Name: Isolement des cellules de la lignée monocyte-macrophage à partir d’os de rat par la méthode d’adhérence secondaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: Découvrez l'isolation des cellules BMM par adhérence secondaire à partir de moelle osseuse de rat. Cette méthode simple permet d'obtenir des précurseurs d'ostéoclastes pour étudier la biologie osseuse et l'ostéoporose in vitro.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (subvention no. LY19H060001) et le projet de plan scientifique et technologique de la médecine traditionnelle chinoise du Zhejiang (n° 2022ZB093).

Toutes les expériences de cette étude ont été menées conformément aux directives d’expérimentation animale du Centre de recherche sur les animaux de laboratoire de l’Université médicale chinoise du Zhejiang (numéro d’approbation: IACUC-20181029-11).
1. Extraction cellulaire
<ol><li>Placez les rats Sprague-Dawley (rats SD, âgés de 1 à 10 jours, mâles ou femelles) dans les cages d’euthanasie remplies de CO2 à un taux équilibré de 30% à 70% de volume de récipient / minute. Après que les rats ont perdu conscience (20-60 min), euthanasier le rat par luxation cervicale pour assurer une mort indolore.</li>
	<li>Immerger les rats dans de l’alcool à 75% pendant 10 min pour désinfection.</li>
	<li>Retirez soigneusement tous les membres du rat avec des ciseaux et des pinces, aspirez avec du PBS à l’aide d’une pipette et rincez le sang adhérant aux membres.</li>
	<li>Ajouter 5 mL de solution de pénicilline/streptomycine dans 500 mL de DMEM et bien mélanger. Prendre un tube de centrifugeuse stérile de 50 mL, ajouter 5 mL de FBS et 45 mL de milieu DMEM et bien mélanger pour obtenir une solution de DMEM FBS à 10 % contenant 1 % de pénicilline/streptomycine. Ajouter 2 mL du milieu de culture ci-dessus dans un tube de 5 mL.</li>
	<li>Transférer les os des membres dans le tube de 5 mL. Utilisez des ciseaux pour couper les os des membres dans le tube en petits morceaux (1-3 mm) et mélangez l’homogénat pour suspendre à nouveau les cellules de la moelle osseuse dans le milieu de culture. Rester debout pendant 5 min jusqu’à ce que les fragments de tissu se déposent au fond du tube.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de 10 % de FBS DMEM dans une antenne de culture de 100 mm, puis transférer le surnageant dans la parabole de culture. Lorsque vous aspirez le surnageant, évitez de transférer les débris tissulaires dans la boîte de culture.</li>
	<li>Incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant environ 24 h. Après cette période d’incubation, la majorité des cellules souches mésenchymateuses adhéreront à la paroi de la boîte de culture et se développeront lentement, tandis que la plupart des MMO seront toujours suspendues dans le milieu de culture.</li>
	<li>Transférer la suspension cellulaire dans la boîte de culture de 100 mm dans une nouvelle fiolede 25 cm 2 et continuer à cultiver les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h supplémentaires. Les MGB adhéreront à la paroi de la fiole à 24-48 h de culture. Retirez soigneusement l’ancien milieu et remplacez-le par un milieu frais une fois que les MGM ont adhéré à la paroi de la fiole.</li>
	<li>Sous-culture lorsque les cellules de la fiole ont atteint une confluence de 80% à 90%. NOTE: Toutes les cellules ont été cultivées à 37 ° C et à 5% de CO2. Au cours de la culture, la morphologie cellulaire a été progressivement unifiée. Les cellules étaient grandes, de forme irrégulière, en croissance radiale et attachées à la fiole sous forme de disque, où plusieurs noyaux pouvaient être observés.</li>
</ol>2. Coloration FACS de la cellule
<ol><li>La trypsine est digérée à l’aide de 1 à 2 mL de trypsine commerciale à 37 °C et de 5 % de CO2 pendant 5 min et compte les cellules adhérentes secondaires pour assurer un nombre final de cellules de 100 000/échantillon (cellules de comptage avec l’hémocytomètre Neubauer).</li>
	<li>Divisez les cellules en trois groupes (500 μL de PBS contient 100 000 cellules) : (1) le groupe témoin vide contenant des cellules non colorées ; 2° le groupe témoin de l’isotype; et (3) le groupe expérimental (coloration CD11b/c).</li>
	<li>Incuber des anticorps primaires (pas d’anticorps pour le groupe témoin vierge; contrôle de l’isotype anti-CD11 pour le groupe témoin de l’isotype, 0,6 μL d’anticorps/échantillon, 1 μg/échantillon; anti-CD11b/c pour le groupe expérimental, 1 μL d’anticorps/échantillon, 1 μg/échantillon) sur de la glace pendant 30 min.</li>
	<li>Centrifuger à 300-350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 500 μL de PBS. Répétez la procédure ci-dessus une fois pour vous assurer que les anticorps primaires non liés sont lavés.</li>
