Name: Régénération épithéliale intestinale en réponse à une irradiation ionisante (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-27T14:05:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Découvrez la régénération épithéliale intestinale après irradiation gamma chez la souris. Ce protocole permet d'étudier l'activation, la différenciation et la migration cellulaires post-lésion pour mieux comprendre les mécanismes de réparation tissulaire.

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Les auteurs tiennent à remercier le Stony Brook Cancer Center Histology Research Core pour son expertise dans la préparation des échantillons de tissus et la Division of Laboratory Animal Resources de l’Université Stony Brook pour son aide en matière de soins et de manipulation des animaux. Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health DK124342 accordées à Agnieszka B. Bialkowska et DK052230 au Dr Vincent W. Yang.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts.

Ce protocole décrit un modèle robuste et reproductible de lésions radioactives. Il permet l’analyse précise des changements dans l’épithélium intestinal au cours des 7 jours suivant la blessure. Il est important de noter que les points temporels sélectionnés reflètent les étapes cruciales de la lésion et sont caractérisés par des altérations distinctes de l’intestin (phases de lésion, d’apoptose, de régénération et de normalisation)60. Ce modèle d’irradiation a été établi et soigneusement évalué, ...

L’épithélium intestinal humain couvrirait approximativement la surface d’un demi-terrain de badminton s’il était placé complètement à plat1. Au lieu de cela, cette couche cellulaire unique séparant les humains du contenu de leurs intestins est compactée en une série de projections, de villosités et d’indentations en forme de doigts, des cryptes qui maximisent la surface des intestins. Les cellules de l’épithélium se différencient le long d’un axe crypte-villosités. Les villosités sont principalement constituées d’entérocytes absorbant les nutriments, de cellules caliciformes sécrétrices de mucus et de cellules entéroendocrines productrices d’hormones, tandis que les cryptes sont principalement constituées de cellules de Paneth productrices de défensine, de cellules souches actives et de réserve et de cellules progénitrices 2,3,4,5. De plus, la communication bidirectionnelle de ces cellules avec les cellules stromales et immunitaires du compartiment mésenchymateux sous-jacent et le microbiote de la lumière génère un réseau complexe d’interactions qui maintient l’homéostasie intestinale et est essentiel à la récupération après une blessure 6,7,8.
L’épithélium intestinal est le tissu qui s’auto-renouvelle le plus rapidement dans le corps humain, avec un taux de renouvellement de 2-6 jours 9,10,11. Au cours de l’homéostasie, les cellules souches actives à la base des cryptes intestinales (cellules cylindriques de la base cryptique), marquées par l’expression du récepteur couplé à la protéine G 5 (LGR5) riche en protéines répétées et riche en leucine, se divisent rapidement et fournissent des cellules progénitrices qui se différencient en toutes les autres lignées épithéliales intestinales. Cependant, en raison de leur taux mitotique élevé, les cellules souches actives et leurs progéniteurs immédiats sont particulièrement sensibles aux lésions par rayonnement gamma et subissent une apoptose après irradiation 5,12,13,14. Lors de leur perte, les cellules souches de réserve et les cellules non souches (sous-population de progéniteurs et certaines cellules différenciées en phase terminale) au sein des cryptes intestinales subissent une activation et reconstituent le compartiment de la crypte basale, qui peut alors reconstituer les populations cellulaires des villosités et, ainsi, régénérer l’épithéliumintestinal 15. En utilisant des techniques de traçage de la lignée, plusieurs groupes de recherche ont démontré que les cellules souches de réserve (quiescentes) sont capables de soutenir la régénération lors de la perte de cellules souches actives 13,16,17,18,19,20,21,22. Ces cellules sont caractérisées par la présence de l’oncogène de la protéine 1 du complexe polycomb (Bmi1), du gène de la transcriptase inverse de la télomérase de souris (mTert), de l’homéobox du houblon (Hopx) et du gène de la protéine 1 répétitive riche en leucine (Lrig1). En outre, il a été démontré que les cellules non souches sont capables de reconstituer les cryptes intestinales en cas de lésion 23,24,25,26,27,28,29,30,31. En particulier, il