conséquent, la distribution des réponses a été faussée à des valeurs faibles, comme le montre la différence entre la moyenne et la médiane de la distribution du courant membranaire.L’une des causes des ovocytes à faible réponse est que les membranes sont injectées et piégées dans le noyau de l’ovocyte. Les réponses GABA et kainate des ovocytes injectés dans les pôles animaux ou végétaux avec des membranes non filtrées obtenues à partir d’un cerveau non AD et d’un cerveau AD sont montrées ici. Les ovocytes injectés près du pôle animal sans cibler le noyau ont donné des réponses plus importantes que les ovocytes injectés dans le pôle végétal, permettant ainsi l’étude d’échantillons de tissus avec un très faible nombre de récepteurs.Lorsque vous tentez cette procédure, surveillez toujours votre niveau de sonnerie. C’est toujours pendant les enregistrements importants que vous manquerez, puis il utilisera votre résultat, et la mort de l’ovocyte, et la perte de données très précieuses. En suivant cette procédure, nous pouvons effectuer des charges occidentales pour valider la présence des récepteurs synaptiques, ou protéines d’intérêt.Il permet de mesurer l’excitation globale pour inhiber les rapports synaptiques dans différentes régions du cerveau, et différents troubles cérébraux, permettant de faire un test direct sur la prédiction théorique sur les causes de la maladie.

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