	<li>Incuber l’anticorps secondaire correspondant (pas d’anticorps pour le groupe témoin vierge; IgG anti-lapin de chèvre pour le contrôle de l’isotype et les groupes expérimentaux, anticorps/échantillon de 0,25 μL, 1:2 000) sur de la glace dans l’obscurité pendant 30 min.</li>
	<li>Centrifuger à 300-350 x g pendant 5 min, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension avec 500 μL de PBS. Répétez la procédure ci-dessus une fois pour vous assurer que les deuxièmes anticorps non liés sont lavés.</li>
	<li>Détecter les cellules CD11b/c positives par cytométrie en flux (10 000 cellules/échantillon) et analyser les données par logiciel (par exemple, FlowJo 7.5). NOTE: Pour obtenir le pourcentage final de cellules CD11b / c +, la formule suivante a été utilisée: Pourcentage de cellules CD11b / c + dans le groupe expérimental - le pourcentage de cellules CD11 + dans le groupe témoin isotype.</li>
</ol>3. Coloration de Wright-Giemsa
<ol><li>Ensemencer les cellules secondaires adhérentes qui ont été passées trois fois sur des feuilles grimpantes de 35 mm à2 cellules (1 × 106 cellules/puits) et les mettre en culture à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Jeter le milieu de culture et laver trois fois avec du PBS.</li>
	<li>Ajouter la solution de colorant Wright-Giemsa (0,5 mL-0,8 mL) à la feuille d’escalade cellulaire pendant 1 min.</li>
	<li>Mélanger le colorant avec de l’eau distillée (0,5 mL-0,8 mL) avec un coton-tige et laisser reposer pendant 10 min.</li>
	<li>Lavez la solution de colorant avec de l’eau distillée, puis séchez pendant 1 à 3 minutes. Observez au microscope.</li>
</ol>4. Coloration TRAP
<ol><li>Ensemencer les cellules secondaires adhérentes qui ont été passées trois fois sur des feuilles grimpantes de 35 mm à2 cellules (1 × 106 cellules/puits) et les mettre en culture à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.</li>
	<li>Remplacer l’ancien milieu par le DMEM FBS à 10 % ou le milieu d’induction des ostéoclastes complété par un activateur du récepteur 50 ng/mL du ligand du facteur nucléaire κB (RANKL) et 30 ng/mL du facteur de stimulation des colonies de macrophages (M-CSF), et la culture à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 7 jours supplémentaires.</li>
	<li>Tassez les cellules avec le kit de coloration TRAP selon le protocole du fabricant et observez au microscope. REMARQUE: Les cellules TRAP-positives ont été définies comme des ostéoclastes, qui étaient violets au microscope optique. Le nombre de cellules TRAP-positives a été mesuré à l’aide du logiciel ImageJ.</li>
</ol>5. Transfert western
<ol><li>Ensemencer les cellules secondaires adhérentes qui ont été passées trois fois sur des feuilles grimpantes de 35 mmà 2 cellules (1 × 10à 6 cellules/puits) et les cultiver pendant 24 h.</li>
	<li>Remplacer l’ancien milieu par du DMEM FBS frais à 10 % ou un milieu d’induction ostéoclaste (50 ng/mL de RANKL et 30 ng/mL de M-CSF) et cultiver pendant 7 jours supplémentaires à 37 °C et 5 % de CO2.</li>
	<li>Extraire les protéines cellulaires totales avec un tampon RIPA, séparé par 10% SDS-PAGE, et transférer dans les membranes de fluorure de polyvinylidène18,19.</li>
	<li>Bloquer avec 5% de poudre de skimmilk (25 mL) pendant 2 h et laver trois fois, pendant 10 min à chaque fois, avec TBS-Tween 20 (TBST).</li>
	<li>Incuber les anticorps primaires à 4 °C pendant la nuit (anti-β-actine, anti-TRAP et anti-cathepsine K; tous les anticorps primaires ont été dilués 1:1 000, 10 mL d’anticorps dilués /bande), et laver trois fois avec TBST.</li>
	<li>Incuber l’anticorps secondaire (IgG anti-lapin de chèvre, dilution 1:2 000, anticorps/bande dilué de 10 mL) à température ambiante pendant 2 h et laver trois fois avec tbST. Visualisez les bandes protéiques à l’aide d’une solution en développement. REMARQUE: Les niveaux d’expression des protéines ci-dessus ont été normalisés à β-actine.</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+osteoclast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
<li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase%2Fprotein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li>
<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
<li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
<li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li>
<li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
<li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li>
<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Les ostéoclastes sont l’un des types de cellules les plus importants impliqués dans l’apparition et le développement de maladies osseuses, ainsi que l’un des principaux objets de la recherche sur les maladiesosseuses 20. Les monocytes/macrophages peuvent se différencier en ostéoclastes. Étant donné que les macrophages mononucléaires (cellules RAW264.7) sont trop chers à l’achat et sont facilement activés pendant la culture, il est difficile d’effectuer des expériences de différenciation in vit...

