Visualisation aux rayons X d’un traitement ablatif intracanalaire à base d’éthanol pour la prévention du cancer du sein chez le rat

Le cancer du sein est une maladie répandue et mortelle avec des stratégies de prévention limitées qui viennent avec des effets secondaires négatifs graves. Pour fournir une méthode avec des effets secondaires réduits, nous avons développé une technique d’injection intracanalaire d’une solution ablative à base d’éthanol dans l’arbre canalaire mammaire du rat qui permet l’imagerie in vivo simultanée et la prévention du cancer du sein. Cela s’appuie sur des travaux antérieurs chez la souris chez lesquels l’injection directement dans l’ouverture du mamelon permet de cibler les cellules épithéliales mammaires avec un minimum de lésions tissulaires collatérales.

Les souris et les rats ont des glandes mammaires contenant un seul arbre canalaire provenant de l’ouverture du mamelon. Les rats sont plus gros que les souris et permettent l’injection d’un plus grand volume d’éthanol pour l’étude du succès de l’ablation afin de prouver l’évolutivité du modèle. Un autre raffinement de cette méthode est l’ajout d’éthylcellulose à la solution ablative.

L’éthylcellulose a déjà été utilisée dans d’autres approches cliniques pour réduire la propagation de l’éthanol loin de la zone ciblée. Ceci est accompli par la nature du composé, qui le fait geler lorsqu’il entre en contact avec le liquide dans le tissu. Il y a cinq étapes clés impliquées dans cette méthode de prévention du cancer du sein vérifiée par image.

Nous devons d’abord commencer à doser les animaux avec du carprofène par voie orale en utilisant des tasses de gel de sucralose préparées en laboratoire. Ce traitement anti-inflammatoire prolongé est maintenu avant et après la procédure. Ensuite, nous retirons la fourrure de la zone entourant les mamelons pour y injecter de la crème dépilatoire afin de préparer l’animal aux injections.

Les injections intracanalaires sont ensuite effectuées avec un stéréoscope facilitant la visualisation de l’ouverture du mamelon pour l’insertion de l’aiguille. Les animaux sont scannés ou évalués par microtomodensitométrie ou fluoroscopie après l’injection afin de déterminer le succès des injections. Des microtomodensitogrammes peuvent ensuite être traités pour créer des reconstructions 3D de l’arbre canalaire mammaire injecté pour une analyse plus approfondie du remplissage réussi.

Le carprofène stock est d’abord dilué dans du PVS à la concentration requise. Un colorant alimentaire stérile peut être ajouté au mélange pour mieux confirmer le mélange complet du médicament dans le sucralose de la tasse. Les tasses sont ensuite chauffées au bain-marie à 60 degrés Celsius pendant 15 minutes.

Le séchage des gobelets lors du retrait et le nettoyage du couvercle de la tasse avec de l’éthanol à 70% réduisent le risque de contamination. La solution de carprofène peut être injectée directement dans la tasse à l’aide d’une seringue pour percer le couvercle. Dans ce cas, nous devons injecter 500 microlitres pour obtenir le résultat souhaité.

Scellez le trou avec un autocollant avant de secouer la tasse pendant 15 secondes, puis de vorter pendant 15 secondes supplémentaires. Le mélange homogène peut être évalué en recherchant des touffes de bleu foncé. Les gobelets peuvent ensuite être réfrigérés jusqu’à ce que vous en ayez besoin.

Les animaux doivent être préparés deux à trois jours avant les injections. Anesthésier l’animal à l’aide d’un inhalant isoflurane. Transférer le rat anesthésié dans un cône nasal sur un coussin chauffant.

Appliquez du lubrifiant pour les yeux sur le rat au cône nasal, puis positionnez l’animal sur le dos. La crème dépilatoire peut être appliquée sur la zone des mamelons que vous prévoyez d’injecter avec un applicateur à embout de coton. Un relâchement plus rapide de la fourrure peut être obtenu en frottant l’applicateur de haut en bas sur la peau de l’animal dans la zone souhaitée.

Il est important de laisser la crème sur le rat le moins de temps possible pour éviter de brûler la peau. Les rats sont encore plus sensibles que les souris à cette procédure. Après 10 à 30 secondes d’application, utilisez de l’eau tiède sur de la gaze pour enlever complètement la crème.

Utilisez trois à quatre rinçages pour assurer un retrait complet avant de sécher la peau avec une gaze propre. Confirmez une bonne visibilité et un bon accès aux mamelons dans les zones d’enlèvement de la fourrure. Répétez la procédure dépilatoire si nécessaire.

