In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

Cette mesure construit un modèle minimum de la cellule dépourvu de réglementations biochimiques complexes. La technique utilisée peut générer un rendement élevé en liposomes et avoir une efficacité d’encapsulation élevée pour les protéines du cytosquelette. Cette mesure peut être appliquée à l’encapsulation de diverses protéines et de gros objets tels que des microparticules et des micronageurs auto-préparés.

Un individu a du mal à augmenter le rendement en liposomes pour les premières tentatives. Il est recommandé de discuter régulièrement de la section du manuscrit pour plus de détails afin d’augmenter le rendement. Pour commencer, préparez le tampon aqueux interne de non-polymérisation dans un volume total de cinq millilitres en mélangeant 0,1 millimolaire CACL deux, 10 millimolaires HEPES, un DTT millimolaire, 0,5 millimolaire DAPCO, 320 millimolaires de saccharose et 0,2 millimolaire d’ATP.

Préparer le mélange de protéines en ajoutant des protéines au tampon interne de non-polymérisation à quatre degrés Celsius. Pour former une couche d’actine, ajoutez 100 nanomolaires de gélcaline, quatre micromolaires de toux et 2,2 micromolaires de VCA HEZ au mélange de protéines. Comme expérience de contrôle, remplacez le mélange de protéines par un colorant fluorescent de 100 microgrammes par millilitre.

Préparer le tampon de polymérisation interne aqueuse dans un volume total de cinq millilitres en mélangeant 100 millimolaires de chlorure de potassium. Quatre millimolaires de chlorure de magnésium, 10 millimolaires HEPES, un DTT millimolaire, 0,5 millimolaire DABCO, 10 millimolaires d’ATP et 80 millimolaires de saccharose. Préparer le tampon final en mélangeant le tampon de non-polymérisation interne et le tampon de polymérisation interne à un rapport volumique de un à un, pour obtenir la solution aqueuse interne dans un volume total de 30 microlitres qui sera encapsulé dans le liposome.

Préparer le tampon extérieur aqueux dans un volume total de 150 microlitres en mélangeant 10 millimolaires HEPES, 50 millimolaires de chlorure de potassium, deux millimolaires de chlorure de magnésium, 0,2 millimolaire de chlorure de calcium, deux millimolaires d’ATP, un DTT millimolaire, 0,5 millimolaire de DAPCO, 212 millimolaires de glucose et 0,1 milligramme par millilitre de boîtier bêta. Pour préparer le mélange d’huile lipidique, commencez par ajouter 100 microlitres de 25 milligrammes par millilitre EGGPC dans un flacon en verre. Évaporer le chloroforme avec du gaz argon en laissant un film lipidique solide sec au fond du flacon.

Pour former une couche d’actine, ajouter du lipide de nickel à un rapport de 10 à un EGGPC au lipide de nickel et mélanger, avant l’évaporation du chloroforme. Ajouter deux millilitres d’huile minérale. Évaporer le chloroforme et sonifier le mélange d’huile lipidique à température ambiante dans un bain pendant une heure, pour remettre les lipides en suspension.

Préparer un tampon final dans l’émulsion d’huile pour préparer des gouttelettes lipidiques monocouches contenant la protéine d’intérêt. Commencez par prendre 100 microlitres du mélange d’huile lipidique dans un tube en plastique et ajoutez 10 microlitres de tampon final au mélange d’huile lipidique. Assurez-vous que le tampon final est dans une gouttelette.

À l’aide d’une seringue en verre, prélever d’abord une petite quantité de mélange d’huile lipidique, puis la gouttelette tampon finale en plaçant l’extrémité de la seringue à la périphérie de la gouttelette pour la briser en minuscules gouttelettes. Aspirer doucement de haut en bas plusieurs fois jusqu’à ce qu’une émulsion trouble se forme. Mettez 30 microlitres de tampon extérieur dans un tube en plastique séparé.