Il a été rapporté que les cellules de la lignée monocyte-macrophage existant dans la moelle osseuse peuvent se différencier en monocytes sanguins et macrophages tissulaires 1,2. Les cellules ci-dessus, qui peuvent se différencier en ostéoclastes pour équilibrer la croissance et le développement osseux, sont couramment utilisées comme modèle cellulaire pour induire des ostéoclastes in vivo 3,4. La moelle osseuse est un tissu spécial contenant plusieurs types de cellules, qui comprennent, mais ne sont pas limités aux cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse, aux cellules monocytaires-macrophages de la moelle osseuse (BMM), aux cellules souches hématopoïétiques, aux cellules endothéliales et aux cellules immunitaires. En fait, plusieurs études antérieures ont suggéré que les cellules adhérentes se précipitaient hors de la cavité de la moelle osseuse de l’os long pourraient se différencier en ostéoblastes, ostéoclastes, chondrocytes ou adipocytes 5,6,7,8. Bien que différentes méthodes d’isolement et de culture aient été utilisées pour produire différentes populations cellulaires homogènes, il existe encore de grands défis dans l’isolement et la culture de MGM à partir d’une variété de types cellulaires différents.
Plusieurs méthodes ont été mises au point pour extraire les macrophages mononucléaires de la moelle osseuse (BMSC). Cependant, la majorité de ces méthodes sont complexes 9,10,11. Par exemple, la centrifugation par gradient de densité nécessite un kit spécialisé et l’opération prend du temps et est lourde. Cette méthode convient à l’isolement des BMM à partir d’échantillons de sang à volume élevé, mais pas d’échantillons de moelle osseuse 9,12,13. En outre, l’extraction d’échantillons de tissus à l’aide de la digestion à la collagénase est une procédure complexe et longue; cette méthode n’est pas recommandée pour l’isolement des BMM à partir d’échantillons de moelle osseuse14,15. En outre, bien que la séparation des flux puisse entraîner des populations de monocytes/macrophages hautement purifiées, elle nécessite des échantillons de très grande taille et des exigences élevées en instruments et en équipement10,16. De plus, la méthode d’enrichissement des microbilles est extrêmement coûteuse et n’est pas réalisable dans un laboratoire général17.
Par conséquent, dans la présente étude, une méthode pratique, rapide et bon marché a été proposée pour isoler les macrophages mononucléaires de la moelle osseuse. Les cellules de la moelle osseuse adhérées à différents moments ont été utilisées pour isoler les MMO à l’aide d’une méthode d’adhérence secondaire. Les BMM extraits avec la méthode ci-dessus pourraient induire la formation d’ostéoclastes in vitro, fournissant ainsi un modèle cellulaire simple et pratique pour l’étude future de l’ostéoporose in vitro.