Placez le rat dans une cage de récupération propre sur un coussin chauffant pour récupérer de l’anesthésie. Donnez une tasse de carprofène aux rats préparés dans leur cage à la maison après la récupération. Vous commencerez par anesthésier l’animal à l’aide d’une anesthésie à l’isoflurane inhalée et déplacerez le rat vers un cône nasal une fois qu’il aura été complètement induit.

Un lubrifiant pour les yeux doit être appliqué avant de placer l’animal sur le dos pour préparations injectables. Il peut être utile de scotcher les jambes près des mamelons qui seront injectés, mais ce n’est pas nécessaire. Une fois que vous avez préparé la seringue avec le volume souhaité de solution injectable, préparez le mamelon en enlevant toute peau morte visible à l’aide d’une pince à pointe fine si possible.

Le sujet de préoccupation le plus courant est l’ouverture du mamelon elle-même. Les rats ont souvent un bouchon qui dépasse de l’ouverture. Le retrait de ce bouchon peut aider à une meilleure canulation.

Avec le biseau de l’aiguille visible, insérez l’aiguille dans l’extrémité du mamelon à l’aide de pinces à pointe fine. Prenez soin de suivre le chemin de l’ouverture du mamelon. Les mamelons de rat ont tendance à avoir plus de graisse entourant l’ouverture, ce qui facilite le percement de cette graisse et croient à tort que vous avez obtenu une canulation en raison de l’avancement de l’aiguille.

Une fois que le biseau de l’aiguille est complètement entouré par le mamelon, commencez à injecter lentement la solution. Le taux souhaité est d’environ 100 microlitres par minute chez le rat. Évitez d’injecter plus rapidement que cela pour éviter d’endommager l’arbre canalaire.

Après l’injection complète, attendez 30 secondes avant de retirer l’aiguille du mamelon avec l’aide de la pince. Cela réduira la probabilité de fuite du mamelon. En cas de fuite, utilisez de la gaze humidifiée ou une lingette à l’éthanol pour nettoyer la solution.

Le contraste et la solution renversée peuvent déformer les images acquises. Ici, nous voyons une vidéo agrandie de la séquence d’injection qui vient d’être affichée. Notez que la respiration de l’animal rend difficile le maintien du mamelon dans un seul plan focal.

Cela peut rendre l’injection plus difficile car le mamelon ne reste pas dans un endroit constant. Ce problème est exacerbé par la proximité de la cage thoracique et des trois paires de glandes supérieures. Le bouchon dans l’ouverture du mamelon a maintenant été retiré pour une meilleure canulation.

L’aiguille peut maintenant être orientée biseauté vers le haut pour être avancée dans le mamelon avec l’aide de la pince. Une fois le biseau complètement inséré, l’injection peut commencer. Si vous regardez attentivement sur le côté gauche du mamelon, vous remarquerez peut-être une augmentation de la teinte bleue où la solution d’injection est légèrement visible se propageant à travers l’arbre canalaire.

Ceci est beaucoup moins visible chez le rat en raison de la peau plus épaisse. Ici, nous pouvons voir le retrait de l’aiguille 30 secondes après la fin de l’injection et la solution résultante se répandre hors du mamelon. La solution supplémentaire est nettoyée, ce qui permet d’évaluer la zone où nous ne voyons aucun traumatisme au mamelon ou de doming de la zone, ce qui indiquerait une injection de coussinet adipeux.

Si vous injectez une solution contenant de l’éthanol, des précautions doivent être prises pour éviter toute intoxication alcoolique. Cela nécessite de savoir combien d’éthanol peut être injecté en une seule séance et d’administrer une solution contenant du saccharose IP pendant la procédure pour contrer les effets. Après l’injection, les animaux peuvent être récupérés dans une cage propre sur un coussin chauffant ou déplacés vers le microCT pour l’imagerie du succès de l’injection.

Après avoir déplacé l’animal injecté vers l’instrument microCT, continuez à administrer de l’isoflurane pour maintenir l’anesthésie pendant l’imagerie. La taille accrue du rat nécessite une manipulation de position supplémentaire pour obtenir une bonne image. Le redressement de la colonne vertébrale avant de coller les jambes près du site à imager est utile pour générer des images cohérentes.

Taper les jambes dans une position étendue peut empêcher les os de devenir le point focal de l’image. Nous avons également constaté que le bandage sur l’abdomen du rat peut aider à réduire l’artefact respiratoire pour les glandes inférieures. Plusieurs paramètres de balayage sont acceptables pour la visualisation du traitement canalaire.

Cependant, la dose de rayonnement doit toujours être prise en compte lors de la sélection des paramètres. La dose de rayonnement résultant de ces scintigraphies ne devrait pas dépasser les limites de rayonnement pour une souche donnée de rats. L’analyse fluoroscopique, plutôt que l’acquisition d’images, peut réduire considérablement la charge globale de rayonnement.

