Name: Un nouveau modèle ex vivo de plaies cutanées ovines à haut débit pour tester les antibiotiques émergents (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Découvrez un modèle ex vivo de peau ovine blessée infectée par Staphylococcus aureus pour tester l'efficacité antimicrobienne. Cette méthode réduit l'utilisation animale et accélère la traduction clinique des antibiotiques topiques.

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Les auteurs tiennent à remercier EPSRC (EP/R513313/1) pour son financement. Les auteurs aimeraient également remercier R.B Elliot and Son Abattoir à Calow, Chesterfield, pour avoir fourni des têtes d’agneau et pour avoir été si accommodantes dans les premières étapes du projet, Kasia Emery pour son soutien tout au long de l’élaboration de ce protocole, et Fiona Wright du Département des infections, de l’immunité et des maladies cardiovasculaires de l’Université de Sheffield pour le traitement des échantillons histologiques et leur aide incroyable tout au long de ce projet.

Les têtes d’agneau de l’abattoir R.B Elliott and Son ont été utilisées comme source d’échantillons de peau dans le cadre de ce projet. Tous les agneaux ont été abattus pour être consommés comme aliments. Au lieu de jeter les têtes, celles-ci ont été réutilisées pour la recherche. L’approbation éthique n’était pas requise puisque les tissus provenaient de déchets jetés dans les abattoirs.
1. Stérilisation
<ol><li>Désinfecter les pinces avant la collecte des têtes en prenant des pinces propres et en effectuant une stérilisation à la chaleur sèche dans une étuve à 200 °C pendant 1 h. Autoclaver toute la verrerie à 121 °C pendant 15 min avant utilisation.</li>
	<li>Effectuer tous les travaux décrits dans une armoire de classe de microbiologie 2. Préparez tous les réactifs conformément aux instructions du fabricant.</li>
</ol>2. Prélèvement d’échantillons
<ol><li>Dans l’abattoir, les agneaux de Swaledale étaient abattus par étourdissement à l’aide d’électricité ou d’un pistolet à tige captive et exsanguinés. Collecter les têtes d’agneau au plus tard 4 heures après l’abattage.</li>
</ol>3. Préparation des têtes
<ol><li>Désinfecter la section frontale de l’agneau en versant environ 100 mL de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm sur la zone d’échantillonnage. Raser la section frontale de la tête à l’aide d’une tondeuse électrique et laver la zone avec 200 ml de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm.</li>
	<li>Essuyez la zone avec de l’éthanol et un rouleau bleu et couvrez la zone d’échantillon avec de la crème dépilatoire pendant 35 min. Grattez délicatement la crème dépilatoire à l’aide d’un outil de grattage et évaluez la zone d’échantillonnage. S’il reste une quantité importante de poils, répétez le processus d’épilation.</li>
	<li>Utilisez 200 mL supplémentaires de solution de dioxyde de chlore pour rincer la zone, puis rincez à l’éthanol et essuyez avec un rouleau bleu.</li>
	<li>À l’aide d’un poinçon de biopsie stérile de 8 mm, découper des échantillons de peau de 8 mm dans la zone préparée. Retirez les échantillons à l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel à 15 lames, en veillant à ce que toute la graisse cutanée soit éliminée.</li>
	<li>Placer les échantillons dans un pot stérile de 0,5 L rempli de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile, puis les transférer dans des tubes stériles de 50 mL avec 50 mL de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm, inverser deux fois, et laisser stériliser pendant 30 minutes.</li>
	<li>Retirez les échantillons de la solution de dioxyde de chlore et lavez-les en les plaçant dans un tube de 50 mL rempli de 40 mL de PBS stérile. Une fois lavé, placez chaque échantillon de peau dans un puits séparé d’une assiette de 24 puits.</li>
	<li>Ajouter 350 μL de milieu préchauffé tout en maintenant l’échantillon à l’interface air-liquide. La composition du milieu est la suivante : milieu MK (milieu 199 avec sels de Hanks, L-glutamate et 1,75 mg/mL de bicarbonate de sodium) et F12 de Ham dans un rapport de 1:1, avec ajout de FBS (10 % v/v), EGF (10 ng/mL), insuline (5 μg/mL), pénicilline-streptomycine (100 U/mL) et amphotéricine B (2,5 μg/mL).</li>