<table><tbody><tr><td>35 mm2 tranches grimpantes</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-cathepsine K</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1:1 000</td></tr><tr><td>Contrôle des isotypes anti-CD11</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 &mu ; g/test, 1.675 mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-CD11b/c</td><td>Absin</td><td>abs124232</td><td>&nbsp ; 1&mu ; g/test, 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-TRAP</td><td>Abcam</td><td>ab191406</td><td>1:1,000</td></tr><tr><td>Anti-&beta ;-actine</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp ; AF5003</td> Tranches grimpantes de cellules 1<td>:1 000</td></tr><tr><td></td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire</td><td>corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Flacon de culture cellulaire</td><td>corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>milieu d’aigle modifié de Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin</td><td>IgG Abcam</td><td>ab150077</td><td>pour IF, 1:2 000</td></tr><tr><td>chèvre anti-lapin</td><td>IgG Abcam</td><td>ab6721</td><td>pour WB, 1:2 000</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Pepro tech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Pepro tech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SD rat</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd</td><td></td><td>1-10 jours</td></tr><tr><td>Kit de préparation de gel SDS-PAGE</td><td>Solarbio</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>Kit de coloration TRAP/ALP</td><td>Wako</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>Solution trypsine-EDTA</td><td>Biosharp</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>Solution Wright-Giemsa</td><td>Keygen Biotech</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolement des cellules de la lignée monocyte-macrophage à partir d’os de rat par la méthode d’adhérence secondaire

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

Avec une diminution de la densité minérale osseuse, les os sont plus susceptibles de se fracturer, affectant ainsi négativement la qualité de vie d’un patient. La croissance et le développement des os sont principalement régulés par les ostéoblastes et les ostéoclastes. Il a été largement admis que les ostéoclastes sont dérivés de cellules monoculo-macrophages (BMM) de la moelle osseuse. Les BMM et autres cellules souches hématopoïétiques sont situées dans la cavité de la moelle osseuse. Par conséquent, isoler des BMM stables uniques à partir de populations cellulaires différentes et hétérogènes est un énorme défi. Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des BMM chez les rats SD, appelé méthode d’observance secondaire. Des cellules adhérentes cultivées pendant 24 à 48 h en culture primaire ont été collectées. L’analyse cytométrique en flux a montré qu’environ 37,94 % des cellules étaient CD11b/c+ (antigène de surface monocyte-macrophage). La coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP) et l’analyse par transfert western ont démontré que les MGM pouvaient se différencier en ostéoclastes in vitro. Les résultats ci-dessus suggèrent que les cellules d’adhérence secondaires pourraient être considérées comme un modèle cellulaire approprié pour la recherche sur la différenciation des ostéoclastes.

La population de cellules adhérentes secondaires était stable et uniforme. Avec la prolifération cellulaire continue, la majorité des cellules sont devenues plus grandes, de forme irrégulière et se sont développées en un disque adhérent radial (Figure 2C, D). La cytométrie en flux a montré que le pourcentage de cellules exprimant CD11b/c, un marqueur moléculaire à la surface des cellules de la lignée monocyte-macrophage, était d’environ 37,94...

Nous présentons ici un protocole pour l’isolement des BMM chez les rats SD, appelé méthode d’observance secondaire.

Isolement des cellules de la lignée monocyte-macrophage à partir d’os de rat par la méthode d’adhérence secondaire

