Name: Édition génique CRISPR/Cas9 de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour des applications de thérapie génique (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Découvrez une méthode optimisée de culture ex vivo des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour améliorer l'engraftement des cellules éditées par CRISPR/Cas9. Ce protocole préserve la stemness et renforce l'efficacité de la thérapie génique.

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Les auteurs tiennent à remercier le personnel de l’installation de cytométrie en flux et de l’animalerie du CSCR. A. C. est financé par une bourse ICMR-SRF, K. V. K. est financé par une bourse DST-INSPIRE et P. B. est financé par une bourse CSIR-JRF. Ce travail a été financé par le Département de biotechnologie du gouvernement indien (subvention n° BT/PR26901/MED/31/377/2017 et BT/PR31616/MED/31/408/2019)

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<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
<li>Tateno, A., Sakai, K., Koya, N., Aoki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+total+asphyxia+on+the+development+of+synaptic+junctions+in+the+brains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Paediatrica+Japonica%3B+Overseas+Edition%22%5BJournal%5D)">Effects of total asphyxia on the development of synaptic junctions in the brains of mice.</a> Acta Paediatrica Japonica; Overseas Edition. 34 (1), 1-5 (1992).</li>
<li>Audigé, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+leukocyte+reconstitution+in+NSG+mice+transplanted+with+human+cord+blood+hematopoietic+stem+and+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Immunology%22%5BJournal%5D)">Long-term leukocyte reconstitution in NSG mice transplanted with human cord blood hematopoietic stem and progenitor cells.</a> BMC Immunology. 18 (1), 1-15 (2017).</li>
<li>Nimmerjahn, F., Ravetch, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fc-receptors+as+regulators+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+immunology%22%5BJournal%5D)">Fc-receptors as regulators of immunity.</a> Advances in immunology. 96, 179-204 (2007).</li>
<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

Les auteurs déclarent qu’il n’existe pas d’intérêts financiers concurrents.

Le succès de la thérapie génique HSPC repose principalement sur la qualité et la quantité de CSH greffables dans le greffon. Cependant, les propriétés fonctionnelles des CSH sont fortement affectées pendant la phase préparatoire des produits de thérapie génique, y compris par la culture in vitro et la toxicité associée à la procédure de manipulation génique. Pour surmonter ces limitations, nous avons identifié des conditions de culture HSPC idéales qui conservent la souche des CSH CD34 + CD133 + CD90 ...

L’inaccessibilité aux donneurs compatibles avec l’antigène leucocytaire humain (HLA) dans les contextes de transplantation allogénique et le développement rapide d’outils de génie génétique hautement polyvalents et sûrs font de la greffe autologue de cellules souches hématopoïétiques (GCSH) une stratégie de traitement curatif pour les maladies hématologiques héréditaires 1,2. La thérapie génique par cellules souches et progénitrices hématopoïétiques autologues (HSPC) implique la collecte des HSPC des patients, la manipulation génétique, la correction des mutations pathogènes et la transplantation de HSPC corrigés par les gènes chez le patient 3,4. Cependant, le succès de la thérapie génique repose sur la qualité du greffon génétiquement modifié transplantable. Les étapes de manipulation génique et la culture ex vivo des HSPC affectent la qualité du greffon en diminuant la fréquence des cellules souches hématopoïétiques à long terme (CSH-LT), nécessitant la perfusion de fortes doses de HSPCmanipulées par les gènes 2,5,6.
Plusieurs petites molécules, dont SR1 et UM171, sont actuellement utilisées pour étendre les HSPC dans le sang de cordon ombilical de manière robuste 7,8. Pour les HSPC adultes, en raison du rendement cellulaire plus élevé obtenu lors de la mobilisation, une expansion robuste n’est pas nécessaire. Cependant, conserver la souche des HSPC isolés en culture ex vivo est crucial pour ses applications de thérapie génique. Par conséquent, une approche axée sur l’enrichissement de la culture de cellules souches hématopoïétiques (CSH) est développée en utilisant une combinaison de petites molécules: resvératrol, UM729 et SR1 (RUS)7. Les conditions de culture HSPC optimisées favorisent l’enrichissement des CSH, ce qui entraîne une augmentation de la fréquence des CSH génétiquement modifiées in vivo, et réduit la nécessité de manipuler de grandes doses de HSPC, facilitant ainsi des approches de thérapie génique rentables8.
Ici, un protocole complet pour la culture HSPC est décrit, ainsi que la perfusion et l’analyse de cellules génétiquement modifiées in vivo.