Une fois que tous les scanners ou évaluations ont été effectués, l’animal peut être retourné dans une cage de récupération propre sur une plate-forme chauffante. L’animal doit être surveillé jusqu’à ce qu’il soit complètement rétabli et retourné dans la cage familiale. Les gobelets de carprofène doivent être fournis jusqu’à au moins sept jours après l’injection.

Le logiciel de l’instrument microCT que nous utilisons permet de créer des rendus rapides pour évaluer le succès de l’injection sans analyse formelle. Cette fonctionnalité dispose d’un curseur de contraste simple qui permet une réduction raisonnable du signal au bruit. Le principal défaut de ces rendus est que l’image entière doit être seuillée simultanément.

Cela permet aux signaux lumineux qui ne font clairement pas partie de l’arbre canalaire, tels que le fer dans l’alimentation, de rester dans l’image. Dans certains cas, le vrai signal tel qu’il est vu ici est aussi faible que l’arrière-plan et peut facilement être seuillé hors de l’image. De meilleurs rendus formels peuvent être réalisés à l’aide d’un logiciel d’analyse plus sophistiqué qui permet de segmenter la zone d’intérêt.

Il est préférable de segmenter le coussinet graisseux mammaire pour un traitement d’image ultérieur afin d’obtenir le meilleur rendu de l’arbre canalaire injecté. La limite sombre du coussinet graisseux mammaire peut être tracée sur toute l’épaisseur de l’animal afin d’obtenir cette segmentation. Tracer une tranche sur trois et propager l’objet est suffisant pour capturer l’intégralité du conduit dans notre expérience.

À ce stade, il est possible de seuiller le rendu en utilisant une rage donnée pour afficher uniquement le contraste contenu dans le coussinet adipeux mammaire. Cela devrait inclure la solution à l’intérieur de l’arbre canalaire ainsi que toute fuite dans le voisinage immédiat. Les solutions d’oxyde de tantale sont généralement bien exposées dans une plage de 300 à 3000 HU. Une analyse plus approfondie peut être formée une fois que vous avez créé une reconstruction de l’arbre canalaire.

Si l’imagerie longitudinale n’est pas souhaitée, des images à plus haute résolution qui capturent mieux l’architecture complexe de l’arbre canalaire peuvent être acquises. Les différences entre les animaux peuvent rendre l’injection plus ou moins difficile. Nous ne pouvons pas parler de variabilité de souche à souche car nous travaillons actuellement exclusivement avec des rats Sprague Dawley.

Certains animaux auront des mamelons avec des profils bas, comme celui illustré ici, ce qui rend difficile la manipulation et la réalisation d’une canulation réussie. D’autres auront des mamelons avec un profil plus élevé, comme celui montré ici, qui seront plus susceptibles de canulation. Un mamelon canulé avec succès est représenté ici.

La difficulté à canuler peut entraîner un traumatisme du mamelon, comme indiqué ici. L’acquisition d’images microCT immédiatement après l’injection peut mieux informer les chercheurs du succès d’une injection et aider à identifier les propriétés de remplissage de certaines solutions. Ici, nous voyons différents aspects des glandes abdominales du même rat injecté avec le même volume d’une solution ablative contenant 70% d’éthanol avec contraste fourni par 100 millimolaires d’oxyde de tantale.

La solution utilisée dans la glande supérieure montrée contenait également 1% d’éthylcellulose. Nous voyons des structures en forme de mur aux extrémités des branches canalaires. Ce sont des bourgeons terminaux remplis de solution et ne débordant pas.

Dans la rangée du bas, nous voyons des extrémités canalaires moins définies indiquant la fuite de la solution de l’arbre canalaire. Ceci, ainsi que des dommages collatéraux plus limités dans l’examen histologique. semble indiquer une meilleure rétention des solutions contenant de l’éthylcellulose dans l’arbre canalaire.

Cette méthode fournit une étape vers l’évolutivité d’une méthode moins invasive de prévention du cancer du sein pour offrir une alternative à la mastectomie prophylactique. Une ablation épithéliale réussie dans un modèle de rongeur plus grand a été démontrée avec des effets secondaires minimes pour l’animal. L’ajout d’éthylcellulose à la solution ablative permet une meilleure rétention de la solution dans la zone d’injection, ce qui réduit les dommages collatéraux.

L’utilisation novatrice de solutions qui ont été cliniquement prouvées et la capacité accrue de visualiser le succès de la livraison avec des modalités d’imagerie courantes permettent une traduction facile dans la clinique.