	<li>Sceller les plaques à 24 puits avec un joint de plaque perméable aux gaz et incuber à 37 °C dans un incubateur de tissus humidifié à 5% de CO2 pendant 24 heures maximum.</li>
</ol>4. Conservation des échantillons de peau
<ol><li>Après l’incubation, retirer le milieu de culture et rincer les échantillons dans 500 μL de PBS stérile. Ajouter un milieu sans antibiotique à chaque échantillon et incuber à 37 °C dans un incubateur tissulaire humidifié à 5 % de CO2 pendant 24 h pour éliminer les antibiotiques résiduels dans l’échantillon.</li>
	<li>Si une turbidité ou une infection fongique se développe dans le milieu sans antibiotique après 24 heures, jetez l’échantillon.</li>
</ol>5. Préparation de l’inoculum
<ol><li>Préparez un tube de 50 ml avec 10 ml de bouillon de soya tryptique stérile. Prenez une plaque de gélose fraîche de S. aureus et utilisez un écouvillon pour transférer plusieurs colonies dans le bouillon. Incuber pendant 18 h à 37 °C à 150 tr/min.</li>
	<li>Centrifuger à 4 000 x g pendant 3 min. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 10 mL de PBS stérile. Répétez deux fois pour assurer un lavage adéquat des cellules.</li>
	<li>Ajuster l’inoculum à 0,6 OD600 dans du PBS stérile. Confirmer la charge d’inoculum en effectuant une numération manuelle viable sur la plaque.</li>
</ol>6. Infection des échantillons de peau
<ol><li>Préparez une nouvelle assiette de 24 puits avec 400 μL de milieu préchauffé sans antibiotique et ajoutez les inserts de 24 puits à l’aide de pinces stériles.</li>
	<li>Retirez le média des échantillons de peau, lavez avec 500 μL de PBS stérile et retirez le lavage. Utilisez des pinces stériles pour maintenir doucement l’échantillon au fond du puits.</li>
	<li>Utilisez une biopsie à l’emporte-pièce de 4 mm pour faire un lambeau central de la plaie, perçant à une profondeur approximative de 1-2 mm. Ensuite, utilisez un scalpel à 15 lames et une pince à tissus allis à dents stériles pour enlever la couche supérieure du lambeau de la plaie. La variabilité des dimensions de la plaie peut affecter l’issue de l’infection et les unités formant colonies (UFC).</li>
	<li>Une fois que tous les échantillons ont été blessés, transférez-les dans les inserts de 24 puits à l’aide de pinces stériles. Pipeter 15 μL de l’inoculum bactérien dans le lit de la plaie. Ensuite, incuber pendant 24 h à 37 °C dans un incubateur tissulaire humidifié à 5% de CO2 .</li>
	<li>Si des périodes d’incubation plus longues sont nécessaires, retirez le média et remplacez-le par un média frais toutes les 24 heures et incuber dans les mêmes conditions.</li>
</ol>7. Détermination de la charge bactérienne
<ol><li>Retirez le média du fond des puits. À l’aide d’une pince stérile, transférer chaque échantillon dans un tube séparé de 50 mL rempli de 1 mL de PBS stérile.</li>
	<li>Utilisez un homogénéisateur à pointe fine pour homogénéiser la surface de l’échantillon. Veillez à ce que le lit de la plaie soit en contact direct avec l’extrémité de l’homogénéisateur.</li>
	<li>Homogénéiser chaque échantillon pendant 35 s à moyen/vif. L’homogénéisateur détache les bactéries de la surface du lit de la plaie pour permettre le dénombrement de la charge bactérienne.</li>
	<li>Une fois tous les échantillons traités, vortex chaque échantillon, à tour de rôle, avant le pipetage. Ceci afin de s’assurer que l’homogénat bactérien est mélangé.</li>
	<li>Pipeter 20 μL d’homogénat vortex dans le puits correspondant d’une plaque de 96 puits contenant 180 μL de PBS stérile.</li>
	<li>Diluer en série chaque homogénat d’échantillon à 1 x 10−7 et pipeter 10 μL de l’homogénat dilué sur une plaque de gélose au soja tryptique en trois exemplaires.</li>
	<li>Incuber la gélose pendant 18 h à 37 °C. Ensuite, comptez le nombre de colonies pour déterminer l’UFC pour chaque échantillon.</li>
</ol>