a été démontré que les progéniteurs des cellules sécrétoires et des entérocytes subissent une dédifférenciation lors d’une blessure, redeviennent des cellules souches et favorisent la régénération de l’épithélium intestinal. Des études récentes ont identifié des cellules exprimant plusieurs marqueurs qui possèdent la capacité d’acquérir des caractéristiques de type souche en cas de blessure (telles que DLL+, ATOH1+, PROX1+, MIST1+, DCLK1+)32,33,34,35,36. Étonnamment, Yu et al. ont montré que même les cellules de Paneth matures (LYZ +) peuvent contribuer à la régénération intestinale37. De plus, en plus de provoquer l’apoptose des cellules épithéliales intestinales et de perturber la fonction de barrière épithéliale, l’irradiation entraîne une dysbiose de la flore intestinale, l’activation des cellules immunitaires et l’initiation d’une réponse pro-inflammatoire, ainsi que l’activation des cellules mésenchymateuses et stromales38,39.
Le rayonnement gamma est un outil thérapeutique précieux dans le traitement du cancer, en particulier pour les tumeurs colorectales40. Cependant, l’irradiation affecte de manière significative l’homéostasie intestinale en induisant des dommages aux cellules, ce qui conduit à l’apoptose. L’exposition aux rayonnements provoque de multiples perturbations qui ralentissent le rétablissement d’un patient et est marquée par des lésions muqueuses et une inflammation dans la phase aiguë et de la diarrhée, de l’incontinence, des saignements et des douleurs abdominales à long terme. Cette panoplie de manifestations est appelée toxicité des rayonnements gastro-intestinaux. De plus, la progression radio-induite de la fibrose transmurale et/ou de la sclérose vasculaire peut ne se manifester que des années après le traitement38,41. Simultanément à la blessure elle-même, le rayonnement induit une réponse de réparation dans les cellules intestinales qui active les voies de signalisation responsables de l’initiation et de l’orchestration de la régénération42. La maladie de l’intestin grêle radio-induite peut provenir d’une radiothérapie pelvienne ou abdominale administrée à d’autres organes (comme le col de l’utérus, la prostate, le pancréas, le rectum)41,43,44,45,46. Les lésions par irradiation intestinale constituent donc un problème clinique important, et une meilleure compréhension de la physiopathologie qui en résulte est susceptible de faire progresser le développement d’interventions visant à atténuer les complications gastro-intestinales associées à la radiothérapie. Il existe d’autres techniques qui permettent d’étudier le but régénérateur de l’épithélium intestinal en dehors de la radiation. Des modèles murins transgéniques et chimiques pour étudier l’inflammation et la régénération par la suite ont été développés47. Le sulfate de sodium de dextrane (DSS) induit une inflammation dans l’intestin et conduit au développement de caractéristiques similaires à celles de la maladie inflammatoire de l’intestin48. Une combinaison de traitement DSS avec le composé pro-cancérogène azoxyméthane (OMA) peut entraîner le développement d’un cancer associé à la colite48,49. Les lésions induites par la reperfusion ischémique sont une autre méthode utilisée pour étudier le potentiel de régénération de l’épithélium intestinal. Cette technique nécessite de l’expérience et des connaissances chirurgicales50. En outre, les techniques susmentionnées causent différents types de lésions que les rayonnements et peuvent entraîner l’implication de différents mécanismes de régénération. De plus, ces modèles prennent beaucoup de temps, alors que la technique de rayonnement est assez brève. Récemment, des méthodes in vitro utilisant des entéroïdes et des colonoïdes générés par l’intestin et le côlon ont été utilisées en combinaison avec des lésions radiologiques pour étudier les mécanismes de la régénération intestinale51,52. Cependant, ces techniques ne récapitulent pas complètement l’organe qu’elles modélisent53,54.
Le protocole présenté comprend la description d’un modèle murin de lésion par rayonnement gamma en combinaison avec un modèle génétique qui, après un traitement au tamoxifène, permet de retracer les lignées provenant de la population de cellules souches de réserve (Bmi1-CreER; Rosa26eYFP). Ce modèle utilise une irradiation totale du corps de 12 Gy, qui induit des lésions intestinales suffisamment importantes pour activer les cellules souches de réserve tout en permettant l’étude ultérieure de la capacité de régénération intestinale dans les 7 jours suivant la lésion55.

