Une injection en deux points établie de manière stable de modèle de démyélinisation focale induite par la lysophosphatidylcholine chez la souris
11 mai 2022
Le présent protocole décrit une injection en deux points de lysophosphatidylcholine via un cadre stéréotaxique pour générer un modèle de démyélinisation stable et reproductible chez la souris.
Notre modèle est très pertinent pour les maladies de démyélinisation, en particulier la sclérose en plaques. Et cela peut contribuer à l’avancement de la recherche cliniquement pertinente connexe. C’est un protocole détaillé qui pourrait directement causer une démyélinisation sévère rapidement et de manière stable chez la souris par intervention chirurgicale.
Lorsque vous essayez cette technique pour la première fois, soyez patient et assurez-vous que les coordonnées sont précises. Commencez par connecter une aiguille de calibre 32 à une seringue de 5 microlitres. Retirer 5 microlitres de solution LPC pour la préparation de l’injection.
Ensuite, confirmez la profondeur de l’anesthésie de la souris par l’absence de réflexe de pincement des orteils pendant que la respiration est douce. Placez la souris dans le cadre stéréotaxique avec la face dorsale vers le haut et fixez la tête avec un cône nasal et une pince dentaire. Fixez la souris à l’appareil stéréotaxique avec des barres d’oreille bilatérales.
Assurez-vous que les barres d’oreille sont de niveau et que la tête est horizontale et stable. Désinfectez la peau de la tête en essuyant avec de l’iodophor. Ensuite, utilisez un scalpel pour couper une petite incision à environ 1,5 centimètre le long de la ligne médiane du cuir chevelu pour exposer le crâne.
Essuyez la compétence avec un coton-tige trempé dans du peroxyde d’hydrogène à 1% jusqu’à ce que le bregma, le lambda et la fontanelle postérieure soient exposés. Placez la seringue sur l’appareil stéréotaxique. Assurez-vous du positionnement horizontal de la tête de l’animal et localisez le corps calleux.
Une fois le site d’injection déterminé, notez les coordonnées et faites une marque avec un marqueur sur le crâne. Percez doucement le site marqué avec une perceuse à crâne. Prenez soin d’éviter tout saignement.
Déplacez lentement l’aiguille jusqu’aux coordonnées données. Pour induire la démyélinisation du corps calleux, injecter 2 microlitres de solution de PLC à chaque site d’injection à raison de 0,4 microlitre par minute. Après l’injection, gardez l’aiguille dans chaque site pendant 10 minutes supplémentaires.
Enfin, suturez la peau avec une suture 4-0 et attendez que l’animal se réveille dans les 10 minutes. L’image représentative montre la détection des légions de substance blanche via la coloration bleue rapide Luxol. D’après les résultats, une démyélinisation stable du corps calleux peut être observée 10 et 28 jours après l’injection.
La quantification de la zone de démyélinisation à différents moments est présentée ici. Grâce à la coloration par immunofluorescence de la protéine basique dégradée de la myéline, une augmentation remarquable du dMBP a été observée dans le groupe injecté par LPC 10 jours après l’injection, ce qui représente une perte de myéline dans le corps calleux. L’analyse par transfert Western de l’expression de la protéine basique de la myéline, ou MBP, a montré une perte significative de MBP après injection de LPC.
La bêta-actine a été utilisée comme contrôle de charge pour mesurer l’expression de base. Les images de microscopie électronique confirment l’ultrastructure myélinisée dans le corps calleux du groupe simulé et du groupe injecté par LPC. GST-pi est le marqueur de la maturation de la différenciation des cellules précurseurs d’oligodendrocytes, ou OPC.
Après 10 jours d’injection de PLC, le GST-pi a diminué par rapport au groupe fictif. Dans le même temps, la capacité de prolifération des oligodendrocytes peut être reflétée par le rapport entre la prolifération des oligodendrocytes et le nombre total de cellules de la lignée oligodendrocytes. Le rapport plus élevé représente une plus grande prolifération d’oligodendrocytes après 10 jours après l’injection.
Les images représentatives montrent le parcours de nage des souris dans chaque groupe, en présence de la plate-forme et après avoir retiré la plate-forme. Les résultats suggèrent que la mémoire spatiale des souris démyélinisées est significativement altérée dans le modèle d’injection LPC à deux points. Tout en essayant cette procédure, assurez-vous que le taux d’injection est précis et gardez l’aiguille dans chaque site pendant 10 minutes supplémentaires.
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Aperçu
Ce protocole décrit une injection en deux points de la lysophosphatidylcholine (LPC) à l’aide d’un cadre stéréotaxique afin de créer un modèle stable de démyélinisation chez la souris. Il propose une méthode pertinente pour l’étude des maladies démyélinisantes, en particulier la sclérose en plaques, permettant ainsi de mener des recherches sur les mécanismes et les conséquences de la démyélinisation.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Neurosciences
- Recherche sur la démyélinisation
- Modèles murins de maladies
Contexte
- Comprendre la démyélinisation est essentiel pour développer des traitements contre des maladies comme la sclérose en plaques.
- La procédure décrite vise à induire une démyélinisation rapide et reproductible en milieu de laboratoire.
- Une technique chirurgicale précise est importante pour la réussite de la procédure.
- Des analyses histologiques, telles que la coloration au bleu de Luxol, sont utilisées pour évaluer le modèle.
Objectif de l'étude
- Établir un modèle fiable pour l'étude des mécanismes de la démyélinisation.