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<li>Mazzone, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+and+in+utero+transplantation+of+fetal+skin+in+the+sheep+model%3A+A+crucial+step+towards+clinical+application+in+human+fetal+spina+bifida+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering+and+Regenerative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Bioengineering and in utero transplantation of fetal skin in the sheep model: A crucial step towards clinical application in human fetal spina bifida repair.</a> Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 14 (1), 58-65 (2020).</li>
<li>Olkowska, E., Gržinić, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909(2022).</li>
<li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer

Le développement d’antimicrobiens est une entreprise importante mais coûteuse qui devrait coûter environ 1 milliard de dollars et prendre environ 15 ans. Plus de 90 % des découvertes de médicaments antimicrobiens et des études précliniques sur l’efficacité des médicaments antimicrobiens sont réalisées par des chercheurs universitaires et des petites et moyennes entreprises comptant généralement moins de 50 employés22. Ces équipes sont très contraintes financièrement, ce qui rend catastrophique l’é...

Les infections cutanées sont un problème mondial important, avec des coûts économiques importants pour les prestataires de soins de santé du monde entier. Le développement de la multirésistance aux médicaments et la formation de biofilms par des agents pathogènes jouent un rôle clé dans la prévalence des plaies non cicatrisantes 1,2,3,4. En conséquence, les infections de la peau et des tissus mous sont l’une des raisons les plus courantes d’hospitalisation prolongée et de réadmission ultérieure5. Les retards dans la cicatrisation des plaies sont coûteux pour le patient et les prestataires de soins de santé, certaines estimations suggérant qu’environ 6,5 millions de patients sont touchés chaque année aux États-Unis. Au Royaume-Uni, les infections cutanées et les complications associées entraînent environ 75 000 décès par an 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) est un pathogène redoutable des plaies fréquemment isolé des plaies des patients 2,7. Le taux d’émergence de la multirésistance a considérablement augmenté dans les années 2000. Pendant ce temps, environ 60% des infections bactériennes aiguës de la peau et de la structure de la peau étaient positives à la culture pour S. aureus1 résistant à la méthicilline. Le nombre croissant de souches multirésistantes parmi les staphylocoques, et même d’autres agents pathogènes, au cours des 2 dernières décennies indique un besoin urgent de développement rapide d’antibiotiques avec de nouveaux modes d’action capables de surmonter la résistance.
Cependant, depuis le début des années 2000, les programmes de découverte d’antibiotiques ont été dominés par des temps de développement plus longs et de faibles taux de réussite, avec seulement 17% des nouveaux antibiotiques entrant dans les essais cliniques aux États-Unis obtenant l’approbation de mise sur le marché8. Cela suggère une disparité entre les résultats des tests in vitro d’antibiotiques émergents et leurs résultats cliniques. On peut soutenir que cette disparité est en grande partie due aux différences de physiologie bactérienne au cours des infections in vivo et au cours des méthodes microbiologiques conventionnelles lors de l’essai de l’efficacité des antibiotiques aux stades précliniques in vitro . Par conséquent, de nouvelles méthodes de laboratoire plus représentatives de la physiologie bactérienne pendant l’infection sont nécessaires pour améliorer les taux de réussite des programmes de découverte d’antibiotiques.
Les méthodes actuelles d’étude des infections cutanées comprennent des études sur des animaux vivants (p. ex. souris), des modèles cutanés ex vivo (p. ex. porcins) et des modèles cutanés issus de l’ingénierie tissulaire 3D (p. ex. humains)9,10,11,12. Les études sur des animaux vivants sont strictement réglementées et ont un débit relativement faible. Dans les modèles animaux, les blessures et les infections causent une détresse importante aux animaux et soulèvent des préoccupations éthiques. Les modèles de peau humaine, ex vivo ou tissulaires, nécessitent une approbation éthique, le respect de la législation locale et mondiale (la loi sur les tissus humains, la déclaration d’Helsinki), et il est difficile d’acquérir des tissus, certaines demandes prenant des années à satisfaire13,14. Les deux types de modèles exigent beaucoup de main-d’œuvre et nécessitent une expertise importante pour assurer le succès expérimental. Certains modèles actuels d’infection cutanée ex vivo nécessitent des disques pré-inoculés et des additifs pour le lit de la plaie afin de permettre l’infection; Bien que ces modèles soient incroyablement utiles, il existe des limites dans le processus d’infection car les additifs limitent l’utilisation du lit de la plaie comme source de nutriments10,15,16,17. Le modèle décrit dans cette étude n’utilise aucun additif au lit de la plaie, ce qui garantit que la pathologie de l’infection et le nombre de cellules viables sont le résultat de l’utilisation directe du lit de la plaie comme seule source de nutriments.
Compte tenu de la nécessité de nouvelles méthodes de laboratoire, un nouveau modèle ovin ex vivo à haut débit d’infections cutanées a été mis au point pour évaluer l’efficacité des antibiotiques émergents. Les études sur les infections cutanées font face à de nombreux défis - coûts élevés, préoccupations éthiques et modèles qui ne donnent pas une image complète20,21. Les modèles ex vivo et les modèles 3D explant permettent une meilleure visualisation du processus de la maladie et de l’impact que les traitements peuvent avoir à partir d’un modèle plus pertinent sur le plan clinique. Ici, la configuration d’un nouveau modèle de peau ovine est décrite, qui est simple, reproductible et cliniquement pertinente et a un débit élevé. La peau d’ovins a été choisie car les moutons sont l’un des grands mammifères couramment utilisés pour modéliser les réponses aux infections in vivo. De plus, ils sont facilement disponibles dans les abattoirs, ce qui assure un approvisionnement régulier en peau pour la recherche, et leurs carcasses ne sont pas ébouillantées, ce qui garantit une bonne qualité des tissus. Cette étude a utilisé S. aureus comme agent pathogène exemplaire; Cependant, le modèle fonctionne bien avec d’autres micro-organismes.