<table><tbody><tr><td>Seringue de 1 mL</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>309659-16G Aiguilles réutilisables pour petits animaux : Droite</td><td>VWR</td><td>20068-630-27G</td><td></td></tr> <tr><td>x 1/2 » aiguille</td><td>BD</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>305109-28G x 1/2 » Monoject 1mL seringue à insuline</td><td>Covidien</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>1188128012-5-Ethynyl-2&prime ;-deoxyuridine (EdU)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc284628A</td><td>10 mg/mL dans du DMSO stérile : eau (1:4 v/v), aliquote et entreposer à -20° ; C</td></tr><tr><td>Azer Scientific&nbsp ; 10 % de formol tamponné neutre</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-026-213-B6.129X1-Gt</td><td></td></tr><tr><td>(ROSA)26Sortm1(EYFP)Cos/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Souche # :006148</td><td></td></tr><tr><td>B6 ; 129-Bmi1tm1(cre/ERT)Mrc/J</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Strain # :010531</td><td></td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine Fraction V, choc thermique</td><td>Millipore-Sigma</td><td>3116956001</td><td></td></tr><tr><td>Poulet anti-GFP</td><td>Aves</td><td>GFP-1020</td><td></td></tr><tr><td>Click-IT plus EdU Alexa Fluor 555 kit d’imagerie, Invitrogen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10638-Huile</td><td></td></tr> <tr><td>de maïs</td><td>Millipore-Sigma</td><td>C8267-Chambre</td><td></td></tr> <tr><td>de dévoilement</td><td>Biocare Medical</td><td>DC2012-Sulfoxyde</td><td></td></tr> <tr><td>de diméthyle (DMSO)</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP231-100</td><td>DNaase sensible à la lumière</td></tr><tr><td>protéinase K</td><td>Invitrogen</td><td>C10618H</td><td>diluée 25x dans DPBS</td></tr><tr><td>Donkey anti-poulet AF647</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>703-605-155</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-031-CV-Eosin</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Fisher</td><td>Scientific S176</td><td></td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence Nikon Eclipse 90i Lumière vive et fluorescente, avec objectifs : 10X, 20X</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount Montage aqueux Medium</td><td>Millipore-Sigma</td><td>F4680-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Gamma Cell 40 Exactor</td><td>Best Theratronics Ltd.</td><td>-</td><td>0.759 Gy min-1</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin AF488</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>111-545-144</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hématoxyline, Gill n° 3</td><td>Millipore-Sigma</td><td>GHS332</td><td></td></tr><tr><td>HM 325 Microtome rotatif de Thermo Scientific</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-900-668</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33258, pentahydraté (bis-benzimide)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3569</td><td>dilution 1:1000</td></tr><tr><td>Solution de peroxyde d’hydrogène, ACS, 29-32 %, Spectrum Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-603-252-Kit</td><td></td></tr> de <tr><td>détection de la mort cellulaire in situ, fluorescéine (Roche)</td><td>Millipore-Sigma</td><td>11684795910</td><td></td></tr><tr><td>bloqueur de liquide Super PAP PEN, Mini</td><td>Fisher Scientific</td><td>DAI-PAP-S-M</td><td></td></tr><tr><td>Carbonate de lithium (poudre/certifié ACS), Fisher Chemical</td><td>Fisher Scientific</td><td>L119-500</td><td>0,5 g/1 L dH2O</td></tr><tr><td>Seringue Luer-Lok stérile, usage unique, 10 mL</td><td>VWR</td><td>89215-218-Méthanol</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>VWR</td><td>BDH1135-4LP</td><td></td></tr><tr><td>Produits Pharmco. Alcool éthylique, 200 PROOF</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NC1675398-Pharmco-Aaper 281000ACSCSLT Acide acétique ACS Grade</td><td>Capitol Scientific</td><td>AAP-281000ACSCSLT-Rabbit</td><td></td></tr> <tr><td>anti-Ki67</td><td>BioCare Medical</td><td>CRM325</td><td></td></tr><tr><td>Richard-Allan Scientific Cytoseal XYL Milieu de montage</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-050-262</td><td></td></tr><tr><td>Scientific Industries Incubator-Genie pour la cuisson de lames à 65 degrés</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-728-103</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium dihydraté</td><td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dissection en acier inoxydable</td><td>VWR</td><td>25640-002</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus micro lames [taille : 25 x 75 x 1 mm]</td><td>VWR</td><td>&nbsp ; 48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Tamoxifène</td><td>Millipore-Sigma</td><td>T5648</td><td>30 mg/mL dans de l’huile de maïs stérile, de préférence fraîche ou à court terme à -20° ; C, sensible à la lumière</td></tr><tr><td>Tissue-Tek 24-Slide Supports avec poignée amovible</td><td>Sakura</td><td>4465</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek&nbsp ; Accu-Edge&nbsp ; Lames à profil bas</td><td>Sakura</td><td>4689</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-tek&nbsp ; Kit de coloration manuelle</td><td>Sakura</td><td>4451</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Plat de coloration, vert avec couvercle</td><td>Sakura</td><td>4456</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Tek Staining Dish, blanc avec couvercle</td><td>Sakura</td><td>4457</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Millipore-Sigma</td><td>P7949</td><td></td></tr><tr><td>Unisette Cassettes de traitement</td><td>VWR</td><td>87002-292-VWR</td><td></td></tr> <tr><td>Micro Cover Glasses</td><td>VWR</td><td>48393-081</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>Fisher Scientific</td><td>X5P-1GAL</td><td></td></tr></tbody></table>

