Évaluation non destructive de la densité cellulaire régionale dans les agrégats tumoraux après un traitement médicamenteux

Ce protocole fournit des informations sur la progression du modèle tumoral de manière non destructive. Il donne également des indications de réponse thérapeutique à travers des schémas thérapeutiques entiers dans des agrégats singuliers plutôt que de s’appuyer sur des échantillons de correspondance d’âge. Les méthodes conventionnelles pour obtenir la densité cellulaire et la viabilité dans les agrégats nécessitent la fixation et la section des échantillons, tandis que les nôtres fournissent des données de manière non destructive.

Ainsi, les changements peuvent être suivis dans un seul agrégat au fil du temps. Cette technique devrait améliorer notre compréhension de la réponse aux médicaments dans les régions discrètes des modèles agrégés, avec des implications sur la façon dont ces modèles reflètent les réponses in vivo et les applications de dépistage des médicaments. Pour commencer, préparez des cultures cellulaires à confluence de 70 à 90% des lignées cellulaires souhaitées dans des conditions standard.

Détacher les monocouches cellulaires de leurs flacons de culture en suivant la méthode de trypsinisation standard et ajouter la suspension cellulaire dans un tube de centrifugeuse. Ajouter 10 microlitres de la suspension cellulaire à un hémocytomètre et compter par microscopie pour déterminer le nombre de cellules dans la suspension. Cellules à granulés par centrifugation et remise en suspension de cellules dans des milieux à la concentration souhaitée de 2,5 fois 10 à la cinquième cellule par millilitre.

Pour les suspensions préparées avec la matrice de la membrane basale, retirer le flacon de matrice de l’entreposage à moins 20 degrés Celsius et le placer au réfrigérateur pour qu’il décongele pendant la nuit. Préparer un récipient avec un milieu de croissance et réfrigérer pendant 10 minutes pour le refroidir. À l’aide d’une pointe de pipette congelée, ajouter la matrice au milieu réfrigéré de telle sorte que la concentration finale de cette solution soit de 5 % Ajouter 50 microlitres de ce milieu à chaque puits d’une plaque de 96 puits à fond rond et non adhérente, de sorte que la concentration finale de la matrice dans ces puits sera de 2,5 % après l’ajout de la suspension cellulaire.

Pour les suspensions préparées sans matrice, ajoutez 50 microlitres de milieux de croissance ordinaires à chaque puits. Distribuer 50 microlitres de suspension cellulaire dans chaque puits. Centrifuger les plaques à 123 G pendant 10 minutes à température ambiante immédiatement après l’ensemencement pour assurer la collecte d’une pastille cellulaire au fond de chaque puits.

Utilisez un système OCT pour l’imagerie structurelle. Réglez la fréquence de numérisation A sur 5,5 kilohertz pour la collecte d’images haute résolution. Réglez l’indice de réfraction à 1,33 pour les échantillons dans un milieu liquide.

Dans la fenêtre des paramètres de l’image sur le côté droit de l’écran, définissez le champ de vision en entrant des valeurs X, Y et Z de sorte que l’échantillon soit englobé dans cette région d’intérêt. Cliquez sur Mode d’acquisition 3D, puis sur Enregistrer pour collecter le scan de volume 3D de l’échantillon. Pour créer une reconstruction de volume, ouvrez Imaris et accédez au fichier TIF converti dans leur arène.

Accédez à Modifier, puis cliquez sur Propriétés de l’image et entrez la taille du voxel de l’image de l’OPO dans les zones XYZ correspondantes. Ensuite, cliquez sur OK. Cliquez sur Ajouter de nouvelles surfaces au-dessus de l’arborescence des objets. Dans le menu sous l’arborescence, cliquez sur Ignorer la création automatique et modifiez manuellement.

Dans la fenêtre de réglage de l’affichage, faites glisser manuellement les flèches rouge et noire pour améliorer le contraste entre l’échantillon et l’arrière-plan et améliorer la visualisation de l’échantillon. Ajustez la position de la tranche à la tranche située sur un bord de l’échantillon. Utilisez la touche d’échappement pour changer la souris du mode de navigation au mode de sélection, puis cliquez sur Dessiner.

Tracez manuellement le contour de la région affichant le signal. Avancez la position de la tranche en entrant la position suivante dans la zone de saisie. Cette position suivante doit être inférieure ou égale à 100 tranches plus loin dans l’échantillon que la précédente.

Tracez manuellement la région affichant le signal. Répétez cette étape à travers l’épaisseur de l’échantillon jusqu’à ce que le bord opposé de l’échantillon soit atteint. Cliquez ensuite sur Créer une surface et sur le menu de gauche pour assembler ces tranches.

Enfin, cliquez sur Modifier, puis sur Sélection du masque, puis sur OK pour terminer la reconstruction du volume. Pour obtenir la densité cellulaire totale de l’échantillon, sélectionnez Ajouter de nouveaux points. Dans le menu des paramètres de l’algorithme, désélectionnez toutes les cases.

Cliquez sur la flèche bleue pour accéder à l’écran du canal source. Dans le menu déroulant qui s’affiche, sélectionnez le canal masqué. Entrez le diamètre moyen de la cellule pour l’échantillon dans la zone Diamètre XY.

Assurez-vous que la soustraction d’arrière-plan est cochée. Cliquez sur la flèche bleue pour accéder à l’écran du spot de classification. Dans le graphique en bas du menu, cliquez et faites glisser le bord gauche du seuil jaune vers le bord gauche du graphique de sorte que tous les objets soient inclus dans le seuil ombré jaune.