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector&reg ; X UNITÉ</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nucleofector&trade ; X Kit ( Nucleocuvette&Trade 16 puits ; Bandelettes)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotique-Antimycosique (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>15240096</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humain CD45 APC</td><td>BD BIOSCIENCE&nbsp ;</td><td>555485&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>CD13 PE () ANTI-HUMAIN</td><td>(BD BIOSCIENCE</td><td></td> 555394 CD19 (BIOSCIENCE<td></td></tr>) <tr><td></td><td></td><td>340421 CD3</td> () () CONTRE HUMAIN (BOB) 557749 CD90 APC BD BIOSCIENCE 561971 (ANGLAIS) CD133/1 (HUMAN CD133/1)<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>Anti-humain CD34 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>Anti-souris CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>Irradator-2000</td><td>²nbsp ; BRIT (Département de biotechnologie, Inde)</td><td>BI 2000&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture cellulaire (plaques 6 puits traitées en surface delta)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>CrysoStor CS10</td><td>BioLife solutions</td><td>#07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60mg/10mL)</td><td>-&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Guide-it Recombinant Cas9</td><td>TAKARA BIO</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Tube à centrifuger-15ml</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ; Tube à centrifuger-50ml</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>339652 <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNAase</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime ; s Saline tamponnée au phosphate - 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade ; Human CD34 Positive Selection Kit II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>Aimant EasySep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Unité d’électrophorèse</td><td>ORANGE INDIA</td><td>HDS0036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> 10270106 <tr><td>Cytomètre en flux &ndash ; ARIA III</td><td>BD BIOSCIENCE-</td><td>&NBSP ;</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo&nbsp ;</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>®</td><td></td></tr>-<tr><td>FLT3-L</td><td>PEPROTECH</td><td>300-19-1000</td><td></td></tr><tr><td>Système d’imagerie sur gel</td><td>CELL BIOSCIENCES</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>HighPrep Réactif DTR</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>Humain BD Fc Block</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td>IMDM media</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>Lampe infrarouge</td><td>MURPHY-Seringue</td><td></td><td></td></tr> à <tr><td>insuline 6mm 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>Kétamine</td><td>KETMIN 50-Loading</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>colorant 6X</td><td>TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Souris Restrainer</td><td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre à nano-goutte</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage de cellules Neubauer</td><td>ROHEM INSTRUMENTS</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>NOD. cg-prkdcscid il2rgtm1Wjl/szJ (NSG)</td><td>Le laboratoire Jackson</td><td>RRID :IMSR_JAX :005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6. SCID Il2r&gamma ; &moins ;/&minus ; KitW41/W41 (NBSGW)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID :IMSR_JAX :026622</td><td></td></tr><tr><td>Nunc delta Plaque à 6 puits</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Tube à fond rond en polystyrène</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>P3 Cellule primaire Solution de nucléofection</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>Pipette Pasteur</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nettoyage PCR</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Cage à tarte pour souris</td><td>FISCHER SCIENTIFIC</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>tube à fond rond en polystyrène (12 x 75 mm)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>Institut Whitehead pour la recherche biomédicale</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract&trade ; Solution d’extraction d’ADN</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO-</td><td>&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1 STEMCELL</td><td>TECHNOLOGIES</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>Outil d’analyse ICE</td><td>SYNTHEGO</td><<td>a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA solution tampon (TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>Fourni avec gRNA&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>Xylazine</td><td>XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

Édition génique crispr/cas9 de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour des applications de thérapie génique

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR / Cas9 est un outil d’édition de gènes très polyvalent et efficace largement adopté pour corriger diverses mutations génétiques. La faisabilité de la manipulation génique des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) in vitro fait des HSPC une cellule cible idéale pour la thérapie génique. Cependant, les HSPC perdent modérément leur potentiel de greffe et de repeuplement multilignée en culture ex vivo . Dans la présente étude, des conditions de culture idéales sont décrites qui améliorent la greffe de HSPC et génèrent un nombre accru de cellules génétiquement modifiées in vivo. Le rapport actuel présente des conditions de culture in vitro optimisées, y compris le type de milieu de culture, la supplémentation unique en cocktail de petites molécules, la concentration de cytokines, les plaques de culture cellulaire et la densité de culture. En plus de cela, une procédure optimisée d’édition de gènes HSPC, ainsi que la validation des événements d’édition de gènes, sont fournies. Pour la validation in vivo , la perfusion de HSPC génétiquement modifiée et l’analyse post-greffe chez des souris receveuses sont affichées. Les résultats ont démontré que le système de culture augmentait la fréquence des CSH fonctionnelles in vitro, ce qui entraînait une greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.

