Acquisition et perfusion-décellularisation de lambeaux vascularisés porcins dans un bioréacteur de perfusion personnalisé

Cette méthode décrit l’obtention chirurgicale de trois lambeaux porcins vascularisés et leur décellularisation subséquente par perfusion. Cette méthode peut aider les efforts de régénération des lambeaux porcins en utilisant une approche de décellularisation et de recellularisation des tissus. Le principal avantage de cette technique est sa polyvalence pour réaliser la décellularisation de la profusion à travers une variété de lambeaux porcins vascularisés dans une configuration de bioréacteur simple à assembler.

La technique décrite ici peut être largement appliquée à d’autres lambeaux vascularisés en tant que solution potentielle d’ingénierie tissulaire utilisant des lambeaux porcins en chirurgie reconstructive. Pour commencer, fabriquez un tube d’entrée et de sortie en mesurant environ 50 centimètres de tube en silicone revêtu de platine LS16. Connectez une extrémité à un tube de pompe jaune à 3 arrêts et l’autre à une pipette sérologique stérile de 2 millilitres pour transporter le perfusat des réservoirs de détergent dans la chambre du bioréacteur.

Autoclaver la chambre et les tubes dans un emballage stérile emballé individuellement. Pour l’obtention du lambeau omental, placez un porc Yorkshire anesthésié âgé de 12 semaines en décubitus dorsal, puis préparez l’abdomen de la manière stérile habituelle. Effectuer une laparotomie xipho-ombilicale pour entrer dans l’abdomen et mobiliser la céphalade de l’estomac, et placer l’épiploon dans le champ opératoire.

En commençant par l’aspect gauche de la plus grande courbure, où l’artère gastroépiploïque gauche rejoint l’artère splénique, squelettiser l’artère gastroépiploïque gauche et la veine à l’aide de ciseaux de ténotomie Stevens droits. Ensuite, ligaturez et divisez les deux séparément à l’aide de liens chirurgicaux ou de clips. Procédez le long de la plus grande courbure de l’estomac de gauche à droite pour ligaturer et diviser les branches vasculaires courtes provenant de l’épiploon, fournissant la plus grande courbure de l’estomac.

Poursuivre la mobilisation du grand épiploon jusqu’à ce que la jonction des vaisseaux gastroépiploïques droits et de l’artère gastroduodénale soit rencontrée. Ensuite, ligaturez et divisez l’artère gastro-épiploïque droite et la veine pour libérer le lambeau omental et permettre la canulation du lambeau plus tard. Pour l’obtention du volet tenseur fascia lata, placer le porc en position de décubitus latéral.

Marquez la limite du lambeau intérieur de l’épine iliaque antérieure supérieure, ou ASIS, vers la rotule latérale, et une limite postérieure d’environ 8 à 10 centimètres caudale. Utilisez un scalpel pour faire une incision nette à la marge distale à la rotule. Approfondissez l’incision à travers les tissus sous-cutanés pour atteindre le fascia recouvrant le droit fémoris, et continuez les incisions vers le SIAS le long des limites marquées.

Pour isoler le lambeau fascial seul, retirez le composant cutané sus-jacent de la couche de fascia sous-jacente. Ensuite, ligaturer ou cautériser les petits vaisseaux perforateurs à la peau. Revenez au bord distal du volet et incisez le fascia profond.

Mobiliser le fascia du muscle vastus lateral sous-jacent vers l’ASIS. Après avoir tracé le pédicule vers les vaisseaux fémoraux profonds, squelettiser l’artère fémorale circonflexe latérale et la veine alimentant le volet fascial. Ensuite, ligaturer et diviser les vaisseaux du volet à proximité, où ils rejoignent les vaisseaux fémoraux profonds et permettent une canulation ultérieure.

Pour l’obtention d’un rabat radial d’avant-bras, marquez un carré de 3 centimètres sur 3 sur la face radiale d’un avant-bras de porc étendu. Tracez une ligne entre le point médian de la marge du lambeau proximal et la fosse antécubitale pour indiquer l’évolution approximative du pédicule de l’artère radiale. Confirmez le parcours artériel avec palpation.

Ensuite, incisez la peau à l’aide d’un scalpel à l’aspect distal avec une profondeur jusqu’au fascia antébrachial. Disséquer contondant avec des ciseaux de ténotomie jusqu’à ce que l’artère radiale distale et sa veine comitante soient rencontrées. Ensuite, ligaturez et divisez l’artère et les veines avec des attaches chirurgicales ou des clips.

Continuez les incisions cutanées sur les marges radiales et ulnaires du carré cutané marqué. Ensuite, mobilisez le lambeau de l’os radial sous-jacent avec une lame chirurgicale ou cautérisation, en allant d’une direction cubitale à une direction radiale tout en soulevant le lambeau cutané proximale vers la fosse antécubitale. À l’aide de ciseaux de ténotomie, squelettiser l’artère radiale et la veine comitantes proximale à proximité de la fosse antécubitale, où elles rejoignent respectivement l’artère brachiale et les veines.