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

Dans ce protocole, les cellules monocytes-macrophages de la moelle osseuse sont extraites par une méthode d’adhérence secondaire. Les cellules monoculo-macrophages de la moelle osseuse peuvent se différencier avec succès en ostéoclastes, ce qui fournit un modèle cellulaire stable pour l’étude des ostéoclastes in vitro. Cette méthode convient aux petits échantillons de moelle osseuse et peut extraire les cellules de monocytes-macrophages de la moelle osseuse simplement et rapidement sans nécessiter d’équipement de laboratoire de haute technologie.L’augmentation des ostéoclastes peut être la pathogenèse potentielle de l’ostéoporose. Les cellules monoculo-macrophages de la moelle osseuse ont une certaine valeur de recherche en tant que cellules précurseurs d’ostéoclastes. Pour commencer, immergez les rats euthanasiés dans de l’alcool à 75% pendant 10 minutes pour les désinfecter.Après avoir soigneusement retiré tous les membres du rat avec des ciseaux et des pinces, aspirez avec du PBS à l’aide d’une pipette et rincez le sang adhérant aux membres. Puis à deux millilitres du DMEM FBS à 10% dans un tube de cinq millilitres. Après avoir transféré les os des membres dans le tube de cinq millilitres, utilisez des ciseaux pour couper les os des membres dans le tube en petits morceaux et mélangez l’homogénat pour remettre en suspension les cellules de la moelle osseuse dans le milieu de culture.Rester debout pendant cinq minutes jusqu’à ce que les fragments de tissu se déposent au fond du tube. Ensuite, ajoutez 10 millilitres de 10% FBS DMEM dans une antenne de culture de 100 millimètres, puis transférez le surnageant dans la boîte de culture. Incuber à 37 degrés Celsius dans du dioxyde de carbone à 5% pendant environ 24 heures.Après ce temps d’incubation, la majorité des cellules souches mésenchymateuses adhéreront à la paroi de la boîte de culture et se développeront lentement, tandis que la plupart des cellules monocytaires-macrophages de la moelle osseuse seront toujours en suspension dans le milieu de culture. Transférer la suspension cellulaire dans la boîte de culture de 100 millimètres dans une nouvelle fiole carrée de 25 centimètres et continuer à cultiver les cellules à 37 degrés Celsius dans 5% de dioxyde de carbone pendant 24 heures supplémentaires. Après avoir retiré soigneusement l’ancien milieu, remplacez-le par un milieu frais après que les cellules monocytes-macrophages de la moelle osseuse ont adhéré à la paroi de la fiole.La cytométrie en flux a montré que le pourcentage de cellules exprimant CD11b et c, un marqueur moléculaire à la surface des cellules de la lignée monocyte-macrophage, était d’environ 37,94% Avec la prolifération cellulaire continue, la majorité des cellules sont devenues plus grandes dans une forme irrégulière et se sont développées en un disque adhérent radial. Les résultats de la coloration TRAP ont montré que par rapport au groupe témoin, le nombre de granules rouge violet intracellulaires était significativement augmenté dans les cellules induites par l’activateur du récepteur du ligand kappa B du facteur nucléaire et du facteur stimulant les colonies de macrophages. L’analyse par transfert western a démontré que les niveaux d’expression des protéines spécifiques des ostéoclastes TRAP et de la cathepsine K étaient significativement augmentés dans les cellules traitées par rapport au groupe témoin.La chose la plus importante dans cette procédure est le temps de collecter les cellules adhérentes secondaires dans 24 à 48 heures de culture primaire, les cellules monocytes-macrophages de la moelle osseuse commencent à adhérer complètement. Les cellules monocytaires-macrophages de la moelle osseuse isolées par cette méthode peuvent être induites en ostéoclastes in vitro, fournissant un modèle cellulaire stable pour l’étude de l’ostéoporose.

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Une nouvelle méthode pour obtenir des macrophages de culture primaire de cellules de foie de rat est décrit. Cette méthode utilise la prolifération des macrophages dans la culture, suivie par la secousse de flacons de culture et de la purification par l'attachement sélectif plats en plastique. Cette technique fournit efficacement des macrophages du foie, sans équipement complexe et des compétences.

Une méthode simple et efficace pour isoler les macrophages de mixte cultures primaires de cellules hépatiques adultes

Nous présentons un protocole simple et efficace pour la production de macrophages humains. Les couches leucocytaires sont traitées en double centrifugation en gradient de densité et les monocytes isolés sont ensuite différenciées en macrophages en culture cellulaire sacs de téflon. Ceci maximise les rendements des macrophages et facilite la récolte de cellules pour des expériences ultérieures.