La présente étude identifie les conditions idéales de culture HSPC qui facilitent la rétention des CSH CD34+CD133+CD90+ en culture ex vivo. Pour démontrer l’enrichissement en culture des CSH ainsi que la génération améliorée de CSH génétiquement modifiées, les procédures optimisées pour l’isolement des CSNP, la purification des cellules CD34+, la culture, l’édition de gènes, la transplantation, la caractérisation de la greffe et les cellules génétiquement modifiées <em...

Le présent protocole décrit une procédure optimisée de culture de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) pour la greffe robuste de cellules génétiquement modifiées in vivo.

Édition génique CRISPR/Cas9 de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour des applications de thérapie génique

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

La culture ex vivo peut entraver le potentiel de repopulation des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques. Notre protocole préserve la souche pendant la culture et améliore ainsi la fréquence des cellules génétiquement modifiées in vivo. La thérapie génique par cellules souches hématopoïétiques est actuellement utilisée pour les maladies monogéniques et les maladies infectieuses comme le VIH.Le protocole de thérapie génique HSPC repose fortement sur la culture ex vivo. Notre protocole doit être compatible avec toute procédure utilisant une culture ex vivo. Vigneshwaran Venkatesan, doctorant de mon laboratoire, fera la démonstration de ce protocole.Après avoir isolé les HSPC, les cultiver dans des milieux de culture de cellules souches contenant des cytokines et de petites molécules Resvératrol, UM729 et StemRegenin1. Avant l’édition génétique, réglez le ThermoMixer à 37 degrés Celsius pour reconstituer l’ARN guide, puis préchauffez le tampon TE à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Centrifuger le flacon d’ARNg synthétique chimiquement modifié à 11 000 fois g pendant 1 minute à 4 degrés Celsius et ajouter 15 microlitres de tampon TE au flacon contenant 1,5 nanomolaire d’ARNg lyophilisé et mélanger par agitation douce pour obtenir une concentration finale de 100 picomolar par microlitre.Incuber le flacon dans le ThermoMixer avec une agitation minimale à 37 degrés Celsius pendant 30 à 40 secondes. Tapotez doucement le flacon sur les côtés et faites tourner le flacon pour recueillir 15 microlitres d’ARNg. Faites des aliquotes de 1 microlitre et conservez-les à moins 80 degrés Celsius pendant 1 an.Pour la nucléofection, pelleter 2 fois 10 à la 5ème cellule par centrifugation à 200 fois g pendant 5 minutes à température ambiante. Une fois le surnageant jeté, remettre la pastille en suspension dans 20 microlitres du tampon. Mélangez délicatement la suspension cellulaire avec le complexe RNP préparé en évitant les bulles d’air.Maintenant, transférez la suspension sur la bande de nucléofection commerciale et électroporez les cellules à l’aide du 4D-Nucleofector en sélectionnant le code d’impulsion DZ-100. Aux cellules électroporées de la bande de nucléofection, ajouter 100 microlitres de milieux de culture pré-incubés et laisser les cellules intactes pendant 10 minutes à température ambiante. À la fin de l’incubation, transférer le contenu sur la plaque de culture selon les exigences expérimentales.Placez les souris NSG dans les cages à tarte 6 à 8 heures avant la transplantation HSPC. Irradier les souris à 3,5 gray à l’aide d’un irradiateur disponible dans le commerce. Pour les NBSGW, préconditionner les souris mâles et femelles âgées de 6 à 8 semaines par injection intrapéritonéale de busulfan à une dose de 12,5 milligrammes par kilogramme de poids corporel 48 heures avant la transplantation HSPC.Pour infuser 1 souris, granuler 6 fois 10 à la 5ème cellule dans un tube de 1,5 millilitre par centrifugation à 200 fois g pendant 5 minutes. à température ambiante. Extraire doucement le surnageant sans déranger la pastille et remettre en suspension la pastille de cellule dans 100 microlitres de PBS.Placez les souris NSG ou NBSGW préconditionnées dans le dispositif de retenue de la souris et perfez les HSPC par injection veineuse de la queue. Tenez la queue de la souris et poussez doucement la fiche pour retenir la souris. Essuyez délicatement la queue de la souris avec de l’éthanol à 70%.