Cliquez ensuite sur la flèche verte pour terminer la création du spot. Obtenez le nombre d’objets identifiés en cliquant sur Statistiques. Cliquez ensuite sur Global et enfin sur Nombre total de places.

Cliquez sur la surface créée et accédez à l’onglet Qualité du style de surfaces. Remplacez la sélection par Point central et modifiez la largeur des pixels à moins de 20 pour une meilleure visibilité. Accédez à Statistiques.

Cliquez ensuite sur Détaillé, puis sur Position et enregistrez l’emplacement à l’endroit central. Sélectionnez Ajouter un nouveau cadre de référence dans le menu situé au-dessus de l’arborescence des objets. Cochez les cases visibles et fixes à côté des X, Y dans le menu.

Cliquez et faites glisser le centre de l’icône du cadre de référence de manière à ce qu’il soit aligné avec le point central. Désélectionnez les zones XY visible et fixe et sélectionnez-les pour XZ. Encore une fois, cliquez et faites glisser le centre de l’icône du cadre de référence de sorte qu’il soit aligné avec le point central. Enfin, répétez cette opération pour le plan YZ, en alternant entre ces trois plans fixes jusqu’à ce que le repère de référence s’aligne parfaitement avec le point central.

Double-cliquez sur le cadre de référence dans l’arborescence des objets et renommez-le centre ou similaire. Cliquez sur les spots créés et accédez à Statistiques. Cliquez ensuite sur Détaillé, puis sur Cadre de référence de position.

Cliquez sur le repère de référence de position X jusqu’à ce qu’il trie la valeur la plus élevée à la valeur la plus basse. Enregistrez la valeur la plus élevée pour obtenir le rayon des agrégats. Effectuez des calculs manuels pour déterminer d’autres lieux d’intérêt.

Pour ce faire, ajoutez 100 micromètres à la valeur du centre X, puis utilisez les valeurs Y et Z du point central pour définir le premier emplacement le long de l’axe central. Sélectionnez Ajouter de nouveaux spots. Sélectionnez ensuite Ignorer manuellement la modification de la création automatique.

Maintenez le bouton Maj du clavier enfoncé et cliquez n’importe où sur l’écran pour placer un nouvel endroit. Entrez les valeurs de position XYZ pour le premier emplacement d’intérêt. Sélectionnez ensuite Ajouter un nouveau cadre de référence et alignez-le sur le spot.

Ajoutez 100 micromètres à chaque emplacement X séquentiel. Placez le dernier repère de référence à une distance inférieure à 50 micromètres du rayon extérieur de l’échantillon. Cliquez sur les spots créés et accédez à Statistiques.

Dans le coin inférieur droit du menu, cliquez sur Exporter toutes les statistiques dans un fichier et enregistrez les données dans une feuille de calcul. Ouvrez la feuille de calcul. Accédez à l’onglet Du cadre de référence de distance par rapport à l’origine.

Utilisez la fonction mod pour attribuer numériquement chaque distance à son cadre de référence correspondant. Filtrez les valeurs de cette colonne pour utiliser les distances de chaque cadre de référence. Pour chacun des cadres de référence, calculez le nombre d’objets à moins de 50 micromètres du cadre à l’aide de la fonction COUNTIF.

La valeur résultante correspond au nombre de cellules de cette fiche régionale. Divisez cette valeur par le volume de la fiche de 100 micromètres pour obtenir la densité cellulaire. Les tests T de Student ont révélé une densité cellulaire significativement plus élevée dans le noyau sphéroïde que dans les couches transitoires et externes pour les modèles sphéroïdes MDA-MB-231.

Le résultat indique un compactage dans ce noyau sphéroïde après quatre jours. Dans les modèles agrégés AU565 et MDA-MB-231, l’ajout de la matrice ne semble pas affecter le volume ou le nombre de cellules, et semble donc avoir une influence négligeable sur la prolifération cellulaire. Au contraire, l’addition de matrice semble redistribuer la densité cellulaire favorisant un compactage important du noyau et diminuant la densité cellulaire dans les couches externes.

Ces résultats fournissent des informations précieuses sur les mécanismes physiques par lesquels la matrice permet l’agrégation cellulaire dans différentes lignées cellulaires de cancer du sein. En regardant ensuite les tumeurs au565 sphéroïdes préparées avec une matrice, les agrégats matures ont été traités avec du trastuzumab et la densité cellulaire régionale a été évaluée par un régime médicamenteux de cinq jours. Des bouchons ont été réglés tous les 100 micromètres sur toute l’épaisseur des agrégats.

Des fluctuations mineures de la densité cellulaire ont été observées au fil du temps dans les 500 micromètres internes de chaque agrégat, ce qui indique une mort cellulaire minimale. La visualisation de la mort cellulaire en tant que réponse médicamenteuse indicative, principalement dans les couches externes des sphéroïdes tumoraux, est cohérente avec les problèmes de pénétration des médicaments du trastuzumab. Nous pouvons maintenant mesurer de manière non destructive la viabilité cellulaire dans les agrégats sans sacrifier la structure.

Cela permet d’évaluer la réponse longitudinale des médicaments dans des agrégats tumoraux singuliers afin d’identifier les qualités temporelles et de pénétration des médicaments anticancéreux candidats.