Isolement des monocytes humains par double centrifugation en gradient et leur différenciation en macrophages en téflon de culture cellulaire Sacs

Nous présentons ici un protocole qui génère de grandes quantités de monocytes murins à partir de moelle osseuse hétérogène pour des applications translationnelles. Par rapport à d’autres, cette nouvelle méthode permet de réduire le nombre d’animaux sacrifiés et de réduire les coûts en évitant des méthodes coûteuses telles que la séparation magnétique de cellules à gradient élevé (MACS).

Isolement et injection intraveineuse de moelle osseuse de souris dérivées monocytes

Ce protocole décrit une technique d'isolation pour obtenir des cellules mésenchymateuses du stroma de séjour du poumon primaires de rats, par l'utilisation d'une digestion enzymatique, séparation par gradient de densité, l'adhérence plastique et CD146 + sélection de billes magnétiques.

Isolement de CD146<sup&gt; +</sup&gt; Cellules Resident pulmonaire mésenchymateuses stromales de Rat Poumons

Les ostéoclastes sont des polycaryons macrophages spécifiques aux tissus dérivés de la lignée monocyte-macrophages des cellules souches hématopoïétiques. Ce protocole décrit comment isoler les cellules de la moelle osseuse afin que de grandes quantités d’ostéoclastes soient obtenues tout en réduisant le risque d’accidents que l’on retrouve dans les méthodes traditionnelles.

Isolement, purification et différenciation des précurseurs d’Ostéoclast de la moelle osseuse de rat

Cet article présente une méthode qui combine l’adhérence entière de moelle et le tri cytometry d’écoulement pour isoler, cultiver, trier, et identifier des cellules souches mésenchymateuses de moelle des mâchoires de rat.

Isolement et culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse mandibulaire chez le rat

Présenté ici est un protocole pour l’appending peptide CD47 (pepCD47) aux endonts métalliques utilisant la chimie de polybisphosphonate. La fonctionnalisation des enprothents métalliques à l’aide de pepCD47 empêche l’attachement et l’activation des cellules inflammatoires améliorant ainsi leur biocompatibilité.

Atténuation de l’attachement cellulaire transmissible par le sang aux implants métalliques grâce à l’immobilisation du peptide dérivé du CD47

Le présent protocole décrit l’isolement et la culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris.

Isolement et culture de macrophages dérivés de la moelle osseuse de souris

Cette recherche décrit deux techniques pour isoler les pièges extracellulaires neutrophiles abondants (TNE) de la moelle osseuse du rat. Une méthode combine un kit d’isolement des neutrophiles commercial avec une centrifugation à gradient de densité, tandis que l’autre utilise uniquement la centrifugation à gradient de densité. Les deux approches produisent des TNE fonctionnelles surpassant celles des neutrophiles du sang périphérique.

Approche unique pour isoler les neutrophiles de la moelle osseuse du rat avec une capacité comparable

Ce protocole décrit une méthode non enzymatique et simple pour isoler des cellules de moelle osseuse de souris néonatales âgées de 7 à 9 jours et générer des macrophages différenciés en utilisant un surnageant de cellules L929 comme source de facteur de stimulation des colonies de granulocytes (M-CSF). Les macrophages dérivés de la moelle osseuse ont été analysés plus en détail pour les antigènes de surface F4/80, CD206, CD11b et la compétence fonctionnelle.

Isolement de moelle osseuse de souris néonatale et préparation de macrophages dérivés de la moelle osseuse

Les cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse de la mâchoire ont des fonctions importantes dans la différenciation, l’auto-renouvellement et la modulation immunitaire. Ils sont devenus un réservoir crucial de cellules précurseurs en thérapie génique, en ingénierie tissulaire et en médecine régénérative. Ici, nous présentons une méthode unique pour isoler les cellules souches mésenchymateuses de la mâchoire et de la moelle osseuse chez le rat.

Technique d’isolement et de culture de cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat

Découvrez l'isolation des cellules BMM par adhérence secondaire à partir de moelle osseuse de rat. Cette méthode simple permet d'obtenir des précurseurs d'ostéoclastes pour étudier la biologie osseuse et l'ostéoporose in vitro.

Isolement des cellules de la lignée monocyte-macrophage à partir d’os de rat par la méthode d’adhérence secondaire

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