<table><tbody><tr><td>Plaque d’accompagnement à 24 puits</td><td>SLS&nbsp ;</td><td></td><td></td>353504</tr><tr><td>Punch à biopsie de 4 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7484</td><td></td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger de 50 ml</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>Poinçon de biopsie de 8 mm</td><td>Williams Medical</td><td>D7488</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’amphotéricine B, stérile</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Colour Pro Style Tondeuse à cheveux sans fil</td><td>Wahl</td><td>9639-2117X</td><td>Tondeuse à cheveux</td></tr><tr><td>Incubateur à double four</td><td>SLS</td><td>OVe1020</td><td>Four de stérilisation</td></tr><tr><td>Facteur de croissance épidermique&nbsp ;</td><td>SLS</td><td>E5036-200UG</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol</td><td>Honeywell</td><td>458600-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>F12 HAM</td><td>Sigma</td><td>N4888</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin&nbsp ;</td><td>Labtech International</td><td>CA-115/500</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>15307805</td><td></td></tr><tr><td>Crème Dépilatoire</td><td>Veet</td><td>Sans objet</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>15373212&nbsp ;</td><td>Incubateur de culture tissulaire</td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>VWR</td><td>521-2242</td><td>Centrifugeuse</td></tr><tr><td>Homogénéisateur 220, portatif</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575809</td><td></td></tr><tr><td>Homogénéisateur 220, cônes de mélange en plastique</td><td>Fisher Scientific&nbsp ;</td><td></td><td></td>15585819</tr><tr><td>Insert Individual 24 puits 0,4um membrane</td><td>VWR International</td><td>353095</td><td></td></tr><tr><td>Insuline, recombinant Humain</td><td>SLS</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (MK media)</td><td>Sigma</td><td>M0393</td><td></td></tr><tr><td>Microplaque, culture cellulaire Costar 96 puits</td><td>Fisher Scientific</td><td>10687551</td><td></td></tr><tr><td>Multitron</td><td>Infors</td><td>Sans objet</td><td>Incubateur bactérien</td></tr><tr><td>Comprimés PBS</td><td>Sigma&nbsp ;</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>SLS&nbsp ;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Joints de plaque</td><td>Fisher Scientific</td><td>ESI-B-100</td><td></td></tr><tr><td>Safe 2020</td><td>Fisher Scientific</td><td>1284804</td><td>Classe II Armoire de sécurité pour microbiologie</td></tr><tr><td>Lame de scalpel numéro 15</td><td>Fisher Scientific</td><td>O305</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel Swann Morton</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849002</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonate de sodium</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pince à tissu Allis dentée</td><td>Rocialle</td><td>RSPU500-322</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar</td><td>Merck Life Science UK</td><td>Limited 14432-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Bouillon de soja tryptique</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>41298-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Vimoba Tablets</td><td>Quip Labs</td><td>VMTAB75BX</td><td></td></tr></tbody></table>

un nouveau modèle ex vivo de plaies cutanées ovines à haut débit pour tester les antibiotiques émergents