régénération épithéliale intestinale en réponse à une irradiation ionisante

Intestinal Epithelial Regeneration in Response to Ionizing Irradiation

L’épithélium intestinal est constitué d’une seule couche de cellules, mais contient plusieurs types de cellules différenciées en phase terminale, qui sont générées par la prolifération active de cellules souches intestinales situées au fond des cryptes intestinales. Cependant, lors d’événements de lésions intestinales aiguës, ces cellules souches intestinales actives subissent la mort cellulaire. L’irradiation gamma est un traitement du cancer colorectal largement utilisé qui, bien qu’efficace sur le plan thérapeutique, a pour effet secondaire d’épuiser le pool de cellules souches actives. En effet, les patients souffrent fréquemment d’un syndrome de radiation gastro-intestinale pendant la radiothérapie, en partie en raison de l’épuisement actif des cellules souches. La perte de cellules souches intestinales actives dans les cryptes intestinales active un pool de cellules souches intestinales de réserve typiquement quiescentes et induit une dédifférenciation des cellules précurseurs sécrétoires et entérocytaires. Sans ces cellules, l’épithélium intestinal n’aurait pas la capacité de se remettre de la radiothérapie et d’autres agressions tissulaires majeures. De nouvelles avancées dans les technologies de traçage de lignée permettent de suivre l’activation, la différenciation et la migration des cellules pendant la régénération et ont été utilisées avec succès pour étudier cela dans l’intestin. Cette étude vise à décrire une méthode d’analyse des cellules de l’épithélium intestinal de la souris à la suite d’une lésion radiologique.

L’utilisation de l’irradiation totale du corps (TBI) de 12 Gy en combinaison avec le traçage génétique murin de la lignée permet une analyse approfondie des conséquences des lésions radiologiques dans l’intestin. Pour commencer, Bmi1-CreER; Les souris Rosa26eYFP ont reçu une seule injection de tamoxifène, ce qui induit une expression améliorée de la protéine fluorescente jaune (EYFP) au sein d’une population de cellules souches de réserve Bmi1+ . Deux jours après l’injection de t...

Le tractus gastro-intestinal est l’un des organes les plus sensibles aux blessures lors des traitements radiothérapeutiques contre le cancer. C’est à la fois un système d’organes avec l’une des capacités de régénération les plus élevées à la suite de telles insultes. Le protocole présenté décrit une méthode efficace pour étudier la capacité de régénération de l’épithélium intestinal.

Régénération épithéliale intestinale en réponse à une irradiation ionisante

The intestinal epithelium consists of a single layer of cells yet contains multiple types of terminally differentiated cells, which are generated by the ...