Disséquer les vaisseaux des tissus fibro-adipeux environnants pour isoler le pédicule vasculaire. Ensuite, ligaturez et divisez l’artère et la veine séparément pour libérer le lambeau radial de l’avant-bras. Ensuite, canulez les vaisseaux du pédicule avec un angiocathéter de calibre 20 à 24 fixé avec des attaches en soie 3-0.

Rincer la solution saline héparinée dans la canule artérielle du volet jusqu’à ce qu’un écoulement veineux clair soit observé. Lorsque vous travaillez dans une armoire de biosécurité à flux laminaire, placez les volets dans la chambre à tissu du bioréacteur. Tube d’entrée de bœuf avec solution saline héparinée stérile pour éliminer l’air résiduel et disposer les volets pour permettre la connexion entre la canule artérielle à volet et le connecteur Luer mâle.

Utilisez ensuite des hémostatiques stériles pour visser la canule artérielle sur le connecteur. Rincez ensuite la solution saline héparinée à travers le robinet d’arrêt pour vérifier que la connexion luer est exempte de fuites et que les flops peuvent être perfusés avec des signes d’écoulement veineux. Après avoir fermé le couvercle de la chambre de tissu, connectez le tube d’entrée avec un tube de pompe jaune à 3 arrêts au robinet d’arrêt d’entrée de la chambre à tissu.

Fixez également un transducteur de capteur de pression en ligne au robinet d’arrêt 3 voies d’entrée pour la surveillance de la pression de perfusion. Ensuite, allumez la pompe péristaltique d’entrée et sur l’écran initial, passez à la troisième languette à l’aide de la flèche pour régler l’ID du tube sur 1,85 millimètre. Définissez ensuite le taux de perfusion à partir du deuxième onglet.

Le débit d’entrée comme mode de livraison est réglé sur 2 millilitres par minute. Assurez-vous que la direction du flux est correcte telle qu’elle est affichée à l’écran. Chargez le tube de pompe à 3 arrêts sur la pompe péristaltique avec une cassette compatible.

Réglez le réglage de la pompe de sortie à un débit de 4 millilitres par minute. Connectez le tube de sortie avec un tube de pompe jaune à 3 arrêts au robinet d’arrêt de sortie de la chambre à tissu. Ensuite, chargez le tube de pompe à 3 arrêts sur la pompe péristaltique et démarrez le débit des deux pompes en appuyant sur le bouton d’alimentation de chaque pompe.

Commencer la décellularisation par perfusion des lambeaux avec une solution saline héparinée dans la chambre tissulaire pendant 15 minutes pour éliminer les caillots sanguins retenus. Une fois terminé, remplacez la solution saline résiduelle par 500 millilitres de solution de décellularisation de dodécylsulfate de sodium, ou SDS, pour immerger le volet. Ensuite, transférez le tube d’entrée dans la solution SDS et abondez le tissu.

Après la décellularisation de la FDS, aspirer la FDS restante avant de faire passer le lambeau avec du PBS pendant une journée. Après la décellularisation de la perfusion SDS, perfuser séquentiellement les volets dans la solution d’ADN pendant deux heures, puis dans le PBS pendant une journée, puis transférer le tube d’entrée dans de l’acide peracétique et de l’éthanol dans de l’eau distillée pour stériliser les lambeaux en perfusant pendant trois heures. Une fois cela fait, retirez les lambeaux de manière aseptique et plongez-les dans deux lavages de PBS contenant 1% d’antibiotiques antimycotiques pendant 15 minutes chacun.

Conservez les lambeaux à 4 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient prêts pour la recellularisation. Utilisez un outil de biopsie à l’emporte-pièce de 3 à 10 millimètres pour obtenir des échantillons de tissus pour l’évaluation des lambeaux décellularisés. Les lambeaux décellularisés isolés rincés sous contrôle manuel ont mis en évidence des signes d’écoulement de la canule veineuse à drainage libre de l’épiploon, du fascia lata tenseur et du lambeau radial de l’avant-bras.

La morphologie grossière de l’épiploon natif, du fascia lata tenseur et des lambeaux radiaux de l’avant-bras est apparue de couleur rose immédiatement après l’obtention. En comparaison, les tissus décellularisés étaient d’apparence blanche ou opaque. L’examen histologique des tissus natifs avec de l’hématoxyline et de l’éosine a montré la présence de noyaux bleus.

Dans les lambeaux décellularisés, la coloration histologique a révélé une perte de matériel cellulaire sans coloration nucléaire bleue, indiquant un échafaudage de tissu acellulaire. Une quantification supplémentaire du contenu de l’ADN a montré une diminution significative de l’ADN dans les échafaudages acellulaires par rapport aux tissus natifs. La considération la plus importante est une technique chirurgicale utilisée lors de l’approvisionnement, en prenant soin d’éviter d’endommager le pédicule du lambeau afin de permettre une décellularisation ultérieure de la perfusion.

Après la décellularisation de la perfusion, les lambeaux résultants peuvent être recellularisés avec des populations cellulaires spécifiques aux tissus afin de régénérer les compartiments tissulaires natifs.