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Le développement d’antimicrobiens est un processus coûteux avec des taux de réussite de plus en plus faibles, ce qui rend les investissements supplémentaires dans la recherche sur la découverte d’antimicrobiens moins attrayants. La découverte de médicaments antimicrobiens et leur commercialisation subséquente peuvent être rendues plus lucratives si une approche rapide et peu coûteuse peut être mise en œuvre au cours des étapes d’optimisation des pistes où les chercheurs ont un plus grand contrôle sur la conception et la formulation des médicaments. Dans cet article, la configuration d’un modèle ex vivo de peau blessée ovine infectée par Staphylococcus aureus est décrite, ce qui est simple, rentable, à haut débit et reproductible. La physiologie bactérienne dans le modèle imite que pendant l’infection, la prolifération bactérienne dépend de la capacité de l’agent pathogène à endommager le tissu. L’établissement de l’infection de la plaie est vérifié par une augmentation du nombre de bactéries viables par rapport à l’inoculum. Ce modèle peut être utilisé comme plateforme pour tester l’efficacité des antimicrobiens émergents à l’étape de l’optimisation des prospects. On peut soutenir que la disponibilité de ce modèle fournira aux chercheurs qui développent des antimicrobiens un modèle d’échec rapide et bon marché, ce qui contribuera à augmenter les taux de réussite dans les essais ultérieurs sur les animaux. Le modèle facilitera également la réduction et le perfectionnement de l’utilisation des animaux pour la recherche et, en fin de compte, permettra une application plus rapide et plus rentable de nouveaux antimicrobiens pour les infections de la peau et des tissus mous à la clinique.

L’identification d’une voie de stérilisation de la peau avant la mise en place du modèle d’infection de la plaie a été difficile. Le défi consistait à stériliser la peau sans endommager les différentes couches de la peau, ce qui peut avoir des conséquences imprévues sur l’issue de l’infection. Pour identifier un régime de stérilisation approprié, différents traitements ont été essayés pour des durées variables, comme indiqué dans le tableau 1. La contamination a été enregistrée comme le développement de ...

Le protocole décrit une méthode étape par étape pour mettre en place un modèle ex vivo de peau blessée ovine infectée par Staphylococcus aureus. Ce modèle à haut débit simule mieux les infections in vivo par rapport aux techniques de microbiologie conventionnelles et offre aux chercheurs une plateforme physiologiquement pertinente pour tester l’efficacité des antimicrobiens émergents.

Un nouveau modèle ex vivo de plaies cutanées ovines à haut débit pour tester les antibiotiques émergents