- Faciliter la recherche sur des interventions thérapeutiques potentielles pour les affections liées à la démyélinisation.
- Fournir des protocoles chirurgicaux détaillés permettant d'obtenir des résultats quantifiables.
Méthodes utilisées
- Le modèle implique une approche chirurgicale stéréotaxique pour les injections de LPC.
- Des souris reçoivent une solution de LPC à des emplacements anatomiques précis, ciblant spécifiquement le corps calleux.
- Chaque injection comprend 2 microlitres de LPC administrés à un débit contrôlé.
- Des évaluations postopératoires aux jours 10 et 28 fournissent des mesures essentielles des résultats.
- Des techniques histologiques telles que l'immunofluorescence et le Western blotting sont utilisées pour analyser la perte de myéline.
Résultats principaux
- Une démyélinisation stable du corps calleux a été obtenue, observable par coloration histologique à plusieurs points temporels.
- Une augmentation des marqueurs indiquant une perte de myéline a été confirmée par diverses analyses.
- Les évaluations comportementales ont révélé des troubles significatifs de la mémoire spatiale après la démyélinisation.
- Les résultats suggèrent des modifications de la prolifération et de la différenciation des oligodendrocytes en réponse au traitement par LPC.
Conclusions
- La présente étude établit avec succès un modèle permettant d'explorer la dynamique de la démyélinisation et des stratégies thérapeutiques potentielles.
- Les résultats apportent des éclairages sur les mécanismes neuronaux sous-jacents à la démyélinisation ainsi que sur le rôle des oligodendrocytes.
- Ce modèle pourrait faire progresser la compréhension de la sclérose en plaques et des affections similaires.
Questions fréquemment posées
Pertinence sectorielle pour les cadres
Le modèle d'injection LPC à deux points de façon stable établi permet une induction rapide et reproductible d'une démyélinisation focale chez la souris, soutenant directement la recherche en phase de découverte sur les maladies démyélinisantes telles que la sclérose en plaques. Ce modèle offre une plateforme solide pour l'analyse mécanistique, la validation de cibles thérapeutiques et l'évaluation quantitative de la perte et de la réparation de la myéline. Sa reproductibilité et ses résultats quantitatifs en font un outil essentiel pour l'évaluation préclinique et le tri des portefeuilles dans les programmes de recherche sur les maladies neuroinflammatoires.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet d'étudier les mécanismes de démyélinisation et l'implication des voies dans des systèmes pertinents pour la maladie.
- Permet une validation fonctionnelle des cibles en quantifiant la perte de myéline et les réponses des oligodendrocytes.
- Facilite la confiance prédictive dans les tests d'hypothèses thérapeutiques pour les affections neuroinflammatoires.
Développement de tests et criblage
- Offre un système in vivo validé pour le criblage de composés ciblant la remyélinisation ou la neuroprotection.
- Permet une démyélinisation standardisée et reproductible, adaptée à des analyses histologiques et comportementales quantitatives.
- Permet une évaluation fiable d'interventions candidates grâce à des critères de jugement mesurables.
Recherche translationnelle et préclinique
- S'aligne sur la pathologie pertinente pour la maladie observée dans la sclérose en plaques, soutenant ainsi le développement de biomarqueurs translationnels.
- Assure la continuité depuis la découverte mécanistique jusqu'à la validation préclinique de stratégies thérapeutiques.
- Réduit le risque biologique en modélisant la démyélinisation aiguë et l'altération fonctionnelle in vivo.
Intégration du pipeline et du flux de travail
Ce modèle s'intègre à la continuité découverte-préclinique, reliant les études mécanistiques précoces à la recherche translationnelle dans les maladies démyélinisantes.
- Biologie de la découverte : Soutient la vérification d'hypothèses et la clarification des voies biologiques grâce à une analyse quantifiable de la démyélinisation et des oligodendrocytes.
- Écrans de sélection : Fournit des résultats prêts à l'analyse, reproductibles, pour l'évaluation de composés et les études de réponse dose-dépendante.
- Analytique : Permet la mesure quantitative de la perte de myéline, de l'expression protéique et des déficits comportementaux en vue d'analyses comparatives.
- Recherche translationnelle : Modélise des critères d'évaluation pertinents pour la maladie afin d'aligner les biomarqueurs et valider précliniquement.
- Réutilisation en entreprise : Offre une plateforme in vivo standardisée et réutilisable pour plusieurs programmes de recherche sur les neuroinflammations.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Accroît la confiance prédictive et réduit l'ambiguïté mécanistique dans la recherche sur la démyélinisation.
- Valeur opérationnelle : Fournit une modélisation in vivo standardisée, reproductible et évolutible utilisable entre différents programmes.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » et l'efficacité du capital en fournissant des données précliniques solides.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation et une avancée ajustées au risque des actifs thérapeutiques dans les maladies neuroinflammatoires.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en chirurgie stéréotaxique et un ciblage anatomique précis chez la souris.
- Exige un accès à une infrastructure d'analyse histologique, d'immunofluorescence et comportementale.
- Implique une standardisation inter-équipes des coordonnées d'injection et du débit pour assurer la reproductibilité.
- L'adaptation à d'autres régions du SNC ou à d'autres modèles de maladie peut nécessiter une optimisation du protocole.
- Le modèle reflète principalement une démyélinisation aiguë ; des études sur la chronicité ou la remyélinisation peuvent nécessiter une validation supplémentaire.