L’irradiation gamma est un traitement largement utilisé pour le cancer colorectal. Et bien qu’il soit thérapeutiquement efficace, il a des effets négatifs sur le tractus gastro-intestinal. Le protocole présenté décrit une méthode efficace pour étudier l’activation, la différenciation et la migration des cellules pendant la régénération après une lésion radiologique.Ce protocole décrit un modèle robuste et reproductible de lésions radioactives. Il est important de noter que ce modèle permet de suivre le devenir des cellules intestinales à la suite d’une blessure et permet ainsi de mieux comprendre la capacité de régénération d’une sous-population cellulaire spécifique. Cette technique peut utiliser des modèles animaux distincts de traçage de lignée pour étudier le comportement en temps réel et l’interaction de diverses sous-populations de cellules après une blessure.Des modifications mineures de ce protocole devraient permettre d’étudier les relations entre le microbiote et différentes populations de cellules épithéliales, stromales et immunitaires en cas de lésion radiologique. Pour commencer, remettez en suspension la poudre de tamoxifène dans de l’huile de maïs stérile à une concentration de 30 microgrammes par microlitre. Sonicate pendant trois minutes en 30 secondes cycles marche-arrêt avec une amplitude de 60%.Mélanger par rotation dans l’obscurité pendant une heure à température ambiante. Ensuite, préparez EdU en ajoutant du DMSO stérile à la poudre EdU. Ajouter 1/5 du volume total et ajouter lentement le volume restant d’eau ultrapure stérile.Une fois complètement dissous, aliquote et conserver à 20 degrés Celsius. Préparer des réactifs pour la collecte et la fixation des tissus, tels que l’éthanol à 70 % dans l’eau, le DPBS refroidi à quatre degrés Celsius, le tampon fixateur de Bouin et le formol tamponné à 10 %. Ensuite, préparez l’équipement nécessaire, tel qu’un kit de dissection de souris, des boîtes de Petri, une aiguille de gavage de calibre 16 fixée à une seringue de 10 millilitres et des cassettes histologiques.Deux jours avant l’exposition à l’irradiation gamma, préparer les animaux de laboratoire à l’injection de tamoxifène. Pesez chaque animal et calculez la dose requise. Désinfectez la région abdominale avec de l’éthanol à 70%.Ensuite, administrer une dose unique de tamoxifène par voie intrapéritonéale à l’aide d’une aiguille de calibre 27 fixée à une seringue d’un millilitre pour induire une recombinaison médiée par Cre. Observez les animaux pendant les prochaines 48 heures pour exclure toute toxicité potentielle du tamoxifène. Après 48 heures, transférez les animaux dans la salle d’irradiation.Désinfectez la chambre d’échantillonnage dans l’irradiateur gamma avec une solution d’éthanol à 70%. Placez le tapis absorbant et les animaux à l’intérieur de la chambre d’échantillonnage. Placez le couvercle et fermez la chambre.Programmez l’irradiateur gamma pour exposer les animaux à 12 gris d’irradiation corporelle totale. Ensuite, tournez la clé sur la position de départ et appuyez sur Démarrer pour lancer l’exposition. Quittez la pièce pour un temps d’exposition actif.Une fois le temps prédéfini écoulé, la machine s’arrête automatiquement et commence à émettre un bip. Éteignez la machine en tournant la clé en position d’arrêt. Ouvrez la chambre d’échantillonnage et retirez le couvercle.Transférer les animaux dans la cage et désinfecter la chambre d’échantillonnage avec de l’éthanol à 70%. Transférez les animaux dans la salle de logement conventionnelle et observez leur état après le traitement. Surveillez le poids des animaux tous les jours.Trois heures avant l’euthanasie prévue, désinfectez la région abdominale et injectez aux souris par voie intrapéritonéale 100 microlitres de solution mère d’EdU à l’aide d’une seringue à insuline de calibre 28. Après avoir euthanasié l’animal, prélever les intestins proximaux à différents moments après l’irradiation. Disséquez la partie proximale de l’intestin grêle et retirez les tissus attachés.Rincez le tissu avec du DPBS froid à l’aide d’une aiguille d’alimentation droite de calibre 16 fixée à une seringue de 10 millilitres et fixez le tissu avec le tampon fixateur de Bouin. Coupez les intestins ouverts longitudinalement et roulez les intestins proximaux en utilisant la technique Swiss-roll. Placez les tissus dans une cassette histologique dans un récipient contenant du formol tamponné à 10% et incuber pendant 24 à 48 heures à température ambiante.Après l’incubation, transférer les cassettes histologiques à 70% d’éthanol et incorporer le tissu dans de la paraffine. Après l’intégration, placez les cassettes histologiques sur de la glace pendant au moins une heure. Ensuite, coupez des sections horizontales de cinq microns d’épaisseur à l’aide d’un microtome.Transférer les sections de tissu dans un bain-marie chauffé à 45 degrés Celsius et placer les sections sur des lames chargées. Laissez sécher les lames sur une grille pendant la nuit à température ambiante. Les images d’hématoxyline et d’éosine d’échantillons d’intestin grêle ont montré un épithélium intestinal homéostatique à zéro heure, suivi de la perte de cellules dans les compartiments cryptiques pendant la phase apoptotique.Cela a été suivi par la phase de régénération dans laquelle les cellules hautement prolifératives ont peuplé les cryptes, conduisant à la phase de normalisation au septième jour. Le traçage de la lignée par EYFP a montré que pendant l’homéostasie, les cellules provenant des cellules souches de réserve positive Bmi1 étaient limitées aux positions plus quatre à plus six dans les cryptes. La coloration EdU et Ki-67 a montré une homéostasie intestinale normale chez des souris irradiées simulées, s’étendant des cellules souches actives à travers la zone amplifiant le transit.Au cours de la phase apoptotique, le nombre de cellules EYFP-positives a diminué, accompagné d’une perte de cellules prolifératives causée par les dommages causés par les radiations. Dans la phase de régénération, l’activation des cellules souches de réserve et la prolifération rapide des cellules Bmi1-positives ont été observées. La poursuite de la prolifération et de la migration a restauré l’intégrité de l’épithélium intestinal.La coloration TUNEL a montré que les cellules apoptotiques sont absentes pendant l’homéostasie. Une augmentation de la coloration TUNEL a été observée tard dans la phase apoptotique. Au cours de la phase de régénération, la coloration TUNEL a diminué régulièrement dans les cryptes en régénération et était presque absente lorsque les cryptes se sont normalisées.Cette technique peut être combinée avec le séquençage de l’ARN, le séquençage de l’ARN unicellulaire, le tri cellulaire activé par fluorescence ou l’analyse protéomique pour glaner des connaissances plus approfondies sur le rôle de lignées cellulaires spécifiques pendant la régénération intestinale à la suite d’une blessure. Les chercheurs peuvent étudier les interactions entre le microbiote et les populations de cellules épithéliales, stromales et immunitaires dans la régénération intestinale afin d’élargir la compréhension de la capacité de régénération de l’épithélium intestinal.