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Ce modèle permettra aux chercheurs aux stades précliniques critiques de déterminer avec plus de précision l’efficacité antimicrobienne des nouvelles formulations et donnera aux chercheurs un plus grand contrôle sur la conception et la formulation des médicaments. Ce modèle permet des résultats rapidement reproductibles dans un environnement de plaie représentatif. Il réduit le besoin d’animaux élevés à des fins spéciales et facilite la traduction plus rapide des antimicrobiens topiques pour les infections des plaies à la clinique.Les principaux défis sont la contamination et la dextérité. Une technique aseptique stricte et la patience avec le traitement des tissus sont essentielles; un retrait précis et ciblé du lambeau est nécessaire pour le succès de cette méthode. Commencez par la désinfection des forceps en les exposant à une stérilisation à la chaleur sèche à 200 degrés Celsius pendant une heure.Autoclaver toute la verrerie à 121 degrés Celsius pendant 15 minutes avant utilisation. Désinfectez la section frontale de la lampe en versant environ 100 millilitres de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm sur la zone d’échantillonnage. Raser la section frontale à l’aide d’une tondeuse électrique, suivie d’un lavage avec 200 millilitres de solution de dioxyde de chlore à 200 ppm.Essuyez la zone avec de l’éthanol et un rouleau bleu, et couvrez la zone d’échantillon avec de la crème dépilatoire. Après 35 minutes, grattez doucement la crème dépilatoire à l’aide d’un outil de grattage et évaluez la zone d’échantillonnage. Répétez le processus d’épilation s’il reste une quantité importante de poils.Rincer la zone d’échantillon propre avec 200 millilitres de solution de dioxyde de chlore suivie d’éthanol et d’un rouleau bleu. Utilisez un poinçon de biopsie stérile de huit millimètres pour découper un échantillon de peau de huit millimètres de la zone préparée. Ensuite, retirez l’échantillon à l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel à lame numéro 15, en veillant à ce que toute la graisse cutanée soit éliminée.Placez les échantillons dans un pot stérile de 0,5 litre rempli de PBS stérile. Ensuite, transférez-les dans des tubes stériles de 50 millilitres remplis de 50 millilitres de solution de dioxyde de chlore de 200 ppm. Retourner le tube deux fois et le laisser stériliser pendant 30 minutes.Transférer les échantillons dans un tube de 50 millilitres rempli de 40 millilitres de PBS stérile. Après le lavage PBS, placez chaque échantillon de peau dans un puits séparé d’une assiette de 24 puits. Ajouter 350 microlitres du milieu préchauffé dans un puits, tout en maintenant l’échantillon à l’interface air-liquide.Scellez les plaques de 24 puits avec un joint de plaque perméable aux gaz avant de placer la plaque pour l’incubation dans un incubateur de tissus humidifiés à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 24 heures. Après l’incubation, retirer le milieu de culture et rincer les échantillons dans 500 microlitres de PBS stérile. Retirez les antibiotiques résiduels de l’échantillon en les traitant avec des milieux sans antibiotiques à 5% de dioxyde de carbone et 37 degrés Celsius pendant 24 heures.Si une turbidité ou une infection fongique se développe dans le milieu exempt d’antibiotiques, jeter l’échantillon. Ensuite, préparez un tube de 50 millilitres avec 10 millilitres de bouillon de soja tryptique stérile. Ensuite, transférez plusieurs colonies de Staphylococcus aureus d’une plaque de gélose fraîche de S. aureus au bouillon et incuber le tube à 37 degrés Celsius et 150 RPM pendant 18 heures.Après avoir centrifugé les tubes à 4 000 G pendant trois minutes, retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille cellulaire dans 10 millilitres de PBS stérile. Répétez le lavage PBS deux fois avant d’ajuster l’inoculum à une densité optique de 0,6 à des longueurs d’onde de 600 nanomètres à l’aide de PBS stérile. Confirmer la charge d’inoculum par une numération manuelle sur plaque viable.Pour infecter l’échantillon de peau, préparez une nouvelle plaque de 24 puits avec 400 microlitres de milieu préchauffé sans antibiotique et ajoutez les 24 inserts de puits à l’aide de pinces stériles. Retirez le média des échantillons de peau. Lavez-les avec 500 microlitres de PBS stérile et retirez le lavage.Utilisez des pinces stériles pour maintenir doucement l’échantillon au fond du puits. Utilisez une biopsie à l’emporte-pièce de quatre millimètres pour percer l’échantillon de peau à une profondeur approximative d’un à deux millimètres et faire un lambeau central de la plaie. Utilisez ensuite un scalpel à lame numéro 15 et une pince à tissus Allis à dents stériles pour enlever la couche supérieure du lambeau de la plaie.Une fois que tous les échantillons ont été blessés, transférez-les dans les 24 inserts de puits à l’aide de pinces stériles. Pipeter 15 microlitres de l’inoculum bactérien dans le lit de la plaie avant d’incuber pendant 24 heures à 37 degrés Celsius dans un incubateur de tissus humidifiés. Pour des périodes d’incubation plus longues, retirez le média, remplacez-le par un média frais toutes les 24 heures et incuber les plaques dans les mêmes conditions.Pour déterminer la charge bactérienne, retirez le média du fond des puits. Et à l’aide de pinces stériles, transférez chaque échantillon dans un tube séparé de 50 millilitres rempli d’un millilitre de PBS stérile. Ensuite, détachez les bactéries de la surface du lit de la plaie en homogénéisant la surface de l’échantillon avec un homogénéisateur à pointe fine.Assurez-vous que le lit de la plaie est en contact direct avec l’extrémité de l’homogénéisateur. Une fois tous les échantillons traités, vortex chaque échantillon avant de transférer 20 microlitres d’homogénat dans le puits correspondant d’une plaque de 96 puits contenant 180 microlitres de PBS stérile. Diluer en série chaque homogénat d’échantillon à 1 fois 10 au négatif 7, et pipeter 10 microlitres de l’homogénat dilué sur une plaque de gélose de soja tryptique en trois exemplaires.Incuber la plaque de gélose au soja tryptique à 37 degrés Celsius et, après 18 heures, compter le nombre de colonies pour déterminer les unités formant des colonies ou UFC pour chaque échantillon. Un régime approprié de stérilisation de la peau a été identifié en utilisant différents traitements pour des durées variables. L’intégrité des tissus a été surveillée par histologie, suivie d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine immédiatement après le traitement.Un traitement de 30 minutes au dioxyde de chlore était le traitement le plus efficace, avec stérilisation reproductible du tissu cutané tout en préservant l’intégrité des tissus. Une pellicule blanche dans le lit de la plaie était évidente sur le tissu 48 heures après l’infection. Bien que le modèle de rayure abritait un nombre moyen plus élevé d’UFC après 24 heures, la technique de blessure par enlèvement de lambeau a produit des résultats plus cohérents.Après 48 heures, environ 100 fois plus d’UFC bactériennes ont été récupérées dans le tissu blessé par rapport à l’inoculum, indiquant une infection réussie. Des coupes histologiques colorées de Gram du tissu infecté indiquaient la présence de cellules de S. aureus dans le lit de la plaie, qui était absente dans les sections de tissu non infecté. En suivant cette procédure, on peut effectuer une immunohistochimie pour étudier la réponse tissulaire, la coloration de Gram modifiée pour visualiser la localisation bactérienne et la numération sur plaque viable après une exposition aux antimicrobiens pour tester l’efficacité antimicrobienne.Pour les chercheurs qui mettent au point de nouveaux antimicrobiens, ce modèle permettra de mieux contrôler l’optimisation des prospects, de réduire la dépendance à l’égard d’essais coûteux et étroitement réglementés sur les animaux et de permettre la traduction rapide des antimicrobiens en clinique.