Placez 30 microlitres du mélange d’huile lipidique sur le tampon extérieur et laissez-le reposer pendant environ 10 minutes pour développer une monocouche lipidique à l’interface. Pour préparer les liposomes, ajoutez soigneusement 50 microlitres de l’émulsion finale d’huile tampon à la phase huileuse supérieure du tube. Centrifuger le tube en plastique à 100 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Variez le temps et la vitesse de centrifugation, pour optimiser la formation de liposomes. Retirez délicatement la phase huileuse à l’aide d’une pipette en aspirant le volume supplémentaire si nécessaire. Assurez-vous de ne pas placer l’embout de la pipette sur le côté du tube pour éviter de créer un ménisque d’huile au-dessus de la phase liposomique.

Avec une pipette neuve, coupez l’extrémité de la pipette. Collez lentement la pipette dans la phase inférieure restante et aspirez le volume aqueux pour recueillir les liposomes. Versez 100 microlitres de tampon extérieur dans le puits d’une chambre d’incubation.

Déposez doucement les liposomes collectés dans le tampon extérieur, puis placez un autre couvercle sur le dessus de la chambre. Observez les liposomes avec un microscope confocal à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile de 63 x. Utilisez des lignes laser de 488, 647 et 561 nanomètres.

Pour observer respectivement les lipides marqués par fluorescence, les colorants fluorescents encapsulés et l’actine encapsulée marquée par fluorescence. Capturez les images d’intérêt et enregistrez les images au format TIF. Traitez et analysez les images dans l’image J.Commencez par ouvrir le fichier TIF, à l’aide du logiciel image J.

Accédez à l’image, puis cliquez sur Ajuster. Suivi d’un contraste de luminosité, réglez la luminosité et le contraste de l’image à l’échelle souhaitée en ajustant les paramètres minimum et maximum et les curseurs de luminosité et de contraste. Cliquez sur l’outil de sélection de rectangle dans la barre d’outils et sélectionnez la région d’intérêt.

Accédez à l’image, puis cliquez sur recadrer pour recadrer le retour sur investissement. Accédez à analyser, puis cliquez sur Définir l’échelle. Dans la fenêtre contextuelle, entrez 1,0 dans le champ Format des pixels et définissez micromètre comme unité de longueur.

Dans le champ distance en pixels, entrez la largeur de l’image en pixels. Dans le champ Distance connue, entrez la largeur réelle de l’image en microns. Pour mesurer la taille du liposome, à l’aide de l’outil de sélection ovale de la barre d’outils, tracez un cercle le long du bord du liposome.

Allez à analyser, puis cliquez sur mesurer, pour mesurer la surface du cercle, à partir de laquelle le diamètre du liposome peut être calculé. La génération réussie de liposomes est vérifiée par la visualisation de l’anneau circulaire mince qui est la bicouche lipidique fluorescente verte. Sous un laser de 488 nanomètres utilisant la microscopie confocale pour confirmer l’encapsulation du colorant fluorescent.

L’environnement interne des liposomes doit être uniformément fluorescent sous un laser de 647 nanomètres. La formation de liposomes pourrait être visualisée par les minces anneaux circulaires verts. L’effet reconstitué dans les réseaux à l’intérieur des liposomes est hétérogène, se manifestant par des structures de réseau ramifiées de filaments d’actine.

L’architecture de branche a été déclenchée par l’introduction du complexe ARP deux trois, qui contrôle simultanément la nucléation et la ramification des filaments d’actine, ainsi que VCA HEZ. Une fine couche d’actine densément ramifiée est créée au niveau du feuillet interne de la bicouche de liposomes qui peut être visualisée comme un fluorescent. Le mélange tampon final audio lipidique doit généralement être pompé d’avant en arrière à travers une seringue en verre, pour éviter l’introduction de bulles d’air.

Le mélange doit être blanchâtre après le procédé. Cette technique a ouvert la voie à la construction d’un modèle minimal de la cellule, dépourvu de régulations biochimiques complexes. Avec ce système d’imitation cellulaire, les chercheurs peuvent explorer les propriétés mécaniques et dynamiques des protéines du cytosquelette, du nucléateur et du moteur moléculaire.