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Biologie

Lésions rénales aiguës (IRA) chez les humains est un problème clinique fréquent causé par des dommages aux cellules épithéliales qui forment néphrons du rein, et Aki est associée à des taux de mortalité élevé de 50-70% 1. Suite à la destruction des cellules épithéliales, néphrons ont une capacité limitée à se régénérer, même si les mécanismes et les limites qui guident ce phénomène reste mal compris. Dans cet article, vidéo, nous décrivons notre technique pour l'ablation laser ciblée des...

Laser Ablation de l&#39;pronéphros Zebrafish d&#39;étude rénale régénération épithéliale

Une méthode efficace pour le greffage des tissus de taille définie et cohérente entre les planaires est décrite. On y trouve aussi une description de la façon dont la technique d'immobilisation utilisée pour la transplantation peut être adapté, en collaboration avec des boucliers de plomb, pour l'irradiation partielle d'animaux vivants.

Immobilisation planaire, l&#39;irradiation partielle, et la transplantation de tissus

Nous présentons un protocole afin d’étudier la diaphonie entre Caco-2 X-ray-irradiés et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC). Le protocole commence par irradiation de Caco-2 et de la mise en place de la co-culture avec PBMC ; par la suite, trans-épithéliales résistance électrique est régulièrement mesurée 48 tache h et occidentale exécutée en Caco-2 et PBMC.