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Research

Recherche

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie et infection

Source : de Vries, C. R., et.al. Un modèle d’inoculation retardée de l’infection chronique de la plaie de Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Cette vidéo montre l’inoculation retardée de Pseudomonas aeruginosa luminescente dans une souris portant deux plaies dorsales d’épaisseur complète recouvertes d’un pansement de film transparent. Cela facilite la formation de biofilms et l’établissement d’infections chroniques. Un suivi régulier de la bioluminescence permet de quantifier la charge...

Développement d’un modèle murin d’infection cutanée chronique de Pseudomonas aeruginosa 

Cette vidéo décrit un protocole permettant de mettre en place un modèle ex vivo de kératite bactérienne à l’aide d’un bouton cornéoscléral disséqué dans l’œil porcin. Les bactéries inoculées traversent les incisions épithéliales cornéennes pour envahir le stroma sous-jacent et établir une infection dans les tissus cornéens qui imitent l’infection in vivo.

Modèle de cornée porcine ex vivo de kératite bactérienne : une technique pour établir une infection bactérienne dans les cellules épithéliales cornéennes

Cette vidéo montre une technique permettant de générer un modèle murin d’infection de plaie cutanée. Lors de l’infection de souris – conçues pour exprimer une protéine fluorescente dans les neutrophiles – avec un Staphylococcus aureus bioluminescent génétiquement modifié – une bactérie pathogène. La charge bactérienne au site d’infection et la dynamique de recrutement des neutrophiles peuvent être étudiées à l’aide de l’imagerie de l’animal entier.