À l’aide d’une seringue à insuline de calibre 31, aspirez 100 microlitres de la suspension cellulaire. Maintenant, dirigez la lumière de la lampe infrarouge sur la queue pendant 30 à 40 secondes, couvrant la zone du corps de la souris avec des plis de papier de soie. Pour maintenir la queue dans l’axe de rabotage avec la seringue, soulevez-la avec l’index gauche.Insérez doucement la partie biseautée de l’aiguille dans la veine caudale gauche ou droite à un angle de 20 degrés. Poussez le piston pour infuser la suspension cellulaire dans la veine et appliquez une légère pression près de la région percée avec du papier de soie et retirez l’aiguille. Après l’anesthésie, placez l’animal en position couchée ventrale et frottez doucement les souris pour ouvrir l’œil, permettant au globe oculaire de dépasser légèrement.Insérez délicatement la pipette de pâturage à un angle de 30 à 45 degrés dans le canthus médian de l’œil sous la membrane nictante. Après avoir placé la pipette Pasteur dans la bonne position, appliquez une légère pression sur le tube et commencez à le faire tourner doucement. Après avoir recueilli 50 à 80 microlitres de sang périphérique, retirez doucement la pipette du canthus médial de l’œil.Après l’euthanasie, faites une incision verticale de 1 centimètre au-dessus de l’urètre et étendez-vous jusqu’à 1 centimètre au-dessous du diaphragme. Couper horizontalement aux coins de la zone incisée pour ouvrir la région abdominale. Après avoir disséqué le fémur et le tibia, utilisez des ciseaux pour enlever les tissus mous attachés au fémur et au tibia et frottez doucement les os avec un papier de soie.Utilisez un scalpel pour faire un petit trou d’un diamètre ne dépassant pas 0,2 centimètre au fond d’un tube microcentrifuge de 0,5 millilitre. Retirez les extrémités proximales des os à l’aide d’un scalpel et placez les os avec le côté coupé vers le trou du tube de microcentrifugation de 0,5 millilitre. Maintenant, placez le tube de 0,5 millilitre avec les os dans le tube de 1,5 millilitre contenant 100 microlitres de PBS stérile.Fermez le couvercle, faites tourner les tubes à 200 fois g pendant 3 minutes dans des conditions stériles à température ambiante et jetez les tubes de 0,5 millilitre contenant des os avec une cavité moelle vide. Au tube de réaction de 1,5 millilitre contenant de la moelle osseuse, ajouter 1 millilitre de PBS, puis à l’aide d’une pipette de 1 millilitre, remettre doucement les cellules en suspension 10 fois. Transférer 1 millilitre de la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres contenant 9 millilitres de tampon de lyse des globules rouges.Incuber les cellules dans de la glace pendant 7 minutes en retournant doucement le tube toutes les deux minutes. Après l’incubation, centrifuger le tube à 200 fois g pendant 5 minutes à température ambiante et répéter le lavage jusqu’à ce qu’on observe une pastille blanche pâle claire. La fréquence des cellules vivantes et des cellules CD34-positives, CD90-positives a augmenté dans le groupe RUS après 48 heures de nucléofection.Après 72 heures, le pourcentage et la fréquence de l’indel ont augmenté dans le groupe traité par RUS par rapport au groupe traité par DMSO, ce qui suggère une augmentation de l’édition de gènes. Le nombre absolu de cellules CD34 positives, CD90 positives et de cellules nucléées totales est significativement plus élevé 48 heures après l’édition. L’analyse par cytométrie en flux de cellules CD45 positives humaines chez les souris NSG a montré une augmentation de la greffe dans les conditions de culture.L’analyse de la fréquence d’édition de gènes dans les cellules BM de souris a montré une augmentation de la greffe de HSPC génétiquement modifiés dans des conditions de culture supplémentées en RUS. La culture des HSPC à une confluence de 200 000 cellules par mL est cruciale pour améliorer les cellules souches fonctionnelles. L’amplification des cellules souches du sang de cordon ombilical et des cellules souches dérivées de l’iSPC sont les nouveaux domaines dans lesquels ce protocole est testé.

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Cette vidéo présente un test permettant d’effectuer l’édition de gènes dans des cellules T humaines à l’aide de la technologie CRISPR-Cas9. Un mélange de lymphocytes T CD4+ et CD8+ primaires est associé à un complexe ribonucléoprotéique CRISPR-Cas9, ciblant des gènes spécifiques pour l’inactivation. Lors de l’électroporation, l’ARNsg guide Cas9 vers la séquence d’ADN cible, créant ainsi des coupes précises. Ces coupures sont ensuite réparées par le mécanisme d'assemblage non homologue de la...

Une technique CRISPR-Cas9 pour l’édition de gènes dans les lymphocytes T

Gène ciblé d’édition à l’aide de CRISPR/Cas9 a grandement facilité la compréhension des fonctions biologiques des gènes. Ici, nous utilisons la méthodologie CRISPR/Cas9 à des mutations de la calréticuline modèle de cytokine-dépendante des cellules hématopoïétiques afin d’étudier leur activité oncogénique.

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Édition génique CRISPR/Cas9 de cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pour des applications de thérapie génique

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