Une méthode de culture mixte d’enquêter sur les interférences entre les rayons x irradiés PBMC et cellules Caco-2

Ici, nous présentons un protocole pour établir les points de terminaison importants et les marqueurs proliérants des petites lésions intestinales et de l'hyperprolifération compensatoire utilisant un modèle de muqueuse chimiothérapie-induite. Nous démontrons la détection des cellules proliférantes utilisant un marqueur spécifique de cycle cellulaire et utilisant le petit poids intestinal, la profondeur de crypte, et la taille de villus comme points de terminaison.

Points de terminaison et marqueurs proliférants importants pour évaluer les petites blessures intestinales et l'adaptation à l'aide d'un modèle de souris de mucosite induite par la chimiothérapie

Les organoïdes développés à partir de glandes mammaires de souris ont été irradiés et caractérisés pour évaluer les traits épithéliaux et les interactions avec les cellules immunitaires. Les organoïdes irradiés peuvent être utilisés pour mieux évaluer les interactions de cellules cellulaires qui peuvent conduire au recrutement de cellules tumorales dans le tissu normal irradié.

Croissance et caractérisation des organoïdes irradiés des glandes mammaires

L’utilisation de cultures organotypiques tridimensionnelles pour visualiser la morphologie et les marqueurs fonctionnels des glandes salivaires peut donner de nouvelles perspectives sur les mécanismes des lésions des tissus après rayonnement. Décrit ici est un protocole à la section, culture, irradier, tache, et l’image des sections de glande salivaire d’épaisseur 50 – 90 μM avant et après l’exposition aux rayonnements ionisants.

Traitement par rayonnement des cultures organotypiques de modèles de glandes salivaires sous-mandibulaires et parotides clés caractéristiques in vivo

La réponse aux dommages causés par l’ADN par rayonnement activé par le faisceau mixte de neutrons utilisé dans la thérapie de capture de neutrons de bore (BNCT) n’a pas été entièrement établie. Ce protocole fournit une procédure étape par étape pour détecter les foyers induits par rayonnement (RIF) des protéines de réparation par la coloration d’immunofluorescence dans les lignées cellulaires du cancer du côlon humain après irradiation avec le faisceau mélangé à neutrons.

Imagerie d’immunofluorescence des dommages d’ADN et des foyers de réparation dans les cellules cancéreuses du côlon humain

Ici, nous présentons une méthode pour obtenir des images de l’intestin lors d’une blessure induite par laser. En exposant l’intestin de la souris à un laser multiphotonique, la perte d’une ou de plusieurs cryptes est induite localement. En imageant à plusieurs reprises la zone endommagée pendant des mois, la dynamique en temps réel de la récupération intestinale est capturée.

Ablation au laser et microscopie intravitale pour étudier le remodelage intestinal

Nous décrivons un protocole détaillant l’isolement des cryptes coliques murines pour le développement de colonoïdes en 3 dimensions. Les colonoïdes établis peuvent ensuite être différenciés en phase terminale pour refléter la composition cellulaire de l’épithélium hôte avant de recevoir un défi inflammatoire ou d’être dirigés vers l’établissement d’une monocouche épithéliale.

Étude des effets épithéliaux de l’inflammation intestinale in vitro sur les colonoïdes murins établis

L’imagerie par immunofluorescence est limitée par la capacité d’observer des processus biologiques complexes et dépendants du temps en un seul instantané dans le temps. Cette étude décrit une approche d’imagerie en direct menée sur des coupes de glandes sous-maxillaires de souris découpées avec précision. Cette approche permet d’observer en temps réel les interactions cellule-cellule au cours de l’homéostasie et des processus de régénération et de réparation.

Interrogation des interactions cellule-cellule dans la glande salivaire par imagerie ex vivo de cellules vivantes

Découvrez la régénération épithéliale intestinale après irradiation gamma chez la souris. Ce protocole permet d'étudier l'activation, la différenciation et la migration cellulaires post-lésion pour mieux comprendre les mécanismes de réparation tissulaire.

Régénération épithéliale intestinale en réponse à une irradiation ionisante

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