Un modèle d’infection cutanée murine pour étudier la réponse immunitaire contre un pathogène bactérien

La vidéo montre la génération d’un modèle ex vivo de peau ovine infectée par Staphylococcus aureus. Cela implique de traiter une section de biopsie cutanée du front d'un agneau avec des antibiotiques, d'établir un lit de plaie, de le positionner sur une membrane perméable dans une plaque multipuits avec un milieu sans antibiotique et d'établir une infection bactérienne dans la plaie cutanée.

Génération d’un modèle ex vivo de peau blessée ovine infectée par un pathogène bactérien

Nous décrivons ici un nouveau modèle murin diabétique utilisant des souris sans poils pour en temps réel, non invasif, surveillance des infections de plaies du biofilm de bioluminescent Pseudomonas aeruginosa. Cette méthode peut être adaptée pour évaluer l’infection d’autres espèces de bactéries et micro-organismes génétiquement modifiés, y compris les biofilms multi-espèces et tester l’efficacité des stratégies antibiofilm.

Venez sur le côté de la lumière: In Vivo surveillance des Infections à Pseudomonas aeruginosa Biofilm dans les plaies chroniques dans un modèle murin glabres diabétique

Un protocole pour un ancien modèle de culture de cornée orgue vivo utile pour la cicatrisation des études est exposée. Ce système de modèle peut servir à évaluer les effets des agents pour favoriser la guérison régénératrice ou toxicité des médicaments dans un environnement 3D organisé de multicellulaire.

Ex Vivo, modèle de Culture d’organes cornéenne pour la cicatrisation des études

Ici, deux modèles murins de guérison de blessure sont décrits, l’un conçu pour évaluer les réponses cellulaires et de guérison de blessure de cytokine et l’autre pour quantifier le taux de fermeture de blessure. Ces méthodes peuvent être utilisées avec des modèles complexes de maladies telles que le diabète pour déterminer les mécanismes de divers aspects de la mauvaise cicatrisation des plaies.

Évaluation de la guérison aigue des plaies à l’aide de l’implantation d’éponge d’alcool polyvinyl subcutanée et des modèles excisionaux de blessure de peau de queue.

Cet article décrit un protocole étape par étape pour mettre en place un modèle ex vivo porcin de kératite bactérienne. Pseudomonas aeruginosa est utilisé comme un organisme prototypique. Ce modèle novateur imite l’infection in vivo car la prolifération bactérienne dépend de la capacité de la bactérie à endommager le tissu cornéen.

Établissement d’un modèle de cornée Porcine Ex Vivo pour l’étude des traitements médicamenteux contre la kératite bactérienne

Nous démontrons ici une technique optimisée pour évaluer la réparation des plaies à l’aide de peau humaine ex vivo combinée à une approche de coloration à montage complet. Cette méthodologie fournit une plate-forme préclinique pour l’évaluation des thérapies potentielles des plaies.

Modèle de plaie ex vivo humaine et approche de coloration à montage entier pour évaluer avec précision la réparation de la peau

Les plaies chroniques résistantes aux antibiotiques constituent une menace majeure pour le système de santé. Les infections par biofilm sont tenaces et hostiles et peuvent entraîner une fermeture fonctionnelle déficiente de la plaie. Nous rapportons un modèle porcin cliniquement pertinent de plaies chroniques de pleine épaisseur infectées par un biofilm. Ce modèle est puissant pour les études mécanistiques ainsi que pour tester des interventions.

Modèle porcin d’infection par biofilm et de plaies invisibles

Un dispositif LED à lumière bleue de 405 nm démontre une efficacité antimicrobienne contre un large éventail d’agents pathogènes des plaies lorsqu’il est évalué sur un modèle cutané synthétique à base de collagène. Cette approche in vitro simplifiée offre une alternative reproductible et éthiquement viable pour l’évaluation en phase précoce des thérapies antimicrobiennes à base de lumière.

Étude d’un dispositif LED à lumière bleue pour supprimer les agents pathogènes des plaies à l’aide d’un modèle cutané synthétique à base de collagène

Découvrez un modèle ex vivo de peau ovine blessée infectée par Staphylococcus aureus pour tester l'efficacité antimicrobienne. Cette méthode réduit l'utilisation animale et accélère la traduction clinique des antibiotiques topiques.

Un nouveau modèle ex vivo de plaies cutanées ovines à haut débit pour tester les antibiotiques émergents

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